Summary
이 원고는 정상 마우스에서 리본 시냅스의 형태학적 특성 및 기능 상태를 평가하기 위한 실험 프로토콜을 설명합니다. 본 모델은 또한 소음 유발 및 노화 관련 달팽이관 시냅토병 제한 모델에 적합합니다. 이전 마우스 연구의 상관 결과 또한 논의.
Abstract
달팽이관 내부 모발 세포 (IHCs)는 리본 시냅스를 통해 나선형 신경절 뉴런 (SGNs)에 음향 신호를 전송합니다. 몇몇 실험적인 연구 결과는 모발 세포 시냅스가 감각신경성 난청 (SNHL)에 있는 초기 표적이 될 수 있다는 것을 표시했습니다. 이러한 연구는 IHCs와 SGNs 사이의 비정상적인 시냅스 전송을 초래하는 리본 시냅스 수, 구조 또는 기능의 변경을 의미하는 달팽이관 "시냅토 병증"의 개념을 제안했습니다. 달팽이관 시냅토병증은 돌이킬 수 없지만 청력 임계값에는 영향을 미치지 않습니다. 소음 유발 실험 모델에서 일부 주파수 영역에서 IHC 시냅스의 제한된 손상은 시냅스병을 유발하는 환경 적 요인과 이 내이를 방해하는 생리적 결과를 식별하기 위해 사용됩니다. 회로. 여기에서, 우리는 성인 마우스에 있는 특정 주파수 지구에 달팽이관 시냅스 형태 및 기능을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 특정 주파수 영역의 달팽이관 현지화가 코클리오그램 데이터와 함께 장소 주파수 맵을 사용하여 수행되며, 그 다음에는 리본 시냅스의 형태학적 특성이 시냅스를 통해 평가됩니다. 면역 염색. 리본 시냅스의 기능 상태는 청각 뇌간 반응(ABR) 파I의 진폭에 기초하여 결정된다. 본 보고서는 이 접근이 새로운 치료 내정간섭의 발달에서 도울 수 있는 달팽이관에 있는 시냅스 역기능의 병인 그리고 기계장치의 우리의 이해를 심화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.
Introduction
약 20\u201220,000 Hz의 범위의 주파수는 인간에 의해 청각 자극으로 인식 될 수있다. 인간의 청력은 일반적으로 1,000 Hz 근처에서 가장 민감하며, 젊은 성인의 평균 음압 수준은 20 μPa입니다 (즉, 음압 레벨의 0 데시벨 [dB SPL]). 일부 병리학 적 조건에서 청력 상실은 특정 주파수로 제한됩니다. 예를 들어, 소음 유발 난청(NIHL)의 초기 단계에서, 4 kHz 1에서 청력도에서 "노치"(즉, 청력임계값 고도)를 관찰할 수 있다. 포유류 달팽이관 파티션을 따라 강성과 대량의 그라데이션은 달팽이관의 기지에서 고주파 사운드 감지와 정점 2의 저주파 감지와 함께지수 주파수 맵을 생성합니다. 실제로, 바실라 멤브레인을 따라 달팽이관 장소 주파수지도가 있다, 토노토피 조직으로 알려진 선도2,3. 바실라 멤브레인에 주어진 각 장소는 일반적으로 특성 주파수3,4라고불리는 하나의 특정 사운드 주파수에 대한 가장 높은 감도를 가지며, 다른 주파수에 대한 반응도 관찰할 수 있습니다.
현재까지, 다양한 마우스 모델은 청각 시스템에서 정상적인 기능, 병리학 적 과정 및 치료 효능을 조사하기 위해 사용되었습니다. 마우스 달팽이관에 있는 생리적 매개변수의 정확한 지식은 청력 감소의 그 같은 연구 결과를 위한 전제조건입니다. 마우스 달팽이관은 해부학적으로 상체, 중간 및 기저 회전으로 나누어져 있으며, 이는 다른 주파수 영역에 해당합니다. 달팽이관 핵에서 청각 신경 구심을 라벨링하여 달팽이관에서 이들의 상응하는 말초 내분 부위를 분석함으로써, 뮐러 외는 생체 내에서 정상 마우스에서 달팽이관 장소-주파수맵을 확립하는 데 성공했다 5. 7.2-61.8 kHz의 간격으로, 이는 바실라 멤브레인의 전체 길이의 90%와 10% 사이의 위치에 대응하는, 마우스 달팽이관 장소 주파수 맵은 간단한 선형 회귀 함수에 의해 설명될 수 있으며, 이는 달팽이관 베이스와 특성 주파수 5의 로거심에서 정규화된 거리. 실험실 마우스에서, 장소 주파수 지도는 바실라 막을 따라 상대적인 지역에서 누락된 모발 세포의 수를 보여주는 특정 주파수 범위 내의 청력 임계값과 코클레오그램 사이의 관계를 탐구하는데 사용될 수있다6. 중요한 것은, 장소 주파수 맵은 말초 청각 외상이 있는 마우스의 특정 달팽이관 주파수 위치에서 모발 세포의 리본 시냅스 손상과 같은 최소한의 구조적 손상에 대한 조사를 위한 포지셔닝 시스템을 제공한다7 ,8.
