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Neuroscience

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

doi: 10.3791/59189 Published: May 10, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto descrive un protocollo sperimentale per valutare le caratteristiche morfologiche e lo stato funzionale delle sinapsi del nastro nei topi normali. Il modello attuale è adatto anche per modelli con sinaptopatia cocleare indotta dal rumore e legati all'età. Vengono inoltre discussi i risultati correlati dei precedenti studi sul mouse.

Abstract

Le cellule ciliate interne cocleari (IHC) trasmettono segnali acustici ai neuroni gangliari a spirale (SGN) attraverso le sinapsi a nastro. Diversi studi sperimentali hanno indicato che le sinapsi delle cellule dei capelli possono essere gli obiettivi iniziali nella perdita dell'udito neurosensoriale (SNHL). Tali studi hanno proposto il concetto di cocleare "sinaptopatia", che si riferisce ad alterazioni nel numero di sinapsi del nastro, struttura o funzione che si traducono in una trasmissione sinaptica anormale tra IHong e SGR. Mentre la sinaptopatia cocleare è irreversibile, non influisce sulla soglia uditiva. Nei modelli sperimentali indotti dal rumore, vengono impiegati danni limitati alle sinapsi IHC in determinate regioni di frequenza per identificare i fattori ambientali che causano specificamente la sinaptopatia, nonché le conseguenze fisiologiche di disturbare questo orecchio interno Circuito. Qui, presentiamo un protocollo per l'analisi della morfologia sinaptica cocleare e la funzione in una regione di frequenza specifica nei topi adulti. In questo protocollo, la localizzazione cocleare di specifiche aree di frequenza viene eseguita utilizzando mappe di frequenza dei luogo in combinazione con i dati del cocleare, a seguito del quale le caratteristiche morfologiche delle sinapsi del nastro vengono valutate tramite Immunostaining. Lo stato funzionale delle sinapsi del nastro viene quindi determinato in base alle ampiezze dell'onda I di risposta del tronco encefalico uditivo (ABR). La presente relazione dimostra che questo approccio può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione della patogenesi e dei meccanismi della disfunzione sinaptica nella coclea, che può aiutare nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici.

Introduction

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Le frequenze nell'intervallo di circa 20-u201220.000 Hz possono essere percepite come stimoli uditivi dagli esseri umani. L'udito umano è normalmente più sensibile vicino a 1.000 Hz, dove il livello medio di pressione sonora è di 20 - Pa nei giovani adulti (cioè, 0 decibel del livello di pressione sonora [dB SPL]). In alcune condizioni patologiche, la perdita dell'udito è limitata a frequenze specifiche. Ad esempio, nelle prime fasi della perdita dell'udito indotta dal rumore (NIHL), è possibile osservare una "notch" (cioè l'elevazione della soglia uditiva) nell'audiogramma a 4 kHz1. Lungo la partizione cocleare dei mammiferi, le sue gradazioni di rigidità e massa producono una mappa di frequenza esponenziale, con rilevamento del suono ad alta frequenza alla base della coclea e rilevamento a bassa frequenza all'apice2. Infatti, c'è una mappa posto-frequenza cocleare lungo la membrana basilare, che porta a quella che è conosciuta come organizzazione tonotopica2,3. Ogni dato posto sulla membrana basilare ha la più alta sensibilità ad una sola particolare frequenza sonora, che di solito è chiamata la frequenza caratteristica3,4, anche se si possono osservare anche risposte ad altre frequenze.

Fino ad oggi, sono stati impiegati vari modelli murini per studiare la normale funzione, i processi patologici e l'efficacia terapeutica nel sistema uditivo. Una conoscenza precisa dei parametri fisiologici nella coclea del topo è un prerequisito per tali studi di perdita dell'udito. La coclea del topo è anatomicamente divisa in curve apicali, medie e basali, che corrispondono a diverse regioni di frequenza. Etichettando gli afferenti del nervo uditivo presso il nucleo cocleare per analizzare i corrispondenti siti di innervazione periferica nella coclea, M'ller et al. sono riusciti a stabilire la mappa della frequenza del luogo cocleare nel normale topo5vivo . Nell'intervallo di 7,2–61,8 kHz, che corrisponde a posizioni comprese tra il 90% e il 10% dell'intera lunghezza della membrana basilare, la mappa della frequenza di posizionamento cocleare del topo può essere descritta da una semplice funzione di regressione lineare, suggerendo una relazione tra distanza normalizzata dalla base cocleare e dal logaritmo della frequenza caratteristica5. Nei topi di laboratorio, la mappa luogo-frequenza può essere utilizzata per esplorare la relazione tra soglie uditive all'interno di specifiche gamme di frequenza e cocleogrammi che mostrano il numero di cellule ciliate mancanti nelle regioni relative lungo la membrana basilare6. È importante sottolineare che la mappa luogo-frequenza fornisce un sistema di posizionamento per l'indagine di danni strutturali minimi, come danni alle sinapsi del nastro delle cellule ciliate in specifiche posizioni di frequenza cocleare nei topi con trauma uditivo periferico7 ,8.

