Summary
الزرد المعدلة وراثيا lck:eGFP التعبير عن بروتينات فلورية خضراء عالية في الخلايا اللمفية تي، وقد استخدمت لدراسة التنمية الخلية T، وسرطان الدم الليمفاوي الحاد. يمكن استخدام هذا الخط للدراسة ب الخلايا، التي تعبر عن لك في المستويات الدنيا. ويصف هذا البروتوكول تنقية الخلايا ب الخبيثة وغير الخبيثة من الزرد lck:eGFP .
Abstract
الزرد (دانيو rerio) نموذج قوي لدراسة التنمية اللمفاويات. مثل الثدييات، تمتلك ريريو دال- المناعي التكيفي يشمل الخلايا الليمفاوية B و T. دراسات ليمفوبويسيس الزرد صعبة لأن الأجسام المضادة للاعتراف بعلامات سطح خلية ريريو دال- لا تتوافر عموما، تعقيد عزل وتوصيف للسكان اللمفاويات مختلفة، بما في ذلك النسب ب الخلايا. وكثيراً ما تستخدم خطوط المحورة وراثيا مع التعبير فلوروفوري الخاصة بالنسب للتحايل على هذا التحدي. السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP قد استخدمت لدراسة التنمية الخلية تي ريريو دال ، وقد استخدمت أيضا لنموذج التنمية الخلية T وسرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-الكل). على الرغم من أن الأسماك lck:eGFP قد استخدمت على نطاق واسع لتحليل T-النسب، فلا قد استخدمت لدراسة الخلايا باء. في الآونة الأخيرة، اكتشفنا أن العديد من الزرد ب الخلايا أيضا التعبير عن لك، أن كان ذلك في المستويات الدنيا. ونتيجة لذلك، وبالمثل الخلايا lck:eGFP ب التعبير عن المستويات المنخفضة للتجارة والنقل. وبناء على هذا الاستنتاج، قمنا بتطوير بروتوكول لتنقية الخلايا ب-النسب من الزرد lck:eGFP ، الذي يقدم لنا هنا. لدينا طريقة توضح كيفية الاستفادة خلية تنشيط الفلورسنت فارز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لتنقية الخلايا ب من أسماك lck:eGFP أو خطوط ذات الصلة، مثل rag2:hMYCمن المعدلة وراثيا مزدوجة؛ سمكة lck:eGFP . في هذه الأسطر، ب الخلايا، خلايا ب خاصة غير ناضجة، التعبير عن التجارة والنقل على مستويات منخفضة ولكن يمكن كشفها، السماح لهم بأن تميز من خلايا تي، التي تعبر عن بروتينات فلورية خضراء عالية. يمكن أن تكون الخلايا ب المعزولة من نخاع الغدة الصعترية، والطحال، والدم أو الأنسجة الأخرى. هذا البروتوكول يوفر طريقة جديدة لتنقية الخلايا ب ريريو دال ، تمكين الدراسات ركزت على مواضيع مثل التنمية الخلية ب وب اللمفاويات الأورام الخبيثة.
Introduction
وتقدم الزرد سمات قوية، مثل مانيبولابيليتي الجينية والخصوبة العالية والشفافية الضوئية والتنمية السريعة التي تسهل التنمية الفقاريات دراسة استخدام النهج الوراثية. هذه المزايا، جنبا إلى جنب مع الميزات المشتركة من هيماتوبويسيس تيليوست والثدييات، جعل ريريو دال- مثالية للتحليلات المجراة في الدالة ليمفوبويسيس واللمفاويات، من مظهرها أقرب في اليرقات طوال مرحلة البلوغ. يعتمد وضع الدم في الزرد مصانة جيدا العمليات الجينية المشتركة مع الثدييات، وهذه تشمل المناعي التكيفي. بالإضافة إلى ذلك، يحافظ الآليات الجزيئية التي تحكم التنمية اللمفاوية هي ملحوظ بين الزرد والثدييات1.
على مدى العقدين الماضيين، المعدلة وراثيا ريريو دال- خطوط الأنساب الدم محددة تسمية هذا وتم إنشاء خطوط المسخ ناقص في هذه الأنساب2،3،،من45. واحدة من هذه، السطر المعدلة وراثيا lck:eGFP ، يستخدم الزرد اللمفاويات بروتين تيروزين كيناز (لك) المروج لمحرك بروتينات فلورية خضراء التعبير6. ويسمح هذا الجين، التي يعبر عنها درجة عالية من السلائف تي-النسب والخلايا الليمفاوية T الناضجة، المجراة في تتبع التنمية الغدة الصعترية T الخلية والسابقين فيفو تنقية خلايا T-النسب بنظام مراقبة الأصول الميدانية7. سابقا، استخدمنا هذا الخط في شاشة ENU الطفرات وراثية إلى الأمام لتحديد طفرات germline المعرضة إلى T-جميع ودراسة الأحداث الوراثية المكتسبة سوماتيكالي مرتبطة بخلية T أونكوجينيسيس8،9.