포유류 달팽이관에서, 리본 시냅스는 시냅스 전 리본, IHC 내에서 글루타민산염을 포함하는 방출 준비 시냅스 소포의 후광을 묶는 전자 조밀한 돌기, 및 SGN의 신경 말단에 의한 심호흡 밀도로 구성됩니다. 글루타민산염 수용체9. 달팽이관 소리 변환 도중, 모발 세포 번들의 편향은 IHC 탈분극을 초래하고, 이는 IcHC에서 후성 구심성 단말으로 글루타메이트 방출로 이끌어 내고, 따라서 청각 통로를 활성화합니다. 이 통로의 활성화는 SGN10에서속도 코드로 소리 유도 된 기계적 신호의 변환으로 이어집니다. 실제로 IHC 리본 시냅스는 시간적 정밀도가 높은 수백 헤르츠의 속도로 헤아릴 수 없는 사운드 전송에 매우 특화되어 있으며, 사운드 인코딩의 시냅스 전 메커니즘에 매우 중요합니다. 이전 연구는 리본 시냅스가 성인 마우스 달팽이관11,12의다른 주파수 영역에서 크기와 숫자가 크게 다르다는 것을 밝혔으며, 특정 사운드 코딩에 대한 구조적 적응을 반영할 가능성이 있음은 생존이 필요합니다. 최근 실험 동물 연구에 따르면 인공와우 시냅토병증은 소음 유발 난청, 노화 관련 청력 상실 및 유전성 난청을포함한 여러 형태의 청각 장애에 기여하는 것으로 13, 14.따라서, 특정 주파수 지역에서 시냅스 수, 구조 및 기능의 상관 변화를 식별하는 방법은 점점 청각 발달 및 내이 질환의 연구에 사용되고있다, 통해 생성 된 모델을 사용하여 유전 적 또는 환경 변수의 실험 조작15,16,17.
현재 보고서에서, 우리는 성인 마우스에서 바실라 막의 특정 주파수 영역에서 시냅스 수, 구조 및 기능을 분석하기 위한 프로토콜을 제시한다. 달팽이관 주파수 현지화는 코클리오그램과 함께 주어진 장소 주파수 맵을 사용하여 수행됩니다. 달팽이관 리본 시냅스의 일반적인 형태학적 특성은 시냅스 전 및 후진성 면역 염색을 통해 평가됩니다. 달팽이관 리본 시냅스의 기능 상태는 ABR 파 I의 상한임계값진폭에 기초하여 결정된다. 사소한 변경으로, 이 프로토콜은 쥐, 기니 피그 및 gerbils를 포함하여 그밖 동물 모형에 있는 생리적 또는 병리학적인 조건을 검토하기 위하여 이용될 수 있습니다.
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Protocol
모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 NRC / ILAR 가이드 (8 판)에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 자본 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다, 베이징, 중국.
1. 동물 선택
- 모든 실험에서 성인 C57BL/6J 수컷 마우스(8주 령)를 동물 모델로 사용하십시오.
참고: C57BL/6J 마우스는 Cdh23 전시의 스플라이스 변이체를 운반하는 청각 시스템에서 가속된 노화를 나타내며, 달팽이관의 기저 회전시 리본 시냅스의 40% 손실과 6개월의 중간 회전에서 10%의 손실로 반영되고, 그 다음에 는 급속한 감소가 뒤따랐습니다. 18세,19세의 전체 달팽이관에서이 손실의 증가 . 따라서, 우리는 청각 연구에 대 한 6 개월 이상 오래 된 C57BL/6J 마우스를 사용 하는 경우 주의 하는 것이 좋습니다. 마우스의 다른 균주는 특정 실험 목표에 따라 사용될 수있다. - 청력 평가 전에 외부 또는 중이 병리학을 배제하기 위해 전문 진단 포켓 이경을 사용하여 마우스를 검사합니다. 잠재적인 표시는 외부 청각 운하에 있는 액체 또는 고름, 현지 조직에 있는 빨갛게 그리고 팽윤, 및 고막 천공포함할 수 있습니다.
참고: 이것은 드물게 발생하더라도, 일단 확인된, 외부 또는 중이 질병을 가진 마우스는 제외되어야 합니다.
2. 청력 평가
- 케타민 염산염 (100 mg / kg)과 자일라진 염산염 (10 mg / kg)의 혼합물의 복강 내 주입을 사용하여 마우스를 마취. 고통스러운 자극 (예 : 발가락 꼬집반사)을 통해 마취의 깊이를 판단하십시오.
참고: 발가락 꼬집반사가 완전히 결석하면, 동물은 청각 검사를 위한 마취의 적당한 깊이에 도달했습니다. 양측 ABR 기록에 더 많은 시간이 필요한 경우, 원래 마취면을 복원하기 위해 마취제의 낮은 복용량 (원래 복용량의 5 분의 1)을 투여하십시오. 마취 과다 복용을 피하기 위해주의, 이 쥐에 죽음으로 이어질 수 있습니다. - 마취된 동물의 체온을 37.5°C에서 유지하여 더모어굴링 가열 패드를 사용한다. 마취된 동물을 청력 검사 전반에 걸쳐 간섭을 피하기 위해 전기 및 음향 차폐실에 놓습니다.
참고: 마취 후 저체온증으로 인한 사망을 방지하기 위해 동물이 완전히 깨어날 때까지 전체 절차 동안 생리적 온도를 유지하십시오. - 두개골의 정점에 피상 바늘 전극 (20mm, 28 G)을 놓고, 측정 된 귀 (기준 전극)의 피나 아래 의 원소 쪽 지각 영역과 경측 parotid 영역 (접지 전극)에 3mm 깊이를 배치합니다. 마우스 헤드의 피부 아래, 각각20.