Nella coclea mammifera, le sinapsi del nastro sono costituite da un nastro pressinaptico, una proiezione ad alta densità di elettroni che lega un alone di vesciche sinaptiche pronte per il rilascio contenenti glutammato all'interno dell'IHC e una densità post-sinaptica sul terminale nervoso del SGN con recettori del glutammato9. Durante la trasduzione del suono cocleare, la deflessione del fascio di cellule ciliate provoca la depolarizzazione dell'IHC, che porta al rilascio del glutammato dagli IHC nei terminali afferenti post-rattici, attivando così il percorso uditivo. L'attivazione di questo percorso porta alla trasformazione dei segnali meccanici indotti dal suono in un codice di tasso nel SGN10. Infatti, la sinapsi a nastro IHC è altamente specializzata per la trasmissione sonora instancabile a velocità di centinaia di Hertz con alta precisione temporale, ed è di fondamentale importanza per i meccanismi pressinaptici della codifica del suono. Studi precedenti hanno rivelato che le sinapsi del nastro variano notevolmente in dimensioni e numero in diverse regioni di frequenza nella coclea del topo adulto11,12, probabilmente riflettendo l'adattamento strutturale alla particolare codifica del suono per esigenze di sopravvivenza. Recentemente, studi sperimentali sugli animali hanno dimostrato che la sinaptopatia cocleare contribuisce a molteplici forme di ipovedenti, tra cui perdita dell'udito indotta dal rumore, perdita dell'udito legata all'età e perdita ereditaria dell'udito13, 14.Pertanto, i metodi per identificare i cambiamenti correlati nel numero, nella struttura e nella funzione sinaptica in specifiche regioni di frequenza sono stati sempre più utilizzati negli studi sullo sviluppo uditivo e sulle malattie dell'orecchio interno, utilizzando modelli generati tramite manipolazione sperimentale di variabili genetiche o ambientali15,16,17.

Nel rapporto corrente, presentiamo un protocollo per analizzare il numero sinaptico, la struttura e la funzione in una specifica regione di frequenza della membrana basilare nei topi adulti. La localizzazione della frequenza cocleare viene eseguita utilizzando una determinata mappa luogo-frequenza in combinazione con un cocleogramma. Le normali caratteristiche morfologiche delle sinapsi cocleari sono valutate tramite immunostaining presilnaptico e post-sinaptico. Lo stato funzionale delle sinapsi a nastro cocleare è determinato in base alle ampiezze soprasoglia dell'onda ABR I. Con piccole alterazioni, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare condizioni fisiologiche o patologiche in altri modelli animali, tra cui ratti, porcellini d'India e gerbilli.

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Protocol

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Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Guida NRC/ILAR per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (ottava edizione). Il protocollo di studio è stato approvato dal Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Medicina Capitale, Pechino, Cina.

1. Selezione degli animali

  1. Per tutti gli esperimenti, utilizzare topi maschi adulti C57BL/6J (8 settimane) come modello animale.
    NOT: I topi C57BL/6J che trasportano una variante di giunzione del Cdh23 presentano una senescenza accelerata nel sistema uditivo, riflessa come una perdita del 40% delle sinapsi del nastro alla svolta basale della coclea e una perdita del 10% a metà curva di 6 mesi di età, seguita da una rapida aumento di questa perdita in tuttala coclea a 18anni ,19. Pertanto, si consiglia cautela quando si utilizzano topi C57BL/6J più vecchi di 6 mesi per la ricerca uditiva. Altri ceppi di topi possono essere utilizzati a seconda di specifici obiettivi sperimentali.
  2. Ispezionare i topi utilizzando un otoscopio tascabile diagnostico professionale per escludere patologie esterne o medie dell'orecchio prima delle valutazioni dell'udito. I potenziali segni possono includere fluido o pus nel canale uditivo esterno, arrossamento e gonfiore nel tessuto locale e perforazione della membrana timpanica.
    NOT: Anche se questo è raramente incontrato, una volta identificato, i topi con malattie dell'orecchio esterno o medio dovrebbero essere esclusi.

