Summary
Transgenen Lck:eGFP Zebrafisch express GFP hoch in T-Lymphozyten und wurden verwendet, um die T-Zell-Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie zu studieren. Diese Linie dient zur Studie B-Zellen, die Lck auf den unteren Ebenen zum Ausdruck bringen. Dieses Protokoll beschreibt Reinigung von malignen und nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch.
Abstract
Zebrafisch (Danio Rerio) sind ein leistungsfähiges Modell Lymphozyten Entwicklung zu studieren. Wie bei Säugetieren besitzen D. Rerio einen adaptiven Immunsystems, die B- und T-Lymphozyten enthält. Studien der Zebrafisch Lymphopoiese sind schwierig, weil Antikörper D. Rerio Zelle Oberflächenmarker zu erkennen in der Regel nicht verfügbar sind, erschweren, Isolierung und Charakterisierung von verschiedenen Lymphozyten Bevölkerungsgruppen, einschließlich B-Linie Zellen. Transgene Linien mit Abstammung-spezifische Fluorophor Ausdruck werden häufig verwendet, um diese Herausforderung zu umgehen. Die transgenen Lck:eGFP -Linie wurde verwendet, um D. Rerio T-Zell-Entwicklung zu studieren und auch für Modell T Zelle Entwicklung und akute lymphoblastische Leukämie (T-ALL) verwendet worden. Obwohl Lck:eGFP Fisch allgemein verwendet wurden, um die T-Linie zu analysieren, wurden sie nicht zur B-Zellen zu studieren. Vor kurzem entdeckten wir, dass viele Zebrafisch B Zellen Lck, auch zum Ausdruck bringen, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau. Infolgedessen express Lck:eGFP B-Zellen ebenfalls niedrige Konzentrationen von GFP. Ausgehend von dieser Feststellung, entwickelten wir ein Protokoll, um die Zellen der B-Linie von Lck:eGFP Zebrafisch, reinigen, das wir hier berichten. Unsere Methode beschreibt, wie Sie einen Leuchtstoff-activated Cell Sorter (FACS) B-Zellen aus Lck:eGFP Fisch oder verwandte Linien, wie Doppel-transgenen Rag2:hMYCzu reinigen zu nutzen; LCK:eGFP Fisch. In diesen Zeilen, B-Zellen, insbesondere unreife B-Zellen, ausdrückliche GFP auf niedrig aber nachweisbar Ebenen, so dass sie zu unterscheiden von T-Zellen, die GFP hoch zum Ausdruck zu bringen. B-Zellen können von Knochenmark, Thymus, Milz, Blut oder anderen Geweben isoliert werden. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode um D. Rerio B-Zellen, Studien zu Themen wie Entwicklung von B-Zellen und B-Lymphozyten maligne Erkrankungen konzentriert zu reinigen.
Introduction
Zebrafisch bieten leistungsfähige Attribute, z. B. genetischen Manipulierbarkeit, hohe Fruchtbarkeit, optische Transparenz und schnelle Entwicklung, die studiert vertebrate Entwicklung mit gentechnische Ansätze ermöglichen. Diese Vorteile zusammen mit der Gemeinsamkeiten der teleost und Säugetieren Hämatopoese machen D. Rerio ideal für in-vivo-Analysen von Lymphopoiese und Lymphozyten Funktion, von ihren ersten Auftritt in Larven im gesamten Erwachsenenalter. Blut-Entwicklung im Zebrafisch stützt sich auf gut erhaltenen genetische Prozesse, die mit Säugetieren geteilt werden, und diese erstrecken sich auf das adaptive Immunsystem. Darüber hinaus sind molekulare Mechanismen für lymphoide Entwicklung bemerkenswert zwischen Zebrafisch und Säugetiere1konserviert.