- 밀폐형 스피커를 사용하여 원뿔 모양의 팁이 있는 2cm 플라스틱 튜브를 통해 음향 자극을 수행합니다. 팁을 외부 외이도21에맞춥게 합니다.
참고: 기록 및 기준 전극의 전기 임피던스가 3km(보통 1kohm) 미만인지 확인합니다. 임피던스가 높으면 전극의 삽입 부위를 변경하거나, 전극을 알코올로 청소하거나, ABR 파진폭의 변경을 피하기 위해 전극을 교체하십시오. - ABR 레코딩의 경우 톤 핍(3ms 지속 시간, 1ms 상승/하강 시간, 21.1/s, 주파수: 4-48kHz)을 생성하고 5\u201210 dB SPL 단계20에서90dB에서 10dB로 SPL을 감소시로 표시합니다. 이 단계에서 응답은 증폭(10,000배), 필터링(0.1-3 kHz), 평균(1,024개의 샘플/자극 수준)입니다.
참고: A벌은 10dB 단계에서 각 자극 수준에 대해 수집되며 임계값 근처의 추가 5dB 단계가 있습니다. - 각 주파수에서, ABR 임계값을 결정하며, 이는 최소한의 SPL을 지칭하여 육안 검사에 의해 명확하게 식별될수 있는 하나 이상의 구별가능한 파를 가진 신뢰할 수 있는 ABR 기록을 초래한다(도 1).
참고: 일반적으로 파형의 일관성을 보장하기 위해 임계값 주위의 낮은 SPL에 대한 프로세스를 반복해야 합니다. 응답 임계값은 파형이 관찰될 수 있는 가장 낮은 자극 수준이며, 5dB의 감소가 파형의 실종으로 이어질 때.
3. 달팽이관 조직 처리
- ABR 기록 후, 자궁 경부 탈구를 통해 마취 된 마우스를 안락사시키고, 그들을 참수하고, 복부 쪽에서 불라를 노출시키고, 날카로운 가위로 열어 달팽이관에 접근하십시오.
- 미세 한 집게를 사용하여 측두엽 뼈를 제거하고, 테이프 동맥을 분리하고, 타원형 창에서 테이프를 제거하고, 둥근 창 막을 파열시킵니다. 바늘 끝(13mm, 27G)을 부드럽게 회전시켜 달팽이관 의 정점에 작은 구멍을 만듭니다.
- 4°C에서 하룻밤 동안 0.1M 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)에 4% (wt/vol) 파라포름알데히드로 분리된 뼈를 고정합니다. 미세 팁 파이펫을 사용하여, 부드럽게 타원형 또는 둥근 창 (입구로) 및 정점 (출구로)에서 개구부를 응용 프로그램을 통해 주위 공간을 통해 고정을 플러시.
참고: 몇몇 단백질은 면역 표지를 위한 그들의 epitopes의 파괴를 피하기 위하여 고정의 짧은 기간을 요구합니다. 이러한 경우, 면역 성 화학에 대한 제조업체의 지침에 따라 실온 (RT)에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 뼈를 2 시간 동안 배양합니다. 고정은 또한 달팽이관피의 마우스 모형에서, 특히 나중 단계에서 비특이적인 염색 때문에 배경 잡음을 피하기 위하여 달팽이관 혈액을 제거하기 위하여 심장 관류를 통해 수행될 수 있습니다. - 0.1 M 차가운 PBS로 뼈를 5 분 동안 세 번 헹구어 잔류 파라 포름 알데히드를 제거합니다. 20 rpm에서 수평 셰이커에서 부드럽게 흔들어 서 4 시간 동안 RT또는 4 °C에서 24 시간 동안 10 % 에틸렌디아민테트라 아세트산 (EDTA)으로 뼈를 데칼합니다. EDTA는 중간에 새로 고칠 수 있습니다.
참고: Decalcification 시간은 EDTA및 사용자의 선호도의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. Decalcified 조직은 어느 정도의 인성을 유지해야하며, 이는 이후 단계에서 달팽이관 전체 마운트를 분리하는 것을 용이하게합니다. 시간뼈는 회전을 통해 10% EDTA에서 탈석될 수 있으므로 연구원들은 ABR 테스트 및 고정 실험에 따라 실험실을 떠날 수 있습니다. 탈석화 시간은 4°C에서 20~30시간 범위 내에서 유연하다. - EDTA에서 0.1 M PBS로 1개의 데칼화된 측두골을 옮김. #3 #5, dumont 집게 및 27 G 바늘을 사용하여 상피, 중간 및 기저 달팽이관 영역을 차례로 해부한 다음 스테레오 해부 현미경으로 뼈에서 달팽이관을 해부합니다 (앞에서 설명한대로22). 면도날을 사용하여 나선형 인대를 따라 일련의 작은 상처를 만들고 지막과 Reissner의 멤브레인을 제거합니다(그림2).
참고: 해부된 달팽이관이 손상되지 않는 한, 이 프로세스는 개별 운영자의 일반적인 프로토콜에 따라 수정될 수 있습니다. - 또한 전체 마운트 준비를 위한 개별 달팽이관 회전 (정점, 중간 및 후크 영역이있는 베이스)로 나선형 사지를 포함한 나머지 청각 상피를 해부하십시오.