2. Valutazione uditiva

  1. Anestesizzare i topi utilizzando un'iniezione intraperitoneale di una miscela di cloridrato di chetamina (100 mg/kg) e cloruro di xilazina (10 mg/kg). Giudicare la profondità dell'anestesia attraverso stimoli dolorosi (ad esempio, riflesso del pizzicotto).
    NOT: Quando il riflesso del pizzico è completamente assente, l'animale ha raggiunto una profondità adeguata di anestesia per i test uditivi. Se è necessario più tempo per le registrazioni Bilaterali ABR, amministrare un dosaggio più basso (un quinto del dosaggio originale) di anestetici per ripristinare il piano anestetico originale. Fare attenzione a evitare sovradosaggio anestetico, in quanto questo può portare alla morte nei topi.
  2. Mantenere la temperatura corporea dell'animale anestesizzato a 37,5 gradi centigradi utilizzando una piastra di riscaldamento termoregolazione. Posizionare l'animale anetizzato in una stanza schermata elettricamente e acusticamente per evitare interferenze durante l'esame dell'udito.
    NOT: Mantenere la temperatura fisiologica durante l'intera procedura fino a quando l'animale è totalmente sveglio, al fine di prevenire la morte causata da ipotermia post-anestesia.
  3. Posizionare gli elettrodi dell'ago subdermico (20 mm, 28 G) sul vertice del cranio (elettrodo di registrazione), nella regione parotide ipsilaterale sotto la pinna dell'orecchio misurato (elettrodo di riferimento) e nella regione contralaterale (elettrodo di terra), con una profondità di 3 mm sotto la pelle della testa del topo, rispettivamente20.
  4. Utilizzare un altoparlante a campo chiuso per eseguire la stimolazione acustica tramite un tubo di plastica di 2 cm con una punta a forma di cono. Montare la punta nel condotto uditivi esterno21.
    NOT: Assicurarsi che l'impedito elettrico negli elettrodi di registrazione e di riferimento sia inferiore a 3 kOhm (di solito 1 kOhm). Se l'impedeggio è alto, cambiare il sito di inserimento dell'elettrodo, pulire l'elettrodo con alcool o sostituire l'elettrodo per evitare alterazioni nell'ampiezza dell'onda ABR.
  5. Per la registrazione ABR, generare pip di tono (durata 3 ms, 1 ms di salita/caduta, ad una velocità di 21,1/s, frequenza: 4-48 kHz) e presentarli a SPL decrescenti da 90 a 10 dB in 5 -u201210 dB SPL passaggi20. Durante questo passaggio, le risposte vengono amplificate (10.000 volte), filtrate (0,1-3 kHz) e mediate (1.024 campioni/livello di stimolo).
    NOT: Gli ADR vengono raccolti per ogni livello di stimolo in 10 dB, con ulteriori 5 dB gradini vicino alla soglia.
  6. Ad ogni frequenza, determinare la soglia ABR, che si riferisce alla SPL minima con conseguente registrazione ABR affidabile con una o più onde distinguibili che possono essere chiaramente identificate dall'ispezione visiva (Figura 1).
    NOT: Di solito è necessario ripetere il processo per bassi SPL intorno alla soglia per garantire la coerenza delle forme d'onda. La soglia di risposta è il livello di stimolo più basso in cui la forma d'onda può essere osservata, quando una diminuzione di 5 dB porterebbe alla scomparsa della forma d'onda.

3. Lavorazione dei tessuti cocleari

  1. Dopo la registrazione ABR, eutanasia i topi anestetizzati attraverso la lussazione cervicale, decapitarli, esporre i bulla dal lato ventrale e aprire con forbici affilate per ottenere l'accesso alla coclea.
  2. Utilizzando una pinze sottili, rimuovere le ossa temporali, recidere l'arteria di stapes, rimuovere le stapes dalla finestra ovale e rompere la membrana rotonda della finestra. Fare un piccolo foro all'apice della coclea ruotando delicatamente la punta di un ago (13 mm, 27 G).
  3. Fissare le ossa isolate con 4% (wt/vol) paraformaldeide in 0,1 M di salina con buffer di fosfato (PBS, pH 7,4) durante la notte a 4 gradi centigradi. Utilizzando una pipetta a punta fine, lavare delicatamente gli spazi fissativi attraverso gli spazi perilymphatic tramite applicazione alle finestre ovalio o rotonde (come inseridimento) e l'apertura all'apice (come presa).
    NOT: Alcune proteine richiedono una breve durata di fissazione per evitare la distruzione dei loro epitopi per l'immunolabeling. In questi casi, incubare le ossa nel 4% paraformaldeide a temperatura ambiente (RT) per 2 h, a seconda delle istruzioni del produttore per l'immunostochimica. La fissazione può essere eseguita anche tramite perfusione cardiaca per rimuovere il sangue cocleare, evitando il rumore di fondo a causa di macchie non specifiche nelle fasi successive, in particolare nei modelli murini di sinaptopatia cocleare.
  4. Sciacquare le ossa tre volte per 5 min con PBS freddo di 0,1 M per rimuovere la paraformaldeide residua. Decalcificare le ossa con 10% acido etilenediaminetraacetica (EDTA) sia a RT per 4 h o a 4 gradi C per 24 h per agitazione delicata in uno shaker orizzontale a 20 giri. EDTA può essere aggiornato a metà strada.
    NOT: I tempi di decalcificazione sono soggetti alla concentrazione delle preferenze EDTA e degli utenti. Il tessuto decalcolato dovrebbe mantenere un certo grado di robustezza, che facilita la manipolazione di cocleari interi-mount nelle fasi successive. Le ossa temporali possono essere decalcolate nel 10% EDTA con rotazione, permettendo ai ricercatori di lasciare il laboratorio dopo test ABR ed esperimenti di fissazione. Il tempo di decalcificazione è flessibile nell'intervallo compreso tra 20 e 30 h a 4 gradi centigradi.
  5. Trasferire un osso temporale decalcolato da EDTA a 0,1 M PBS. Utilizzare #3, #5 pinze Dumont e l'ago 27 G per sezionare le regioni cocleari apicali, medie e basali a turno e poi sezionare la coclea fuori dall'osso sotto un microscopio di dissezione stereo (come descritto in precedenza22). Fare una serie di piccoli tagli lungo il legamento a spirale utilizzando una lama di rasoio, e rimuovere la membrana tectoriale e la membrana di Reissner (Figura 2).
    NOT: Finché la coclea sezionata è intatta, questo processo può essere modificato in base al solito protocollo del singolo operatore.
  6. Sezionare ulteriormente il restante epitelio uditivo, compreso il limbo a spirale, in singole curve di cocleare (apice, centro e base con regione di gancio) per preparazioni a monte intero.
  7. Sotto un obiettivo di olio 40x di un microscopio luminoso, misurare la lunghezza della membrana basilare con una scala di 250 m posta nell'oculare, che può essere regolata lungo la stereocilia degli IHC.
  8. Calcolare la lunghezza di ogni turno cocleare aggiungendo tutte le lunghezze dei segmenti (250 m per segmento) e ottenere concomitante la lunghezza totale della membrana basilare sommando le lunghezze di ogni turno.
  9. Convertire la lunghezza totale della membrana basilare, compresa la regione dell'aggancio, in una percentuale in base alla distanza dall'apice cocleare (0% si riferisce all'apice cocleare, 100% alla base cocleare).
  10. Convertire questa distanza nella frequenza caratteristica cocleare utilizzando una funzione logaritmica (d(%) , 1 - 156,5 x 82,5 log(f), con una pendenza di 1,25 mm/ottava di frequenza, dove d è la distanza normalizzata dall'apice cocleare in percentuale, f è frequenza in kHz), come descritto in precedenza5,6. Così la gamma di frequenza in una zona corrispondente della membrana basilarea su ogni turno cocleare può essere acquisita.