في الآونة الأخيرة، تمديد مختبرنا فائدة الزرد lck:eGFP . في المعدلة وراثيا مزدوج rag2:hMYC (حركة البشرية)، ريريو دال lck:eGFP المعروفة بتطوير جميع تي 10، اكتشفنا أن النسب ب كل ما يحدث أيضا11. على عكس جميع تي في هذا النموذج الذي فلوريس الزاهية بسبب ارتفاع بروتينات فلورية خضراء التعبير، ب-جميع الخافتة فلوري بسبب انخفاض مستويات التجارة والنقل، مما يتيح الأسماك مع الجميع ب ينبغي تمييز صارخ من تلك مع تي للجميع مجهر فلوري. هذا التعبير بروتينات فلورية خضراء التفاضلية كما يسمح الفصل بين التجارة والنقل، لو ب-جميع الخلايا من بروتينات فلورية خضراءمرحبا تي-جميع الخلايا باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية11. وعلاوة على ذلك، التعبير منخفضة لك ليست فريدة من نوعها الزرد ب للجميع، الإنسان ب-جميع أيضا التعبير عن تدني مستويات لك11،12. وبالمثل، أعرب الخلايا ب-النسب الطبيعية ريريو دال، والفئران والبشر أيضا مستويات منخفضة من لك/لك/لك، مع خلايا ب غير ناضجة بعد11،التعبير أعلى13. على أساس كل خلية، أعرب الخلايا ب-النسب في خطوط الزرد أو مشتقات لكيجفب 1-10 ٪ قدر بروتينات فلورية خضراء كالخلايا اللمفية تي. هذه التجارة والنقللو خلايا مميزة صراحة مرناس بالخليه مثل pax5، cd79b، بلنك، btk، إيغم، إيغز، وغيرهم، ويمكن تنقيته من نخاع الغدة الصعترية, الطحال أو الطرفية 11من الدم. ولذلك، كلا ب-و T-النسب يمكن أن تكون الخلايا المعزولة من الزرد لكيجفب ، وفي حالة rag2hMYC، لكيجفب الحيوانات، والخلايا ب-T جميع وكذلك11.
هنا، نقدم لدينا بروتوكول لكفاءة تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية غير-ب الخلايا الخبيثة من الزرد lck:eGFP ، والخلايا ب غير خبيث أو خبيث من rag2hMYC؛ lck:eGFP الأسماك، باستخدام أنسجة مصدر مختلفة. وبالمثل يمكن قياس هذه الخلايا بالتدفق الخلوي دون عزل نظام مراقبة الأصول الميدانية، إذا رغبت في ذلك. اكتشاف انخفاض لك التعبير-ونتيجة لذلك، منخفضة تعبير بروتينات فلورية خضراء-ب الخلايا يفتح أبواباً جديدة من الاحتمالات التجريبية لكيجفب الزرد، مثل الخلية في فيفو ب الدراسات الإنمائية. وهكذا، قد هذا الخط المحورة وراثيا، ذكرت أول مرة في عام 2004، حياة جديدة ونحن نسعى إلى الاستفادة منها استخلاص أفكار جديدة بشأن الحصانة التكيفية الزرد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بموافقة جميع الإجراءات التي تنطوي على الزرد "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في مركز العلوم الصحية في جامعة أوكلاهوما.
1-عزل ب عدم الخبيثة والخلايا الليمفاوية T من المعدلة وراثيا lck:eGFP الأسماك
- تخدير الأسماك استخدام تريكيني 0.02% (MS-222) في الأسماك نظام المياه.
- فحص الأسماك 2-6 شهرا الفلورسنت تيمي، التي تقع في الجانب دورسوميديال في تجويف التطور الزرد وغيرها اريوكروماس14. استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي (470/40 الطول الموجي الإثارة وتصفية الانبعاثات 525/50) للكشف عن التجارة والنقل.
- إعداد مقدما 50 مل من تصفية تعقيم 1 × روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) التي تحتوي على 1% الجنين البقري المصل و 1% البنسلين-ستربتوميسين (الفرز وسائل الإعلام). ويمكن تخزين وسائط غير مستخدمة الفرز عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
- Euthanize السمك بوضعه في كوب يحتوي على 0.2% تريكيني لمدة حوالي 5 دقائق، تليها الغمر حمام الثلج. تأكيد وفاة بوقف حركة أوبيركولار (جيل).