- 가벼운 현미경의 40x 오일 목표하에서, IHCs의 스테레오실리아를 따라 조정할 수 있는 접안 렌즈에 배치된 250 μm 스케일로 바실라 멤브레인 길이를 측정합니다.
- 모든 세그먼트 길이(세그먼트당 250 μm)를 추가하여 각 달팽이관 회전의 길이를 계산하고 각 회전의 길이를 합산하여 바실러 멤브레인의 총 길이를 이에 따라 계산합니다.
- 후크 영역을 포함한 바실멤브레인의 총 길이를 달팽이관 정점으로부터의 거리에 따라 백분율로 변환합니다(0%는 달팽이관 정점, 100%를 달팽이관 염기로 의미함).
- 이 거리를 로그개믹 함수(d(%)=1 - 156.5 + 82.5 × log(f)를 사용하여 달팽이관 특성 주파수로 변환하고, 주파수의 경사가 1.25 mm/옥타브인 데, 여기서 d는 달팽이관 정점으로부터 정규화된 거리가 퍼센트인 경우, f는 kHz의 주파수), 앞에서 설명한 대로5,6. 따라서 각 달팽이관 회전에 대한 바실러 멤브레인의 상응하는 영역에서의 주파수 범위를 획득할 수 있다.
4. 면역 형광 염색
- 해부 후, 각 달팽이관을 별도의 2.5 mL 원심분리기 튜브에 놓고 인큐베이터 달팽이관을 10% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100으로 회전자 에서 RT에서 1시간 동안 회전합니다.
- 해부 현미경으로 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 각 튜브에서 위의 차단/투과 솔루션을 제거하고 로터의 4 °C에서 하룻밤 동안 5% 염소 혈청/PBS/0.1% 트리톤 X-100에서 희석된 1차 항체로 시편을 배양합니다.
참고: 달팽이관 시냅스 리본의 면역 라벨링을 위해, 시냅스 마커 마우스 항-카르복실 말단 결합 단백질 2 IgG1(CtBP2, RIBEYE 스캐폴딩 단백질의 B 도메인 에 라벨링, 1:400) 및 후세포 마커 마우스 항글루타산 수용체 2를 사용하십시오. IgG2a (GluR2, AMPA 수용체의 소단위 라벨링, 1:200)23. - 0.1 M 차가운 PBS로 5 분 동안 3 회 헹구어 잔류 원발 항체를 제거하고 5 % 염소 혈청 / PBS / 0.1 % 트리톤 X-100에서 희석 된 이차 항체로 표본을 배양하여 회전자의 어둠 속에서 2 \u20123 h에 대한 RT.
참고: 염소 항 마우스 알렉사 플루어 568(IgG1, 1:500) 및 염소 항 마우스 알렉사 플루어 488(IgG2a, 1:500)을 사용하여 적절한 이차 항체 혼합물을 준비하며, 이는 단계 4.2에서 사용되는 1차 항체에 상보적이다. 시냅스 리본의 라벨링 효율을 향상하려면 특정 이차 항체를 선택하는 것이 좋습니다. 몇몇 실험실은 GluR2 면역 표지24를증가시키기 위하여 이차 항체로 인큐베이션을 확장합니다. - 0.1 M PBS로 5분 동안 3회 헹구어 잔류 이차 항체를 제거하고 시편을 2.5 mL 원심분리기 튜브에서 0.1 M PBS를 함유한 35mm 플레이트로 옮니다.
- 4',6-디아미디노-2-페니린들올레(DAPI)를 포함하는 마운팅 매체를 슬라이드에 놓고 PBS에서 마운팅 매체로 시편을 옮니다. 슬라이드에 커버슬립의 한 쪽 가장자리를 놓고 놓아 커버슬립이 부드럽게 떨어지도록 합니다.
참고: 모발 세포가 위쪽으로 향하도록 하고 절차 중에 달팽이관 시편의 접거나 비틀림이 발생하지 않도록 하기 위해 스테레오 해부 현미경으로 달팽이관 시편을 장착합니다. - 슬라이드를 슬라이드를 밤새 4°C의 슬라이드 상자에 넣고 슬라이드를 건조시키고 레이저 공초점 현미경 으로 이미지화합니다.
5. 달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 평가
- 3개의 레이저를 이용한 공초점 현미경을 사용하는 이미지 슬라이드(405 nm UV 다이오드, 488 nm 아르곤 레이저, 561 nm 다이오드 펌핑 솔리드 스테이트(DPSS) 레이저로 DAPI(여기 스펙트럼 409-464 nm), Alexa Fluor 488(흥분 스펙트럼 496-599n9) (여기 스펙트럼 573-631 nm), 각각.
- 63x 고해상도 오일 침지 렌즈를 사용하여 각 달팽이관 회전에서 8 μm의 거리에 걸쳐 공초점 z 스택을 획득합니다.
참고: 일단 정의되면, 포토마이크로그래프를 디지털화하기 위한 모든 파라미터를 저장하고 모든 슬라이드에 균일하게 적용해야 합니다. - 시냅스 펑크 카운트의 경우 z-스택(0.3 μm 스텝 크기)을 IHC 의 전체 길이에 걸쳐 설정하여 모든 시냅스 펀타를 이미지화할 수 있도록 합니다.