4. Immunofluorescenza Colorazione

  1. Dopo la dissezione, posizionare ogni giro cocleare in un tubo centrifuga separato da 2,5 ml e incubare le curve cocleari nel 10% di siero di capra/PBS/0,1% Triton X-100 per 1 h a RT su un rotatore.
  2. Rimuovere la soluzione di blocco/permeabilizzazione di cui sopra da ogni tubo utilizzando una punta di pipetta da 200 gradi al microscopio di dissezione e incubare gli esemplari con anticorpi primari diluiti nel 5% di siero di capra/PBS/0,1% Triton X-100 durante la notte a 4 gradi su un rotatore.
    NOT: Per l'immunoetichettatura dei nastri sinaptici cocleari, utilizzare la proteina anti-carboxyl-terminale del marcatore presilico, e il recettore postitico dell'anti-glutammato 2 IgG2a (GluR2, etichettatura di una sottounità del recettore AMPA, 1:200)23.
  3. Risciacquare tre volte per 5 min con 0,1 M di PBS freddo per rimuovere gli anticorpi primari residui e incubare gli esemplari con anticorpi secondari diluiti nel 5% di siero di capra/PBS/0,1% Triton X-100 a RT per 2,u20123 h al buio su un rotatore.
    NOTA: Preparare le miscele di anticorpi secondari appropriati utilizzando alexa Fluor 568 di capra anti-topo (IgG1, 1:500) e l'antitocapra anti-topo Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), che sono complementari agli anticorpi primari utilizzati nel passaggio 4.2. Per migliorare l'efficienza dell'etichettatura per i nastri sinaptici, si consiglia di selezionare anticorpi secondari specifici. Alcuni laboratori estendono l'incubazione con anticorpi secondari per aumentare l'immunolabeling GluR224.
  4. Risciacquare tre volte per 5 min con 0,1 M PBS per rimuovere gli anticorpi secondari residui e trasferire gli esemplari da tubi di centrifugazione da 2,5 mL a piastre da 35 mm contenenti 0,1 M pbS.
  5. Posizionare una goccia di supporto di montaggio contenente 4',6-diamidino-2-fenilondole (DAPI) sul vetrino e trasferire i campioni da PBS al supporto di montaggio. Posizionare un bordo di un coperchio sul vetrino e rilasciare per far cadere delicatamente il coperchio.
    NOT: Per garantire che le cellule ciliate siano rivolte verso l'alto e che non si verifichino ripiegature o torsioni di campioni cocleari durante la procedura, montare campioni di cocleare al microscopio di dissezione stereo.
  6. Collocare i vetrini in una scatola di diapositive a 4 gradi centigradi per far asciugare i vetrini e quindi eseguire l'immagine al microscopio confocale laser.