- ضع السمك يوثانيزيد في طبق بتري وتشريح الأجهزة اللمفاوية للفائدة، باستخدام مجهر فلوري تشريح تيمي بروتينات فلورية خضراء+ 14، وإعدادات الحقل مشرق الفحص المجهري تشريح النخاع والطحال الكلي15. وتحققت النتائج المعروضة هنا باستخدام 3 أشهر الأسماك. نسب اللمفاويات والأرقام المطلقة تختلف حسب العمر والتركيب الوراثي (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل).
- ضع كل جهاز تشريح في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر من البرد الفرز وسائط الإعلام.
- مجانسة الأنسجة على استخدام الخالطون الصغرى-أنبوب مدقة الجليد.
- يمر النسيج المتجانس عامل تصفية شبكة 35 ميكرون لتوليد تعليق خلية مفردة. تبقى الخلايا على الجليد حتى التحليل.
2-عزل الخلايا الليمفاوية الخبيثة من المعدلة وراثيا مزدوج rag2:hMYC؛ lck:eGFP الزرد
-
ابتداء من 2-4 أشهر، مجهريا الشاشة rag2:hMYC؛ lck:eGFP الأسماك لأنماط التجارة والنقل غير طبيعي.
ملاحظة: ب الخلايا هي التجارة والنقل، لو في الخلفية lck:eGFP ، حيث ب للجميع يتطلب ممارسة الاعتراف؛ T-جميع من الواضح، نظراً لأن خلايا تي التجارة والنقلمرحبا. ونتيجة لذلك، rag2:hMYC، lck:eGFP الخط المزدوج وراثيا قد تعمل اثنين: الزاهية فلوري تي-جميع، التي عادة ما تنشأ من الغدة الصعترية وتمتد إلى الجسم، والخافتة فلوري ب-جميع.- استخدام مجهر فلوري، الشاشة الأسماك باستخدام إعدادات "التعرض المنخفضة" (200 مرض التصلب العصبي المتعدد، كسب 2.4 x) لتحديد مشرق تي للجميع (الشكل 1A) و "عالية التعرض" (1.5 s، كسب 3.4 x) لتحديد خافت للجميع ب (الشكل 1A). وقد يتحكم بالوزن والسمك ليوكيميك قبل بروتينات فلورية خضراء المترجمة فقط في الغدة الصعترية (الشكل 1B).
- تخدير وفحص الأسماك كما هو موضح في الخطوات 1، 1، 1-2.
- تصنيف الأسماك استناداً إلى مدى fluorescence التجارة والنقل، باستخدام نظام ثلاث من فئة بسيطة:
ملاحظة: مستوى 1: Fluorescence يظهر ورم الغدة الصعترية مع انتشار المحلية محدودة فقط.
مستوى 2: يظهر الأسفار خارج الغدة الصعترية، التي تشمل < 50% الجسم.
مستوى 3: Fluorescence تتجاوز 50% الجسم. - فصل الأسماك مع كل من تلك دون السرطان. رصد الأسماك ليوكيميك مسبقاً (أي، الأسماك دون أورام بروتينات فلورية خضراء+ ) مرة واحدة شهريا لوضع كل جديد. ~ 9 أشهر، كل rag2:hMYC، وضع الأسماك lck:eGFP تي للجميع، كل ب، أو كليهما.
- T أو ب كل خلية العزلة، حدد مستوى 3 الأسماك (التي تشمل جميع > 50% الجسم)، مما يسفر عن أكثر من 2 × 106 كافة الخلايا، وعادة الكثير.
- Euthanize الأسماك كما في الخطوة 1، 4.
ملاحظة: هناك طريقتان للحصول على كافة الخلايا: الجسم كله التجانس و تقنية غسيل البريتوني16. تختلف الطرق في العدد المطلق للخلايا التي يتم جمعها للفرز، وهكذا، الكميات من نظام مراقبة الأصول الميدانية الوقت المطلوب والتكاليف (انظر مناقشة لمزيد من التفاصيل). - أما الأسلوب، أولاً ضع الأسماك يوثانيزيد في طبق بتري واستخدام شفرة حلاقة، إزالة الرأس بما في ذلك منطقة الغدة الصعترية. وهذا يمكن معالجته بشكل منفصل، إذا رغبت، أو تستخدم لتلطيخ نسيجية.
-
طريقة الغسيل البريتوني
- استخدام ماصة P1000، يغسل التجويف الصفاقى الأسماك مع 500 ميليلتر من البرد الفرز وسائط الإعلام، وجمع الخلايا ووسائط الإعلام في أنبوب 5 مل.