- z 축 투영을 가져오고 이미지 처리 소프트웨어로 가져오기 위해 z 스택에 puncta가 포함된 이미지를 병합합니다.
-
각 IHC에 대한 시냅스 펀타 수를 계산하기 위해 특정 주파수 영역에서 각 z-stack의 시냅스 총 카운트수를 IHC 수(DAPI 핵 수동 카운트와 동일)로 나눕니다. 각 특정 주파수 영역에서, 9-11 IC를 포함하는 다른 현미경 필드의 세 가지 이미지에서 모든 시냅스 풍조를 평균.
- 자유형 선택 단추를 사용하여 각 IHC의 basolateral 영역을 포함한 관심 영역(ROI)을 간략하게 설명합니다. puncta의 자동 정량화를 위한 측정 함수와 유역 함수를 사용하여 밀접하게 인접한 지점을 구별합니다.
- 각 자동 계수 후, 수동 보정으로 육안으로 육안으로 검사를 수행하여 puncta 계수를 신뢰할 수 있도록 합니다.
참고: 실험자는 슬라이드가 달팽이관의 정점, 중간 또는 기저 회전에서 왔는지 여부에 대해 눈을 멀게 해야 합니다.
- 시냅스 구조 및 분포를 시각적으로 평가하고, 연필 도구(M)를 통해 개별IHC를 이웃으로부터 수동으로 분리하여 세포골격 구조 및 시냅스 국소화를 더 잘 시각화합니다.
- 시냅스 전 리본(CtBP2) 및 후시냅스 수용체 패치(GluR2)의 병치를 검사하려면 직사각형 선택 윤곽 도구로 리본 주위의 복셀 공간을 추출하고 개별 리본을 자르기로분리합니다. 이미지 > 이미지 크기를클릭하여 이러한 미니어처 프로젝션의 축소판 배열을 획득한 다음 쌍을 이루는 시냅스를 식별하는 데 사용할 수 있습니다(CtBP2 양성 및 GluR2 양성 puncta의 밀접하게 병치된 쌍으로 나타났다) 대 고아 리본 (포스트 나피제 글루타메이트 수용체패치 부족) (그림 3).
참고: 정상 달팽이관 시냅스는 청각 신경 말단(anti-GluR2)(anti-GluR2)에 모발 세포 내의 시냅스 전 리본(anti-CtBP2) 및 후약성 글루타메이트 수용체 패치의 결합된 면역라벨링으로 나타난다. 일부 실험실에서는 3D 모델링과 함께 공초점 프로젝션을 사용하여 시냅스 패치 크기 또는 볼륨26,27을정량화합니다. 리본 시냅스의 현저한 손실 이전에, 쌍글루타메이트 수용체 패치없이 크기 변화를 나타내는 리본은 시냅스 기능장애(27,28)를나타낼 가능성이 있다.
6. 달팽이관 리본 시냅스의 기능 평가
- 90 dB의 SPL에서 제시된 각 주파수 자극에 대한 모든 ABR 파를 수집하여 상한ABR 파I 진폭의 분석을 위해.
참고: 신경생리학적 및 형태학적 연구는 낮은 자발적 비율, 높은 임계값 섬유가 노화 및 소음 노출에 특히 취약하다는 것을 입증했다29,30. 리본 시냅스의 간단한 손실이 ABR 임계값에 영향을 미칠 수 없지만, 그것은 일반적으로 ABR 파 I 진폭에 상당한 감소를 초래, 낮은 자발적 인 속도, 높은 임계 값 섬유와 높은 자발적 비율을 포함하는 이러한 구심성 때문에, 낮은 임계값 섬유는 달팽이관 신경 섬유28,29,31의합산 된 활동에 크게 기여합니다. 90dB SPL의 상한강도가 여기에서 선택됩니다. - 오프라인 분석 프로그램을 사용하여 피크 대 피크 파 I진폭을 결정합니다(그림 4). ABR 시험의 각 파I는 시작 양성(p) 편향과 후속 음의(n) 편향으로 구성된다. ABR 파 I 진폭은 IP (웨이브 I의 양수 피크)와 In (파 I의 음수 피크)29사이의 전압 차이로 정의됩니다.
참고: 병리학적 조건에서, 달팽이관 시냅토병증은 소리에 의해 유발되는 SGN의 합산된 개시 반응을 반영하는 ABR 파 I의 상분기준 진폭에 기초하여 결정될 수 있다. 그러나 OHC 기능 장애로 인해 손상되지 않는 달팽이관 감도는 이 방법의 전제 조건입니다.
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Representative Results
ABR 청력 검사는 마취하에 10 C57BL/6J 마우스(8주)에 대해 수행되었습니다. AV는 4, 8, 16, 32 및 48 kHz에서 톤 버스트 자극을 사용하여 유도되었다. 각 동물의 청력 임계값은 ABR에서 적어도 하나의 명확한 파형을 구별함으로써 시각적으로 검출되었다. 모든 마우스는 자극의 주파수에 따라 25 및 70 dB SPL 사이에 이르는 톤 버스트에 반응하여 ABR 임계값을 나타내었다. 우리의 결과는 청각 임계값이 16 kHz(그림1)에서 가장 낮았다는 것을 나타내었으며, 달팽이관 정점으로부터 약 43 % 거리에 해당 (그림2)다른 달팽이관에서 음향 감도가 현저히 감소한다는 것을 시사합니다. 지역.