5. Valutazione morfologica delle sinapsi a nastro cocleare

  1. Diapositive di immagini che utilizzano un microscopio confocale con tre laser: un diodo UV da 405 nm, un laser ad argon da 488 nm e un laser a stato solido (DPSS) a 561 nm per eccitare DAPI (Spettro di eccitazione 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (Spettro di uscita 496–549 nm) e Alexa Fluor 568 nm (Spettro di eccitazione 573–631 nm), rispettivamente.
  2. Acquisire z-stack confocale su una distanza di 8 m da ogni giro cocleare utilizzando una lente di immersione ad alta risoluzione 63x.
    NOT: Una volta definiti, tutti i parametri per la digitalizzazione dei fotomicrografi devono essere salvati e applicati uniformemente a tutte le diapositive.
  3. Per i conteggi di punctum sinaptico, impostare gli z-stack (dimensione del passo di 0,3 m) in modo che si estendano per l'intera lunghezza degli IHC, assicurando in tal modo che tutte le puncta sinaptiche possano essere imagete.
  4. Unire le immagini contenenti puncta in una z-stack per ottenere la proiezione dell'asse z e importarle nel software di elaborazione delle immagini.
  5. Dividere i conteggi totali sinaptici in ogni z-stack in specifiche regioni di frequenza per il numero di IHC (uguale ai conteggi manuali nucleari DAPI) per calcolare il numero di puncta sinaptiche per ogni IHC. In ogni regione di frequenza specifica, media di tutti i puncta sinaptici in tre immagini di diversi campi microscopici contenenti 9-11 IHC.
    1. Delineare la regione di interesse (ROI), incluse le regioni basilari di ogni IHC utilizzando il pulsante di selezione a mano libera. Utilizzare la funzione di misura per la quantificazione automatica dei puncta e la funzione spartiacque per distinguere tra punti strettamente adiacenti.
    2. Dopo ogni conteggio automatizzato, eseguire ispezioni visive con correzioni manuali per garantire il conteggio puncta affidabile.
      NOT: Gli sperimentatori dovrebbero rimanere accecati sul fatto che lo scivolo provenga dall'apice, dal centro o dal turno basale della coclea.
  6. Valutare visivamente la struttura e la distribuzione sinaptica, per isolare manualmente i singoli IHC dai loro vicini con lo strumento Matita (M) per visualizzare meglio l'architettura citoscheletrica e la localizzazione sinaptica.
  7. Per ispezionare la giustapposizione di nastri pressinaptici (CtBP2) e patch del recettore post-sinaptico (GluR2), estrarre lo spazio voxel intorno al nastro dallo strumento rettangolare rettangolare e isolare il nastro individuale da Crop. Facendo clic su Immagine > Dimensioni immagine, acquisire una miniatura di queste proiezioni in miniatura, che può quindi essere utilizzato per identificare le sinapsi accoppiate (apparso come strettamente giustapposto coppie di CtBP2-positivo e GluR2-positivo puncta) contro orfano nastri (mancanza di patch del recettore del glutammato post-sinaptico) (Figura 3).
    NOT: Le normali sinapsi cocleari appaiono come immunoetichettatura combinata del nastro pressinaptico all'interno della cellula perlustlina (anti-CtBP2) e del recettore del glutammato post-sinaptico sul terminale nervoso uditivo (anti-GluR2)25. Alcuni laboratori utilizzano proiezioni confocali in combinazione con la modellazione 3D per quantificare le dimensioni delle patch sinaptiche o il volume26,27. Prima di una significativa perdita di sinapsi del nastro, nastri che presentano cambiamenti di dimensioni o senza patch del recettore del glutammato accoppiati sono probabilmente indicativi di disfunzione sinaptica27,28.

6. Valutazione funzionale delle sinapsi a nastro cocleare

  1. Raccogliere tutte le onde ABR per ogni stimolo di frequenza presentato a una SPL di 90 dB per l'analisi delle ampiezze Suprathreshold ABR wave I.
    NOT: Studi neurofisiologici e morfologici hanno dimostrato che le fibre a basso tasso spontaneo e ad alta soglia sono particolarmente vulnerabili all'invecchiamento e all'esposizione al rumore29,30. Anche se la semplice perdita di sinapsi del nastro non può influenzare le soglie ABR, di solito si traduce in riduzioni significative delle ampiezze dell'onda ABR I, perché questi afferenti tra cui basso tasso spontaneo, fibre ad alta soglia e alto tasso spontaneo, fibre a bassa soglia contribuiscono pesantemente alle attività sommate di fibre nervose cocleari28,29,31. Qui viene selezionata un'intensità soprasoglia di 90 dB SPL.
  2. Determinare l'ampiezza dell'onda picco-picco I utilizzando un programma di analisi offline (Figura 4). Ogni onda I nel test ABR consiste in una deviazione positiva iniziale (p) e la successiva deflessione negativa (n). L'ampiezza a onde ABR I è definita come la differenza di tensione tra Ip (il picco positivo dell'onda I) e In (il picco negativo dell'onda I)29.
    NOT: In condizioni patologiche, la sinaptopatia cocleare può essere determinata in base alle ampiezze soprasoglia dell'onda ABR I, che riflettono le risposte di esordio sommate delle SGU evocate dal suono. Tuttavia, la sensibilità cocleare che non è compromessa a causa di disfunzione OHC è un prerequisito per questo metodo.

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Representative Results

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I test dell'udito ABR sono stati eseguiti per 10 topi C57BL/6J (8 settimane di età) in anestesia. Gli ADR sono stati suscitati utilizzando stimoli di scoppio tono a 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. La soglia uditiva di ogni animale è stata rilevata visivamente distinguendo almeno una chiara forma d'onda nell'ABR. Tutti i topi hanno mostrato soglie ABR in risposta a raffiche di tono, che vanno da 25 a 70 dB SPL a seconda della frequenza dello stimolo. I nostri risultati hanno indicato che la soglia uditiva era più bassa a 16 kHz (Figura 1), corrispondente a circa il 43% di distanza dall'apice cocleare (Figura 2), suggerendo che la sensibilità acustica è significativamente ridotta in altri cocleari Regioni.