- استخدام تلميح ماصة طازجة، حقن ميليلتر إضافية 200-300 من وسائل الإعلام الفرز الباردة في تجويف الجسم. ثم قم باستخدام تلميح الماصة، تطبيق ضغط لطيف على الجسم الأسماك لقذف الخلايا خارج تجويف الجسم. جمع هذه الوسائط، وإضافة إلى الأنبوب 5 مل.
- كرر الخطوة 2.8.2 2 – 3 مرات. تبقى الخلايا التي تم جمعها في فرز وسائل الإعلام على الجليد.
- تصفية تعليق خلية على الرغم من 35 ميكرون تصفية قبل التدفق الخلوي/نظام مراقبة الأصول الميدانية وإبقاء الخلايا على الجليد حتى التحليل.
-
تجانس الجسم كله
- بعد إزالة رأس السمك، ضع الجسم في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 200 ميليلتر لفرز وسائل الإعلام.
- مجانسة نص باستخدام الخالطون الصغرى-أنبوب مدقة.
- إضافة ميليلتر 300 إضافية من البرد الفرز وسائط الإعلام. تصفية تعليق الخلية على الرغم من أن عامل تصفية شبكة 35 ميكرون. إضافة وسائط الفرز حسب الحاجة لغسل كافة الخلايا عن طريق التصفية، حتى تبقى فقط الأنسجة الحطام على التصفية. تبقى الخلايا على الجليد حتى التحليل.
3-سيتوميتريك تحليل الخلايا الليمفاوية ب العادي أو خبيثة
- تعيين تحليل تدفق سيتوميتريك و/أو معلمات نظام مراقبة الأصول الميدانية وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة.
-
الحصول على العدد المطلوب من الأحداث في البداية وصف العينة. تحليل 1 × 104 إلى 5 × 104 الأحداث قبل الفرز لتحديد منافذ محددة لخطوات الفرز اللاحقة.
- تحديد بوابات: تعريف بوابات الخلية اللمفاويات والسلف باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) ومعلمات مبعثر (SSC) الجانب، باستثناء الحطام الخلوية (الشكل 2 أ-ج)17. منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب تتوافق مع حجم الخلية/القطر والتفاصيل، على التوالي.
ملاحظة: –التجارة والنقل والتجارة والنقل، لووبروتينات فلورية خضراءمرحبا خلايا تختلف 10-إلى-100-إضعاف من حيث قوتها fluorescence بروتينات فلورية خضراء، مما يجعل الفصل بين هؤلاء السكان مباشرة (الأرقام 2-5). ويمكن تقييم التمييز الميت يعيش في هذه المرحلة باستخدام اليود propidium (PI) أو 7-أمينواكتينوميسين د (7-اعتبر) صلاحية تلطيخ. عادة ما تثبت التجارب السابقة مع بي > صلاحية 95% من التجارة والنقل+ الخلايا بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية. - استبعاد دوبليتس الخلية، وفقا لمعلمات نظام مراقبة الأصول الميدانية الجهاز قيد الاستخدام.
- ضمن أبواب اللمفاوية و/أو السلائف، تحديد العدد والنسبة المئوية للخلايا بروتينات فلورية خضراء+ .
- تحديد بوابات: تعريف بوابات الخلية اللمفاويات والسلف باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) ومعلمات مبعثر (SSC) الجانب، باستثناء الحطام الخلوية (الشكل 2 أ-ج)17. منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب تتوافق مع حجم الخلية/القطر والتفاصيل، على التوالي.
- استخدام فيكوريثرين (PE) وكثافة التجارة والنقل، وتعريف بوابة للتجارة والنقل– مقابل بروتينات فلورية خضراءلو مقابل بروتينات فلورية خضراءمرحبا الخلايا.
ملاحظة: يحمل الخلايا ب الفلورية بروتينات فلورية خضراء قاتمة وإظهار خلايا تي بروتينات فلورية خضراء مشرقة في خطوط lck:eGFP . تحتوي العديد من الأجهزة اللمفاوية أو عينات الورم كل السكان التجارة والنقل+ . ب-النسب هي خلايا/ب-جميع بروتينات فلورية خضراءلو تي-النسب خلايا/تي-جميع وبروتينات فلورية خضراءمرحبا. تعريف البوابات للتمييز بين التجارة والنقل–والتجارة والنقل، لو، والتجارة والنقلمرحبا الخلايا، وجمع هؤلاء السكان بشكل منفصل (الشكل 2 أ-جو الشكل 3 ألف-ج، الشكل 4A و الشكل 5A). - فرز كل سكان الخلية إلى أنابيب البولي بروبلين مختلفة 15 مل يحتوي على 2 مل من فرز وسائل الإعلام أو مباشرة إلى أنابيب مختلفة 1.5 مل يحتوي على مخزن مؤقت مناسب لإجراء تحاليل إضافية (مثلاً، الجيش الملكي النيبالي، والحمض النووي، أو استخراج البروتين، في زرع الو، إلخ.).