달팽이관 전체 마운트는 스테레오 해부 현미경하에 성인 마우스에서 측두골로부터 분리되었다(도2A). 청각 상피의 전체 마운트는 세 조각으로 해부되었고, 그 길이는 측정되었고 결국 달팽이관 정점으로부터 퍼센트 거리로 변환되었습니다. 각 달팽이관 회전의 바실러 멤브레인 상에서의 주파수 위치는 앞서 설명한바와같이 로그 기능을 사용하여 계산하였다( 도 5, 6(도2B).
달팽이관 리본 시냅스의 형태학적 특성을 평가하기 위해, CtBP2 및 GluR2에 대한 항체는 각각 시냅스 및 후진 구조에 라벨을 붙이는 데 사용되었다. 성인 마우스의 정상적인 귀에서, 면역 염색은 IHC의 basolateral 막의 표면을 스터드 시냅스 리본과 조미료 수용체 패치의 병치 쌍을 밝혀, 와 함께 8-20 IHC 당 쌍 (그림3A). 대부분의 puncta는 일반적인 귀에 병치된 쌍으로 나타났지만, 고아 리본은 고배율에서 드물게 관찰될 수 있었습니다(그림3B). IHC 리본 시냅스(CtBP2 및 GluR2 둘 다에 대한 면역 양성 반점)의 수는 16 kHz 영역에서 가장 높았으며, 이 위치에서의 거리가 증가함에 따라 현저히 감소했다(그림3C). 공초점 투영에 기초하여 결정된 시냅스 카운트는 달팽이관에서 뇌(29)로 정보를 전송하는 청각 신경섬유의 최대 수의 추정치를 제공한다.
달팽이관 리본 시냅스의 기능상태는 청각신경섬유29,31의기능적 무결성에 관한 정보를 제공하는 ABR파 I 진폭을 기초로 하는 모든 성인 마우스에서 조사되었다. ABR 파 I는 도 4A에 도시된 바와 같이 90 dB의 음압 수준에서 제시된 자극의 각 주파수에서 진폭을 피크에서 다음 트로프까지 측정했다. ABR 파 I 진폭은 16 kHz의 주파수에서 가장 높았으며, 가장 낮은 청력 임계값에 대응하고, 진폭 값은 이 위치에서의 거리가 증가함에 따라 현저히 감소하였다(도4B). 이 결과 리본 시 냅 스 수에 관찰 된 변경 과 일치, 이 달팽이관 영역 내에서 시 냅 스 가장 생생한 시 냅 스 기능을 전시할 수 있습니다 나타내는. 더욱이, 이전 마우스 연구에서 는 소음 유발 및 연령 관련 달팽이관 신경 변성, ABR 파의 상급 진폭 나는 리본 손실에 비례하여 감소, ABR 파 I 진폭이 높은 상관도와 상관있음을 나타내는 달팽이관 시냅스병증29,31.
그림 1 : 청력 평가. 톤 버스트 자극의 상이한 주파수 간의 ABR 임계값 비교는 10명의 성인 C57BL/6J 마우스에서 청력 임계값이 16 kHz에서 가장 낮았음을 입증하였다. ABR 응답은 다른 주파수 영역에서 상당히 상승하였다(Dunnett의 다중 비교 포스트 혹 테스트를 가진 단방향 ANOVA; *: P < 0.01, n = 20 귀). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다.
그림 2 : 달팽이관 주파수 현지화 마우스에서. (A) 스테레오 해부 현미경으로 측두골에서 해부된 전체 이식 달팽이관의 대표적인 이미지. (B) 마우스 달팽이관은 달팽이관, 중간 및 기저 회전으로 나뉘어져 있으며, 여기서 달팽이관 측면 벽이 제거됩니다. 달팽이관 막의 파편에 빨간 원은 달팽이관에 있는 주파수 위치 및 그들의 대응하는 정규화한 위치를 표시합니다 (0%는 달팽이관 정점을, 달팽이관 기지에 100%를 의미합니다). 배율 막대 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 공초점 분석 의 달팽이관 리본 시냅스 마우스에서. (A) 4, 8, 16, 32 및 48 kHz 영역에 대한 리본 시냅스의 대표적인 이미지, 시냅스 전 리본(CtBP2, red) 및 후시냅스 구조(GluR2, green)에 대해 면역염색을 하였다. 흰색 파선은 참조를 위해 내부 모발 세포를 윤곽을 그리는 데 사용됩니다. 배율 막대 = 10 μm. (B) 공초점 z 스택의 고출력 썸네일에서는 이러한 리본 시냅스가 CtBP2 양성(빨간색)과 GluR2 양성(녹색) puncta(왼쪽과 중간)의 밀접하게 나란히 나타난 반면, 고아 리본(오른쪽)은 포스트나프틱이 결여된 것으로 나타났습니다. 글루타메이트 수용체 패치는 매우 드물었다. 배율 막대 = 0.5 μm. (C) 모든 시냅스 및 후성 분절 원소와 쌍을 이루는 리본 puncta의 정량적 분석은 내부 모발 세포 당 시냅스 풍파의 수가 다른 주파수 영역 (단방향 ANOVA)에 비하여 16 kHz 영역에서 상당히 높았다는 것을 밝혔다. Dunnett의 여러 비교 포스트 혹 테스트; *: P < 0.01, n=6 귀). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다.