Le amneari cocleari erano isolate dalle ossa temporali nei topi adulti sotto un microscopio di dissezione stereo (Figura 2A). Le mie cavalcature dell'epitelio uditivo sono state sezionate in tre pezzi, le cui lunghezze sono state misurate e infine convertite in percentuale di distanza dall'apice cocleare. La posizione della frequenza sulla membrana basilare di ogni turno cocleare è stata calcolata utilizzando una funzione logaritmica, come descritto in precedenza5,6 (Figura 2B).

Per valutare le caratteristiche morfologiche delle sinapsi cocleari del nastro, sono stati utilizzati anticorpi contro CtBP2 e GluR2 per etichettare le strutture presilnaptiche e post-sinaptiche, rispettivamente. Nelle orecchie normali di topi adulti, l'immunostaining ha rivelato coppie giustapposte di nastri sinaptici e recettori del glutammato che tagliano la superficie della membrana basolaterale degli IHC, con 8-20 paia per IHC (Figura 3A). Anche se la stragrande maggioranza dei puncta è apparsa come coppie giustapposte nelle orecchie normali, nastri orfani potrebbero essere osservati raramente ad alto ingrandimento (Figura 3B). I conteggi delle sinapsi del nastro IHC (punti immunopositivi sia per CtBP2 che per GluR2) erano più alti nella regione da 16 kHz, diminuendo significativamente con l'aumentare della distanza da questa posizione (Figura 3C). I conteggi sinaptici determinati sulla base di proiezioni confocali forniscono una stima del numero massimo di fibre nervose uditive che trasmettono informazioni dalla coclea al cervello29.

Lo stato funzionale delle sinapsi del nastro cocleare è stato studiato in tutti i topi adulti basati su ampiezze ABR wave I, che forniscono informazioni riguardanti l'integrità funzionale delle fibre nervose uditive29,31. Le ampiezze dell'onda ABR I ad ogni frequenza dello stimolo presentato a un livello di pressione sonora di 90 dB sono state misurate dal picco al seguente trogolo, come mostrato nella Figura 4A. L'ampiezza ABR dell'onda I era più alta con una frequenza di 16 kHz, corrispondente alla soglia uditiva più bassa, e i valori di ampiezza diminuivano significativamente con l'aumentare della distanza da questa posizione (Figura 4B). Questo risultato è coerente con le alterazioni osservate nei conteggi delle sinapsi del nastro, indicando che le sinapsi all'interno di questa regione cocleare possono presentare la funzione sinaptica più vivida. Inoltre, negli studi precedenti sui topi sulla neurodegenerazione cocleare indotta dal rumore e correlata all'età, le ampiezze soprasoglia dell'onda ABR I sono diminuite in proporzione alla perdita del nastro, indicando che l'ampiezza dell'onda ABR I è altamente correlata al grado di sinaptopatia cocleare29,31.

Figure 1
Figura 1 : Valutazione uditiva. I confronti delle soglie ABR tra le diverse frequenze di stimoli di scoppio tono hanno dimostrato che la soglia uditiva era più bassa a 16 kHz in 10 topi adulti C57BL/6J. La risposta ABR è stata notevolmente elevata in altre regioni di frequenza (ANOVA unidirezionale con il test post hoc di confronto multiplo di Dunnett; : P < 0,01, n - 20 orecchie). I dati sono espressi come la media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : localizzazione della frequenza cocleare nei topi. (A) Un'immagine rappresentativa della coclea completamente espiantata, che è stata sezionata dall'osso temporale al microscopio di dissezione stereo. (B) La coclea del topo è divisa in curve apicali, centrali e basali, dove viene rimossa la parete laterale cocleare. I cerchi rossi sui frammenti della membrana basilare cocleare indicano le posizioni di frequenza e le corrispondenti posizioni normalizzate nella coclea (0% si riferisce all'apice cocleare, 100% alla base cocleare). Barra della scala: 250 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Analisi confocale di sinapsi a nastro cocleare nei topi. (A) Immagini rappresentative delle sinapsi a nastro per le regioni da 4, 8, 16, 32 e 48 kHz, immunostainse per nastri presilnaptici (CtBP2, rosso) e strutture postinaptiche (GluR2, verde). Le linee tratteggiate bianche vengono utilizzate per delineare le cellule ciliate interne come riferimento. Barra della scala: 10 m. (B) Le miniature ad alta potenza delle z-stack confocali mostrano che queste sinapsi a nastro sono apparse come coppie strettamente giustapposte di CCT2-positivo (rosso) e GluR2-positivo (verde) puncta (sinistra e mezzo), mentre i nastri orfani (a destra) privi di le cerotti del recettore del glutammato erano molto rare. Barra della scala: 0,5 m. (C) L'analisi quantitativa dei puncta a nastro accoppiati con tutti gli elementi pressinaptici e post-sinaptici ha rivelato che il numero di puncta sinaptici per cellula ciacca interna era significativamente più elevato nella regione da 16 kHz rispetto ad altre regioni di frequenza (ANOVA a senso unico con il test post hoc di confronto multiplo di Dunnett; P < 0,01, n.6 orecchie). I dati sono espressi come la media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Analisi di ABR onda I ampiezza nei topi . (A) Rappresentante forma d'onda ABR da un topo C57BL/6J di 8 settimane esposto a uno stimolo di tono puro di 16 kHz ad un'intensità di 90 dB (insorgenza di stimolo a 0 ms). I numeri romani segnano le vette delle onde ABR. Linee punteggiate segnano l'onda I picco e depressione, che indica l'ampiezza. (B) Analisi quantitativa delle ampiezza dell'onda media I in risposta agli stimoli a 4, 8, 16, 32 e 48 kHz presentati a un livello di pressione sonoro di 90 dB. Le ampiezza ABR onda I erano più alte alla frequenza di 16 kHz e significativamente più basse ad altre frequenze (ANOVA unidirezionale con il test post hoc di confronto multiplo di Dunnett; : P < 0,01, n - 20 orecchie). I dati sono espressi come la media : SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Dal momento che la sinaptopatia cocleare è stata caratterizzata per la prima volta in topi adulti con uno spostamento di soglia temporanea (TTS) indotto da 8-u201216 kHz rumore della banda di ottava a 100 dB SPL per 2 h31, i ricercatori hanno sempre più studiato gli effetti della sinaptopatia in vari mammiferi, comprese le scimmie e gli esseri umani32,33. Oltre all'esposizione al rumore, sono state associate diverse altre condizioni alla sinaptopatia cocleare (ad esempio, l'invecchiamento, l'uso di farmaci ototossici e mutazioni genetiche), che ha portato all'interruzione a breve termine dell'audizione soprasoglia, seguita da degenerazione del nervo uditivo. Nella prima fase dell'insulto cocleare, la sinaptopatia si verifica spesso in una posizione di frequenza specifica, soprattutto nei modelli sperimentali in cui i danni alle sinapsi IHC sono limitati a determinate regioni di frequenza24,31. Pertanto, il nostro protocollo è significativo in quanto consente l'indagine della morfologia sinaptica e della funzione in una regione di frequenza specifica.