- تبقى الخلايا المنقي على الجليد قبل مزيد من التحليلات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا باستخدام التدفق الخلوي لتحليل ونظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بروتينات فلورية خضراءلو وبروتينات فلورية خضراءمرحبا خلايا من الغدة الصعترية ونخاع الكلي والطحال من الزرد lck:eGFP المعدلة وراثيا. وكشف تحليل الأسماك عمره 3 أشهر الغدة الصعترية الوارد معظمها بروتينات فلورية خضراء+ لمفاوية. بروتينات فلورية خضراء+ الخلايا اقتصرت إلى حد كبير على بوابة اللمفاوية الموصوفة سابقا Traver et al.17. ويمكن ملاحظة اثنين متميزة بروتينات فلورية خضراء+ السكان والتجارة والنقل، لووبروتينات فلورية خضراءمرحبا، في الغدة الصعترية. مرحبا لمفاوية بروتينات فلورية خضراء تمثل نسبة مئوية أعلى، ~ 60%، بينمالو الخلايا بروتينات فلورية خضراء وفيرة أقل، تمثل ~ 40% من مجموع الخلايا الليمفاوية الغدة الصعترية (الجدول 1). خلافا للثدييات، وهو مترجم نخاع الأسماك المكونة للدم داخل الكلي، وليس داخل العظام. نحن تحديد الخلايا ب المقيمين في الكلي نخاع أيضا التعبير عن انخفاض مستويات التجارة والنقل (الشكل 2B و الشكل 3). بروتينات فلورية خضراءلو الخلايا في نخاع كانت وفيرة، في حين بروتينات فلورية خضراءمرحبا الخلايا النادرة (الشكل 2B و الشكل 3B))، التي تشير إلى أن نسبة صغيرة من الخلايا اللمفية تي كانوا حاضرين في النخاع في غضون 3 أشهر عمر. وبالمثل أظهرت عينات الطحال أعلى النسب المئوية للتجارة والنقل، لو من بروتينات فلورية خضراءمرحبا الخلايا (الشكل 2 و الشكل 3). ونحن أيضا تحليل الخلايا اللمفية غير خبيث من الغدة الصعترية والنخاع والطحال من الزرد المعدلة وراثيا مزدوج lck:eGFP؛ rag2:hMYC ، التي عرضه لكل ب وكل تي11. في الأسماك التي لم تتطور جميعا، كانت النتائج من نخاع الغدة الصعترية والطحال مماثلة للأسماك المعدلة وراثيا واحد lck:eGFP . ومع ذلك، تم إعداد الخلايا الليمفاوية في الجهاز زاد (الشكل 3)، يفترض أنه بسبب التوسع يحركها حركة السكان ب وخلية T غير الناضجة التي تنشط فيها المروج rag2 .
ونحن أيضا تحليل الأسماك المحورة وراثيا مزدوجة مع (ب) و/أو تي-كل ذلك قد وضعت سرطانات الفلورسنت قبل 6 أشهر. وكما هو متوقع، ب-جميع الأسماك بشكل خافت فلوري سرطانات الوارد معظمها بروتينات فلورية خضراءلو الخلايا (الشكل 4 أ). على النقيض من ذلك، يمكن إيواء الأسماك الزاهية فلوري أما معزولة للجميع تي أو مختلطة السكان من كلا بروتينات فلورية خضراءلو ب للجميع والتجارة والنقلمرحبا تي-جميع الخلايا (الشكل 5). مثال مختلطة الجميع، الذي يحتوي على كل ب وتي متميزة، ويظهر هنا (الشكل 5). للتأكد من هويات بروتينات فلورية خضراءلو وبروتينات فلورية خضراءمرحبا الخلايا كالنسب ب و T، على التوالي، قمنا بتحليل النصوص الخاصة ب و T الخلية بالكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR). النتائج التي توصلنا إليها تظهر بروتينات فلورية خضراءلو الخلايا التعبير عن مستويات أعلى الخلية بالنصوص وبروتينات فلورية خضراءمرحبا الخلايا التعبير عن مستويات أعلى من جينات الخلية T (الشكل 2Dو الشكل3Dو الشكل4B و الشكل 5B). وعلاوة على ذلك، التعبير لك و التجارة والنقل في التجارة والنقل، لو كل تناظر fluorescence بروتينات فلورية خضراء قاتمة في فيفو للجميع ب (الشكل 2D،3Dمن الشكل، الشكل4B و الشكل5 (ب)؛ بكر قرت الشروط والإشعال متواليات الموصوفة سابقا قبل بورجا et al.) 11.