그림 4 : 분석 ABR 웨이브 I 진폭 마우스에서 . (A) 8주 령 C57BL/6J 마우스로부터 의 대표적인 ABR 파형은 90 dB의 강도로 16kHz 순수 톤 자극에 노출되었다(0 ms에서 자극 개시). 로마 숫자는 ABR 파도의 봉우리를 표시합니다. 점선은 진폭을 나타내는 웨이브 I 피크와 쓰루를 표시합니다. (b) 90dB의 음압 레벨에서 제시된 4, 8, 16, 32 및 48 kHz 자극에 대한 응답으로 평균 파I 진폭의 정량분석. ABR 웨이브 I 진폭은 16 kHz의 주파수에서 가장 높았고 다른 주파수에서 현저히 낮았습니다 (Dunnett의 다중 비교 포스트 혹 테스트를 가진 단방향 ANOVA; *: P < 0.01, n = 20 귀). 데이터는 평균 ± SEM으로 표현됩니다.
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Discussion
달팽이관 시냅스병증은 100dB SPL에서 8\u201216 kHz 옥타브 대역 소음에 의해 유도된 일시적인 임계값 시프트(TTS)를 가진 성인 마우스를 처음 특징으로 하기 때문에, 연구자들은 다양한 시냅스병증의 효과를 점점 더 조사하고 있다. 원숭이와 인간을 포함한 포유류32,33. 소음 노출 이외에, 몇몇 그밖 조건은 달팽이관 synaptopathy (예를 들면, 노화, 이독성 약의 사용 및 유전 돌연변이)와 연관되었습니다, suprathreshold 오디션의 단기 중단으로 이끌어 내고, 돌이킬 수 없는 선행합니다 청각 신경의 변성. 달팽이관 모욕의 초기 단계에서, 시냅스 병증은 종종 특정 주파수 위치에서 발생, 특히 IHC 시냅스에 손상이 주파수 영역을 선택으로 제한되는 실험 모델에서24,31. 따라서, 우리의 프로토콜은 특정 주파수 지역에서 시냅스 형태 및 기능의 조사를 가능하게 한다는 점에서 중요하다.
달팽이관 장소 주파수지도는 내이에 있는 정상과 이상한 지역을 더 반영하는 정상과 이상한 청각 기능을 구별하기 위하여 이용될 수 있습니다. 표면 전조 기법이 처음 다른 달팽이관 회전에서 손상되지 않고 누락된 모발 세포를 플롯하는 데 사용되었기 때문에,코클리오그램은 모발 세포 손실을 정량화하는 일상적인 방법이 되었다 6. 따라서, 달팽이관내의 형태학적 모욕을 관련 생리적 변화와 상관관계가 있도록, 코클리그램상에 장소 주파수 맵을 포함하는 것이 합리적이다. 이 방법을 사용하면 확립된 달팽이관 장소 주파수 맵과 관련하여 달팽이관 바실라 멤브레인을 따라 시냅스의 수와 구조를 결정할 수 있으므로 자세한 비교를 위한 충분한 정보를 제공할 수 있습니다. 조직학적 및 생리적 결과 사이에 있습니다. 그러나, 몇몇 연구 결과는 달팽이관 덕트를 따라 달팽이관 세그먼트 또는 거리에 근거를 둔 시냅병증을 평가합니다, 이는 바실라 막 길이에 있는 종 내 변이로 인해 개별 달팽이관 사이 직접 비교를 허용하지 않습니다. 따라서 개별 달팽이관 길이를 밀리미터에서 상대 백분율로 변환하여 코클리그램을 표준화하는 것이 특히 중요합니다.
시냅토병증은 IHCs의 횡측 영역에서 CtBP2 단백질(시냅스 이소폼 "리브아이")에 대한 면역 염색의 시각화를 통해 확인할 수 있다. 이러한 CtBP2 양성 패치는 시냅스 전 리본의 정량화를 위한 구조적 마커로서 작용할 수 있으며, 적은 수의 패치가 존재하면 일반적으로 시냅스 전 손실을 나타낸다. 이전 연구는 시냅스 전 리본의 98 %가 정상 귀(30)의시냅스 후 단말과 짝을 이루고 있다고보고했지만, CtBP2 양성 패치의 간단한 수는 완전한 시냅스의 정량적 분석을 위해 정확하지 않을 수 있습니다. "고아"(후시 냅스 단자와 짝을 이루지 않은 시냅스 리본)를 포함시킴으로써 부상당한 귀에 시냅스 카운트의 과대 평가로 이어질 수 있습니다. 시냅스 수를 추정하는 정확도를 향상시키기 위해 GluA2, GluA2/3 또는 PSD-95와 같은 후층 내피 구조에 대한 추가 항체가 사용됩니다. 상기 세포내혈구 단백질 PSD-95는, 막 관련 구안레이트 키나아제(MAGUK) 스캐폴딩 단백질로, 주로 모발 세포와 SGN 섬유 종말 사이의 접촉에서 관찰되는 PSD-95에 대한 항체를 사용하여 표지될 수 있다34, 35. 그러나, GluR2에 대하여 항체는 더 확실하게 리본 시냅스를 확인할 수 있는 포스트나프틱 막에 있는 AMPA 형 ionotropic 글루타메이트 수용체를 위해 더 특이적입니다 (presynaptic CtBP2의 면역 형광 성 puncta의 병치 쌍 및 [1] 글루R2)15. 형태학적 분석 외에도 완전한 시냅스의 조직학적 분석은 시냅스병증에 대한 기능적 지표로 사용될 수 있습니다. 달팽이관 시냅병증을 가진 성인 마우스에서, ABR 파의 감소는 시냅스 손실의영역과 관련된 주파수에서 중간-높은 수준의 톤 자극의 프리젠테이션에 따라 16,29. 이 방법을 사용하여 얻어진 시냅스 카운트는 바실라 멤브레인상에서 한 부위를 스캔하는 데 약 10분이 걸린다는 점에서 제한된다. 또한 IHC 위치에 따라 시냅스 수와 형태학의 공간 변화를 평가하기 위해 무형유산 체의 경계(예를 들어, 미오신 VIIa 염색를 통해)를 정확하게 식별하고 특정 이미지 처리 단계26을 수행해야 합니다. . 이러한 방법을 사용하여, 이전 연구는 시냅스 손실이 소음 유도 변성의 동물 모델에서 기둥 측에 보다 IHC의modiolar 측에 더 큰 것을 확인26.