La mappa cocleare della frequenza del luogo può essere utilizzata per discriminare la normale e anomala funzione uditiva, riflettendo ulteriormente l'area normale e anomala nell'orecchio interno. Dal momento che le tecniche di preparazione della superficie sono state utilizzate per la prima volta per tracciare cellule ciliate intatte e mancanti nei diversi giri cocleari, il cocleogramma è diventato un metodo di routine per quantificare la perdita di cellule dei capelli6. Pertanto, per correlare gli insulti morfologici nella coclea ai cambiamenti fisiologici rilevanti, è ragionevole includere una mappa luogo-frequenza sul cocleogramma. Questo metodo permette di determinare il numero e la struttura delle sinapsi in base alle loro posizioni lungo la membrana basilare cocleare in relazione alle mappe cocleari di frequenza dei placeari cocleari stabilite, fornendo così informazioni sufficienti per confronti dettagliati tra esiti istologici e fisiologici. Tuttavia, alcuni studi valutano la sinaptopatia basata sul segmento cocleare o sulla distanza lungo il condotto cocleare, che non consente confronti diretti tra le cocleae individuali a causa delle variazioni intra-specie nella lunghezza della membrana basilare. Pertanto, è particolarmente importante standardizzare il cocleogramma convertendo singole lunghezze cocleari da millimetri a una percentuale relativa.

La sinaptopatia può essere confermata tramite la visualizzazione dell'immunostaining per la proteina CtBP2 (la isoforme sinaptica "ribeye") nelle regioni basolaterali degli IHC. Queste patch CBP2-positivi possono servire come un marcatore strutturale per la quantificazione dei nastri pressinaptici, e la presenza di meno patch di solito indica perdita pressinaptica. Anche se studi precedenti hanno riferito che il 98% dei nastri presinistici sono accoppiati con terminali post-sinaptici nell'orecchio normale30, il numero semplice di cerotti CBP2-positivi potrebbe non essere accurato per l'analisi quantitativa di sinapsi complete, in quanto può portare a una sopravvalutazione dei conteggi delle sinapsi nell'orecchio ferito coinvolgendo "orfani" (nastri presiltici non accoppiati con terminali post-naptici). Per migliorare l'accuratezza della stima del numero di sinapsi, vengono utilizzati anticorpi aggiuntivi contro la struttura post-sinaptica come GluA2, GluA2/3 o PSD-95. La proteina di densità postsinaptica PSD-95, una proteina di impalcatura della chinasi guanylate associata alla membrana (MAGUK), può essere etichettata utilizzando un anticorpo contro PSD-95, che è per lo più osservato nei contatti tra le cellule ciliate e le fibre SGN termina34, 35. Tuttavia, l'anticorpo contro GluR2 è più specifico per i recettori del glutammato ionorotropico di tipo AMPA nella membrana postsirata, che può identificare in modo più affidabile le sinapsi del nastro (coppie di immunofluorescenti puncta di CtBP2 presilnaptica e AgluR2)15 . Oltre all'analisi morfologica, l'analisi istologica delle sinapsi complete può essere utilizzata come indicatore funzionale della sinaptopatia. Nei topi adulti con sinaptopatia cocleare, riduzioni nell'anzessi ABR I ampiezza dopo la presentazione di stimoli tono da moderata ad alto livello si verificano a frequenze tonotopicamente correlate a regioni di perdita sinaptica26,29. I conteggi delle sinapsi ottenuti con questo metodo sono limitati in quanto ci vogliono circa 10 minuti per scansionare un sito sulla membrana basilare. Inoltre, per valutare le variazioni spaziali nel numero sinaptico e nella morfologia in base alla posizione Dell'IHC, è necessario identificare con precisione il confine del corpo ICH (ad esempio, tramite la colorazione della miosina VIIa) ed eseguire particolari passaggi di elaborazione delle immagini26 . Utilizzando tali metodi, studi precedenti hanno confermato che la perdita sinaptica è maggiore sul lato modiolare dell'IHC che sul lato del pilastro nei modelli animali di degenerazione indotta dal rumore26.