الشكل 1: أنماط fluorescence متميزة في الأسماك المحورة وراثيا lck:eGFP . (أ) الفحص المجهري نيون الصور من الأسماك rag2:hMYC؛ lck:eGFP مع الزاهية فلوري تي-الكل (إلى اليسار) أو الخافتة فلوري ب-جميع (يمين). T-جميع مرئياً مع إعدادات التعرض المنخفضة؛ ب-جميع يمكن رؤية فقط استخدام التعرض العالية. إظهار إعدادات التعرض العالية (ب) الأسفار الغدة الصعترية باهتة (الدوائر الصفراء) في الأسماك البرية من نوع lck:eGFP (يسار) والأسماك المحورة وراثيا مزدوج rag2:hMYC؛ lck:eGFP دون جميع (يمين). تغيير حجم أشرطة = 20 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: السكان اللمفاويات في الزرد lck:eGFP . الصور في الأعلى تظهر WT 3 أشهر، الأسماك lck:eGFP مع إعدادات التعرض الشديد أو الارتقاء بجهاز الكمبيوتر (لتسهيل التصور). تغيير حجم أشرطة = 20 مم. تدفق سيتوميتريك تحاليل الغدة الصعترية (A)، ونخاع (ب)، والطحال (ج). تظهر لوحات اليسار منتدى التعاون الأمني محور (س) والجنوب (المحور الصادي)، مع الأشكال البيضاوية السوداء التي تشير إلى بوابات اللمفاويات. تصوير لوحات الأوسط المستندة إلى الأسفار النابضة بالتجارة والنقل (المحور السيني) وبي (المحور الصادي). يتم إظهار بروتينات فلورية خضراءمرحبا (المستطيل الأزرق)، والتجارة والنقل، لو (المستطيل الأخضر) والتجارة والنقل– (الأشكال البيضاوية السوداء) السكان. لوحات حق عرض رسوم بيانية للتجارة والنقلمرحبا والتجارة والنقل، لو الخلايا. تشير الخطوط المتقطعة إلى معايير النابضة في لوحات الأوسط. (د) WT lck:eGFP تيمي فرزها للتجارة والنقلمرحبا (الأزرق) والتجارة والنقل، لو (أخضر). التعبير عن الجين الخلية ب (pax5)، الجينات الخاصة بخلية T (cd4))، ولك و التجارة والنقل. النتائج يتم تطبيع للجينات التدبير المنزلي (β-أكتين و eef1a1l1) وسيظهر كحظيرة-تغير ± "الخطأ القياسي" (S.E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اللمفاويات السكان في الزرد قبل ليوكيميك rag2:hMYC؛ lck:eGFP - إظهار الصور في أعلى 3-شهر-الأسماكrag2:hMYC القديمة؛ و lck:eGFP مع التعرض العالية والمزودة بجهاز الكمبيوتر. شريط مقياس = 20 مم-يصور لوحات أجزاء د في شكل مطابق الرقم 2. (د) التعبير عن pax5و خلايا cd4و لك، و التجارة والنقل في تنقية نظام مراقبة الأصول الميدانية الغدة الصعترية بروتينات فلورية خضراءلو (الأخضر) بروتينات فلورية خضراءمرحبا (أزرق) خلية السكان من الأسماك lck:eGFP . يتم إظهار النتائج قرت PCR كحظيرة-تغير ± المطران الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تحليل ب-جميع الأسماك المحورة وراثيا rag2:hMYC؛ lck:eGFP - (أ) أعلى: الأسماك عمره 6 أشهر rag2:hMYC؛ lck:eGFP مع استخدام الإعداد التعرض الشديد للجميع ب. تحليل سيتوميتريك تدفق الخلايا السرطانية المعزولة من جسم الأسماك شكل مطابق الرقم 2. (ب) التعبير الجيني في "التجارة والنقل" ب-جميعلو خلايا (البوابة الخضراء في الشكل 4A) و rag2:hMYC؛ lck:eGFP بروتينات فلورية خضراءمرحبا الثيموسيه (البوابة الزرقاء في الشكل 3 ألف)، و "التجارة والنقل" تي-جميعمرحبا الخلايا (بوابة زرقاء في الشكل 5A ). التعبير ب (pax5، cd79a) والجينات الخاصة بخلية T (cd4) و لك، و التجارة والنقل. النتائج يتم تطبيع للجينات التدبير المنزلي (β-أكتين و eef1a1l1) وسيظهر كحظيرة-تغير ± مقياس المطران بار = 20 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل مختلطة جميع