이전 연구는 낮은 자발적 속도, 높은 임계 값 섬유가 제한된 시냅스 병증26,30의동물 모델에서 높은 자발적 속도, 낮은 임계 값 섬유보다 소음 손상에 더 취약하다는 것을 입증했다. 이러한 연구는 정상적인 ABR 임계값 및 왜곡 생성물 이음향 방출을 가진 동물 모델의 시냅스 기능을 평가하기 위해 ABR 파 I(중간- 높은 수준의 톤 자극을 사용하여 측정)의 초임계 값 진폭을 사용하는 근거를 제공합니다. DPOAEs). ABR의 웨이브 I는 청각 신경 섬유의 합산 된 신경 반응을 반영하기 때문에, 시냅토 병증이 ABR 파I 진폭을 통해 평가 될 때, DPOAE 테스트는 또한 OHC 손상을 제외하기 위해 수행되어야하며, 이는 또한 의 중단으로 인해 ABR 진폭을 줄일 수 있습니다. 메카노전전 트랜스덕션. 원형 창 전극으로부터 측정되는 화합물 작용 전위(CAP)의 제1 파동은 달팽이관 신경의 합산 활성을 나타내기도 하지만, 이 방법은 ABR 측정보다 더 침습적이고 복잡하다. DPOAE 반응이 노이즈 노출 마우스(31)에서 일시적인 임계값 이동 후 정상으로 돌아오거나 노화마우스(29)에서아직 악화되지 않은 경우, ABR 파의 초상순문 진폭 나는 달팽이관 시냅스병증의 정도를 강하게 예측할 수 있다. 영향을받는 뉴런은 IHCs에 대한 시냅스 연결이 중단 될 때 침묵하기 때문에. 그러나, 달팽이관 감도가 다양한 요인(예를 들어, OHC 기능 장애)으로 인해 감소되는 경우, ABR 파I 진폭의 감소는 모든 달팽이관 손상의 조합을 반영하기 때문에 더 이상 시냅스 손실에 기인할 수 없다. 따라서, 시냅스병증 제한 모델 준비를 위한 통제된 실험 조건은 달팽이관 감도가 그밖 요인에 의해 손상되지 않다는 것을 확인하기 위하여 요구됩니다. 불행히도, ABR 파 I 진폭은 동물의 청각 신경 섬유 손실의 객관적인 척도를 제공하지만, 인간에서 측정하기는 어렵다. 더욱이, 시냅스병증, 모발 세포의 상실, 달팽이관에 있는 그밖 이상의 존재와 관련시키는 혼합된 병리는 인간에서 공동 으로 생길 수 있고, 임상 설정에서 ABR 파 I 진폭 측정의 사용을 제한하. ABR 파 레이턴시(ABR wave latency)는 자극의 발병부터 각 파의 양수 피크까지 밀리초 단위로 계산되어 청각 경로를 따라 전송 시간에 대한 통찰력을 제공합니다. 파I 대기 시간에 대한 유의한 변화는 잡음 유발 또는 연령 관련 달팽이관 시냅토병증(36)의 마우스 모델에서 관찰되지 않았다. 그러나, 일부 증거는 ABR 웨이브 V 대기 시간에 마스킹 노이즈의 효과가인간37에서달팽이관 시냅스병을 진단하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
몇몇 최근 연구 결과는 달팽이관 synaptopathy가 숨겨진 청력 감소, 이명 및 hyperacusis와 관련되었던 1 차적인 처음 사건이다는 개념을 지원했습니다. 내이 질환의 달팽이관 시냅스 병증의 개념은 이제 확고하게 확립되었지만 청력 능력에 대한 자세한 영향은 알려지지 않았습니다. 현재 연구에 제시된 프로토콜은 특정 주파수 영역 내의 달팽이관 리본 시냅스의 형태와 기능을 조사할 수 있게 합니다. 따라서, 이 프로토콜은 달팽이관 시냅토병증, 그 기본 메커니즘 및 다양한 실험 동물 모델에서 잠재적인 치료 적 개입의 효능을 조사하는 데 사용될 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (81770997, 81771016, 81830030); 베이징 자연 과학 재단과 베이징 교육위원회 (KZ201810025040)의 공동 자금 조달 프로젝트; 베이징 자연 과학 재단 (7174291); 중국 박사 후 과학 재단 (2016M601067).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100 mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10 mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 |
References
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