Studi precedenti hanno dimostrato che le fibre a basso tasso spontaneo e ad alta soglia sono più suscettibili ai danni al rumore rispetto alle fibre ad alto tasso spontaneo e a bassa soglia nei modelli animali di sinaptopatia limitata26,30. Questi studi forniscono la logica per l'utilizzo di ampiezze soprasoglia dell'onda ABR I (misurate utilizzando stimoli tono da moderati ad alti livelli) per valutare la funzione sinaptica nei modelli animali con soglia ABR normale e distorsione delle emissioni otoacustiche del prodotto ( DPOAE). Poiché l'onda I dell'ABR riflette le risposte neurali sommate delle fibre nervose uditive, quando la sinaptopatia viene valutata tramite l'ampiezza dell'onda ABR, il test DPOAE dovrebbe essere eseguito anche per escludere i danni OHC, che possono anche ridurre le ampiezza ABR dovute all'interruzione trasduzione meccanoelettrica. Anche se la prima ondata del potenziale di azione composta (CAP), che viene misurata da elettrodi a finestre rotonde, rappresenta anche l'attività sommata del nervo cocleare, questo metodo è più invasivo e complesso delle misurazioni ABR. Se le risposte DPOAE tornano alla normalità dopo spostamenti temporanei di soglia nei topi esposti al rumore31 o non si sono ancora deteriorati nei topi di invecchiamento29, l'ampiezza soprasoglia dell'onda ABR posso prevedere fortemente il grado di sinaptopatia cocleare , poiché i neuroni interessati vengono silenziati quando le loro connessioni sinaptiche agli IHC vengono interrotte. Tuttavia, se la sensibilità cocleare è ridotta a causa di vari fattori (ad esempio, disfunzione OHC), le diminuzioni nell'ampiezza dell'onda ABR I non possono più essere attribuite esclusivamente alla perdita sinaptica perché rifletteranno la combinazione di tutti i danni cocleari. Pertanto, sono necessarie condizioni sperimentali controllate per la preparazione del modello con restrizioni di sinaptopatia per garantire che la sensibilità cocleare non sia compromessa da altri fattori. Sfortunatamente, anche se l'ampiezza ABR wave I fornisce una misura oggettiva della perdita di fibre nervose uditive negli animali, è difficile da misurare negli esseri umani. Inoltre, patologie miste che coinvolgono sinaptopatia, perdita di cellule ciliate e la presenza di altre anomalie nella coclea possono co-verificarsi negli esseri umani, limitando l'uso di misurazioni di ampiezza dell'onda ABR I in contesti clinici. La latenza dell'onda ABR viene calcolata come tempo in millisecondi dall'inizio dello stimolo al picco positivo di ogni onda, fornendo informazioni sui tempi di trasmissione lungo il percorso uditivo. Non sono stati osservati cambiamenti significativi nella latenza dell'onda I nei modelli murini di sinaptopatia cocleare indotta dal rumore o legata all'età36. Tuttavia, alcune prove suggeriscono che gli effetti del rumore di mascheramento sulla latenza ABR wave V possono essere utilizzati per diagnosticare la sinaptopatia cocleare negli esseri umani37.

Diversi studi recenti hanno sostenuto l'idea che la sinaptopatia cocleare sia l'evento iniziale primario associato alla perdita uditiva nascosta, all'acutopismo e all'iperacusia. Anche se il concetto di sinaptopatia cocleare nelle malattie dell'orecchio interno è ormai saldamente stabilito, il suo impatto dettagliato sulla capacità uditiva rimane sconosciuto. Il protocollo presentato nell'attuale studio consente di studiare morfologia e funzione nelle sinapsi del nastro cocleare all'interno di una regione di frequenza specifica. Pertanto, questo protocollo può essere utilizzato per studiare la sinaptopatia cocleare, i suoi meccanismi sottostanti e l'efficacia di potenziali interventi terapeutici in vari modelli animali sperimentali.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030); il progetto di finanziamento congiunto della Beijing Natural Science Foundation e del Beijing Education Committee (K-201810025040); la Beijing Natural Science Foundation (7174291); e la China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

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References

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Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo
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Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).More

Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

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