In den letzten 2 Jahrzehnten transgenen D. Rerio Linien dieses Label bestimmte Blut Linien und mutierte Linien einen Mangel an diesen Linien2,3,4,5erstellt wurden. Eine davon, die Lck:eGFP transgene Linie verwendet den Zebrafisch Lymphozyten Protein Tyrosin-Kinase (Lck) Projektträger GFP Ausdruck6fahren. Dieses Gen, das von T-Linie Vorstufen und Reifen T-Lymphozyten hoch zum Ausdruck kommt, kann in-vivo Verfolgung der Zebrafischembryonen T-Zell-Entwicklung und ex-Vivo-Reinigung der T-Linie Zellen durch FACS-7. Früher wir diese Linie in einem vorwärts-genetische ENU Mutagenese Bildschirm Keimbahn Mutanten anfällig für T-ALL zu identifizieren und somatisch erworbenen genetischen Veranstaltungen im Zusammenhang mit T-Zell Onkogenese8,9zu studieren.
Vor kurzem hat unser Labor das Dienstprogramm Lck:eGFP Zebrafisch weiter ausgebaut. In Doppel-transgenen Rag2:hMYC (menschliches MYC), Lck:eGFP D. Rerio , die bekanntermaßen T-ALL 10, entwickeln wir entdeckt, dass B-Linie alle11auch auftreten. Im Gegensatz zu T-ALL in diesem Modell hell durch hohe GFP Expression fluoreszieren, B-ALL sind schwach-Leuchtstofflampen aufgrund des niedrigen GFP, so dass Fische mit B-ALL zu unterscheiden grob mit T-ALL mit Fluoreszenz-Mikroskopie. Diese differentielle GFP Expression ermöglicht auch die Trennung der GFPlo B-alle Zellen von GFPHallo T-ALL-Zellen mittels FACS11. Niedrige Lck Ausdruck ist übrigens nicht als menschliche B-ALL auch express niedrige Konzentrationen von LCK11,12Zebrafisch B-ALL, einzigartig. Ebenso normale Zellen der B-Linie von D. Rerio, Mäusen und Menschen auch niedrige Konzentrationen von Lckausdrücken /GLK/LCKmit unreifen B-Zellen mit den höchsten Ausdruck11,13. Auf einer Basis pro Zelle express B-Linie Zellen LckeGFP Zebrafisch oder Derivat Zeilen 1-10 % soviel GFP als T-Lymphozyten. Diese GFPlo ausdrückliche Merkmal B-Zell-mRNAs wie pax5, cd79b, Blnk, Btk, Ighm, Ighzund andere Zellen, und kann aus Knochenmark, Thymus, Milz oder peripheren gereinigt werden Blut-11. Daher isoliert beide B - und T-Linie Zellen aus LckeGFP Zebrafisch und im Falle von rag2hMYC, LckeGFP Tiere, B - und T-alle Zellen sowie11.
Hier präsentieren wir unsere Protokoll effizient FACS reinigen nicht-malignen B-Zellen aus Lck:eGFP Zebrafisch und nicht-bösartigen oder malignen B-Zellen der rag2hMYC; LCK:eGFP Fisch, mit verschiedenen Quelle Gewebe. Solche Zellen können ebenso durch Durchflusszytometrie ohne FACS Isolierung, quantifiziert werden, falls gewünscht. Entdeckung der niedrigen Lck Ausdruck- und folglich niedrigen GFP Expression-durch B Zellen öffnet neue Türen der experimentellen Möglichkeiten für LckeGFP Zebrafisch, wie z. B. in Vivo B Zellen-Studien. So hat dieser transgenen Linie, erstmals im Jahr 2004 berichtet neues Leben wie wir es um neue Erkenntnisse über Zebrafisch adaptive Immunität aufzulesen nutzen wollen.
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Protocol
Alle Verfahren im Zusammenhang mit Zebrafisch stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. nicht-malignen B und T-Lymphozyten aus transgenen Lck:eGFP Fische isolieren
- Den Fisch mit 0,02 % Tricaine (MS-222) im System Fischwasser zu betäuben.