rag2:hMYC؛ lck:eGFP الأسماك المحورة وراثيا- (أ) أعلى: الأسماك 6 أشهر rag2:hMYC؛ lck:eGFP مع مختلطة-جميع استخدام الإعداد التعرض العالية. تحليل سيتوميتريك تدفق الخلايا السرطانية المعزولة من جسم الأسماك شكل مطابق الرقم 2. (ب) بروتينات فلورية خضراءمرحبا (الأزرق) والتجارة والنقل، لو (الأخضر) نظام مراقبة الأصول الميدانية غيتس. التعبير ب (pax5، cd79a) والجينات الخاصة بخلية T (cd4) و لك، و التجارة والنقل. النتائج يتم تطبيع للجينات التدبير المنزلي (β-أكتين و eef1a1l1) وسيظهر كحظيرة-تغير ± مقياس المطران بار = 20 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن البلدان المتقدمة النمو ويوفر بروتوكول لعزل الخلايا ب من lck:eGFP المعدلة وراثيا الزرد، إضافة إلى نماذج أخرى ريريو دال- ب-النسب التسميات3،4هذا. بعض الشيء المثير للدهشة، ذهبت دون أن يلاحظها أحد تحديد بروتينات فلورية خضراءلو ب الخلايا في هذا الخط منذ الوصف الخاص به في عام 2004. يعتبر عموما، لك أن تي خلية على حدة6، ولكن الدراسات الأخيرة وجدت التعبير غير متوقعة لك قبل القاتل الطبيعي والنقوي الخلايا، كذلك كما هو الحال في الخلايا ب كما هو موضح هنا18،19. الاتفاق مع اكتشاف لدينا أن الخلايا الزرد ب بروتينات فلورية خضراءلو، ب ما قبل، السذاجة وناضجة ب الخلايا في البشر كما نعرب عن مستويات منخفضة من لك11،13.
نظراً لاختلاف مستويات التجارة والنقل في خلايا B و T من هذه الأسماك، يمكن الخلايا من كلا الأنساب الآن معزولة من هذا الخط. على الرغم من أن تقليديا قد استخدمت هذه الحيوانات لدراسة التنمية الغدة الصعترية تي اللمفاويات وتتبع، نبدي أن دراسات مماثلة أيضا ممكنة مع خلايا ب. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن تحديد ب الخلايا في نخاع الكلي، الغدة الصعترية والطحال هنا، وفي الدم المحيطي وفي أماكن أخرى في الأعمال السابقة11.
وإذ تسلم بكل ب في rag2:hMYC؛ lck:eGFP الأسماك يتطلب حرص عين، ولكن مع الممارسة، واضح ومباشر. بعد ذلك، اختيار الطريقة التي يجب استخدامها لتنقية كافة الخلايا هي الحاسمة. هنا، نحن نقدم طريقتين: الغسيل البريتوني وتجانس الجسم بأكمله. الغسيل البريتوني غلة عددا أقل من مجموع الخلايا، لكن نسبة عالية جداً من الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ . ونتيجة لذلك، سوى القليل من الوقت نظام مراقبة الأصول الميدانية مطلوب، التقليل إلى أدنى حد من التكلفة. لتطبيقات المصب، حيث العائد الإجمالي أقل أهمية (مثلاً، قرة-PCR)، وهذا أكثر كفاءة. بدلاً من ذلك، تجانس الجسم كله ينتج أكبر تعليق خلية واحدة تحتوي على العديد من خلايا أكثر، ولكن نسبة أقل من الخلايا سوف تكون بروتينات فلورية خضراء+. وهكذا، مطلوب المزيد من الوقت نظام مراقبة الأصول الميدانية لجمع نفس العدد من الخلايا بروتينات فلورية خضراء+ كما يمكن أن تكون تنقية خلايا أكثر مع الغسيل البريتوني، ولكن الملايين. الدراسات المصب، حيث مهم عالية الغلة (مثلاً الغربية وصمة عار)، وهذا قد يعوض التكلفة المضافة. وبالإضافة إلى ذلك، لكافة الدراسات وتجانس مجموع الجسم يلتقط تنوع الخلايا السرطانية الحالية، أكثر دقة تمثل التغاير الورم. على الرغم من أن غير مدرجة في بروتوكول لدينا، من الممكن أيضا تشريح فقط التجارة والنقل+ المناطق/أجهزة الجسم من الأسماك مع الجميع لتحقيق التجانس تنميق في طبق بتري، مما يخفض مجموع الوقت نظام مراقبة الأصول الميدانية والتكلفة، شبيهة بالغسيل البريتوني.