- 2 – 6 Monate alten Fisch für fluoreszierende Thymi an der Dorsomedial Aspekt der Kiemen Hohlraum der Zebrafisch und anderen umkonstruiert14befinden zu untersuchen. Verwenden Sie eine Epifluoreszenz-Mikroskop (470/40 Erregung Wellenlänge und 525/50 Emission Filter), GFP zu erkennen.
- 50 mL von Filter-sterilisierte 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit 1 % fetalen bovine Serum und 1 % Penicillin-Streptomycin (Sortierung Medien) im Voraus vorbereitet. Nicht verwendete Sortierung Datenträger können für bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahrt werden.
- Die Fische einzuschläfern, indem man sie in einen Becher mit 0,2 % Tricaine für ca. 5 min, gefolgt von Eis Bad eintauchen. Tod von der Einstellung der Kiemendeckel (Gill) Bewegung zu bestätigen.
- Legen Sie den euthanasierten Fisch in einer Petrischale und sezieren Sie lymphatischen Organe des Interesses, das fluoreszierende Mikroskop sezieren die GFP+ Thymi14und Hellfeld Mikroskopie Einstellungen an der Niere Knochenmark und Milz15sezieren zu. Hier präsentierten Ergebnisse wurden mit 3 Monate alten Fisch. Lymphozyten Proportionen und absoluten Zahlen variieren je nach Alter und Genotyp (siehe Diskussion für weitere Details).
- Legen Sie jedes seziert Organ in einer 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL des kalten Medien sortieren.
- Das Gewebe auf Eis mit ein Stößel-Mikro-Schlauch-Homogenisator zu homogenisieren.
- Ein Siebfilter 35 µm, eine einzelne Zelle Aussetzung zu generieren durchlaufen Sie homogenisierte Gewebe. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.
2. Isolierung bösartigen Lymphozyten aus Doppel-transgenen Rag2:hMYC; Lck:eGFP Zebrafisch
-
Bildschirm ab 2-4 Monate, mikroskopisch Rag2:hMYC; LCK:eGFP Fisch für abnorme GFP-Muster.
Hinweis: B-Zellen sind GLPlo in Lck:eGFP Hintergrund, so dass B-ALL Praxis erfordert anzuerkennen; T-ALL ist offensichtlich, da T-Zellen GFPHallosind. Infolgedessen hat die Rag2:hMYC, Lck:eGFP Dual-transgene Linie zwei Phänotypen: hell-Leuchtstofflampen T-ALL, die in der Regel ergeben sich aus dem Thymus und erweitern in den Leib und schwach Leuchtstoff B-ALL.- Den Fisch mit "niedrigen" Belichtungseinstellungen (200 ms, 2,4 X Gain), helle T-ALL (Abbildung 1A) und "hohe Exposition" identifizieren Bildschirm mit einem Fluoreszenz-Mikroskop (1,5 s, 3,4 X Gain), dim B-ALL (Abbildung 1A) zu identifizieren. WT-Kontrollen und Pre-leukämischen Fische haben GFP nur im Thymus (Abbildung 1 b) lokalisiert.
- Zu betäuben Sie, und untersuchen Sie die Fische wie in 1.1 – 1.2 beschrieben.
- Kategorisieren Sie die Fische, die basierend auf der Ausdehnung der GFP Fluoreszenz, mit einem einfachen drei Kategoriensystem:
Hinweis: Ebene 1: Fluoreszenz erscheint als ein Zebrafischembryonen Tumor mit nur begrenzten lokalen Ausbreitung.
Stufe 2: Fluoreszenz scheint jenseits der Thymus, an denen < 50 % des Körpers.
Stufe 3: Fluoreszenz erstreckt sich über 50 % des Körpers. - Trennen Sie den Fisch durch alle von denen ohne Krebs. Überwachen Sie vorab leukämischen Fisch (z.B. Fisch ohne GFP+ Tumoren) einmal monatlich für die Entwicklung von neuen ALL. Von ~ 9 Monate, alle Rag2:hMYC, Lck:eGFP Fische entwickeln T-ALL, B-ALL, oder beides.