الغدة الصعترية تعبير بروتينات فلورية خضراء في الأسماك lck:eGFP أظهرت أن بروتينات فلورية خضراء قابلاً للاكتشاف المبكر ك إدارة الشرطة الاتحادية 56. لدينا دراسات هنا أجريت في الأسماك الكبار 3 أشهر من العمر أو أكثر، وتبين أن في هذا العصر، خلايا ب وفيرة في نخاع الكلي والطحال ولكن خلايا تي نادرة. الدراسات اللاحقة بالأسماك من مختلف الإعمار ستكون مطلوبة تحديد ما إذا كانت خلايا T أكثر انتشارا في نقاط زمنية مختلفة. وبالمثل، في 3 أشهر، يتم إثراء خلايا تي في الغدة الصعترية، لكن عددا كبيرا من الخلايا ب الغدة الصعترية موجودة أيضا. إذا كان هؤلاء السكان اللمفاويات تختلف في مختلف الإعمار حاليا غير معروف، ولكن الأسفار عموما، والغدة الصعترية يتلاشى في الأسماك lck:eGFP بدءاً من مرحلة النضج الجنسي (~ 3 أشهر)، ولذلك فمن المحتمل أن تقلل إعداد الخلايا T مع زيادة العمر، وقد الخلايا ب أيضا. وبالمثل، عند استعمار بروتينات فلورية خضراءلو ب خلايا الغدة الصعترية الزرد غير معروف حاليا. استخدام الأسماك lck:eGFP ، من الممكن الآن لرصد التنمية ب وخلية T الغدة الصعترية، تدفق، افلوكس، وحركية محددة لهذه الأحداث. وباﻹضافة إلى ذلك، مثل هذه الأسئلة تتصل أيضا بالمواقع التشريحية الأخرى التي يقيم فيها ب الخلايا، مثل نخاع الكلي والطحال والدم والأمعاء (البيانات لا تظهر).
إلى جانب خلية بالدراسات الإنمائية، وجدنا في الآونة الأخيرة ب-جميع في lck:eGFP؛ rag2:hMYC الأسماك المحورة وراثيا المزدوجة11. المعدلة وراثيا rag2:hMYC كان معروفا للحث على T-كل10 ولكن قد ذهب ب-جميع غير المعترف بها. سبب بينيترانسي العالية لهذا السرطاني، وكلا النوعين من جميع تنتشر في هذه الأسماك، ووضع العديد من الأسماك فعلا على حد سواء في وقت واحد جميع أنواع11. منذ ب-كل من التجارة والنقل، لو، بينما تي للجميع التجارة والنقلمرحبا، متفاوتة التعبير بروتينات فلورية خضراء يسمح هذان الكيانان تكون معزولة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية، حتى عندما تحدث في نفس الحيوان (الشكل 5A). من الأهمية بمكان في الخلايا اللمفية العادية والخبيثة على حد سواء، تثبت قرة-بكريسولتس أن بروتينات فلورية خضراءلو ومرحبا الخلايا بروتينات فلورية خضراء دائماً تتوافق مع ب-و T-الأنساب، على التوالي (الشكل 2 و الشكل 3).
وكانت الإمكانات غير المستغلة للأسماك lck:eGFP المركزية لهذا العمل، وتسليط الضوء على حقيقة أن العديد من خطوط المعدلة وراثيا موجودة مسبقاً المحتمل لها فائدة تتجاوز الغرض المقصود منها. هنا، نحن نقدم بروتوكول رواية لعزل الخلايا B و T من ريريو دال- مع lck:eGFPمن المعدلة وراثيا، فتح الباب أمام سبل الفحص جديدة فيما يتعلق بالخلايا الليمفاوية ب العادية والخبيثة. نتائج هذه الدراسات سوف لا شك في أن إعادة تنشيط ما قد تم بالفعل مصدرا قيماً هيماتوبويسيس وليمفوبويسيس، وحقول بيولوجيا السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر ميغان مالون-بيريز للرعاية الزرد، ولب أووهسك التدفق الخلوي. وأيد هذا العمل منح مقدمة من شركة هيونداي الأمل على عجلات، مركز أوكلاهوما للنهوض بالعلم والتكنولوجيا (HRP-067)، جائزة مشروع تجريبي "إينبري" المعاهد الوطنية للصحة/نيجمس (P20 GM103447). جكف يحمل إيل & ثلما جايلورد هبت الرئاسة في طب أمراض الدم-علم الأورام مؤسسة مستشفى للأطفال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