- Für T - oder B-ALL isoliert Zelle, wählen Sie Stufe 3 Fische (alle mit > 50 % des Körpers), die Ausbeute mehr als 2 x 106 alle Zellen und in der Regel viel mehr.
- Die Fische wie in Schritt 1.4 einschläfern.
Hinweis: Es gibt zwei Methoden, um alle Zellen zu erhalten: Ganzkörper-Homogenisierung und einem peritonealen waschen Technik16. Die Methoden unterscheiden sich in der absoluten Zahl von Zellen gesammelt für die Sortierung, und somit die Beträge der FACS erforderlich und Kosten (siehe Diskussion für weitere Details). - Für beide Methoden zuerst legen Sie den euthanasierten Fisch in einer Petrischale und mit einer Rasierklinge entfernen Sie den Kopf einschließlich der Zebrafischembryonen Region. Dies kann separat verarbeitet werden, wenn gewünscht, oder für histologische Färbung verwendet.
-
Peritoneal Wash Methode
- Mit Hilfe einer Pipette P1000, Waschen der Bauchhöhle Fisch mit 500 µL Kälte Sortierung Medien, sammeln die Zellen und die Medien in eine 5 mL-Tube.
- Mit einem frischen Pipettenspitze, eine weitere 200 – 300 µL kalte Sortierung Medien in die Körperhöhle injizieren. Dann üben Sie sanften Druck mit der Spitze der Pipette, um die Fische Körper, die Zellen aus der Körperhöhle zu extrudieren. Sammeln Sie diese Medien und verleihen Sie der 5 mL Tube.
- Wiederholen Sie Schritt 2.8.2 2 – 3 Mal. Halten Sie die gesammelten Zellen bei der Sortierung von Medien auf Eis.
- Filtern Sie die Zellsuspension, obwohl Netzchen 35 µm Filtern vor Flow Cytometry/FACS und halten die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.
-
Ganzen Körper Homogenisierung
- Nach dem Entfernen der Fischkopf, legen Sie den Körper in eine 1,5 mL-Tube mit 200 µL Medien zu sortieren.
- Homogenisieren des Körpers mit ein Stößel-Mikro-Schlauch-Homogenisator.
- Fügen Sie eine zusätzliche 300 µL der kalten Medien sortieren. Filtern Sie die Zellsuspension, obwohl ein Siebfilter 35 µm. Fügen Sie Sortier Medien hinzu, wie notwendig, um alle Zellen durch den Filter zu waschen, bis nur Gewebe Trümmer auf dem Filter bleibt. Halten Sie die Zellen auf dem Eis bis zur Analyse.
(3) durchflusszytometrischen Analyse der normalen oder malignen B-Lymphozyten
- Festlegen Sie durchflusszytometrischen Analyse und/oder nach Anleitung des Herstellers FACS Parameter.
-
Gewünschte Anzahl der Ereignisse, zunächst die Probe charakterisieren zu erwerben. 1 x 104 bis 5 x 104 Ereignisse vor der Sortierung zu bestimmen spezifische Tore für Sortierung Folgeschritte zu analysieren.
- Toren ermitteln: Lymphozyten und Vorläuferzellen Zelle Tore mit forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Parameter, ausgenommen Zelltrümmer (Abbildung 2A-C)17zu definieren. FSC und SSC entsprechen Zelle Größe/Durchmesser und Granularität, beziehungsweise.
Hinweis: GFP–, GFPlound GFPHallo Zellen unterscheiden 10-auf-100-Fach im Hinblick auf ihre GFP-Fluoreszenz-Intensität, wodurch Trennung dieser Populationen unkompliziert (Abbildungen 2-5). Lebenden Toten Diskriminierung kann an dieser Stelle mit Propidium Jod (PI) oder 7-Aminoactinomycin D (7-AAAD) Lebensfähigkeit Färbung bewertet werden. Bisherigen Experimente mit PI in der Regel zeigen > 95 % Lebensfähigkeit der Zellen GFP+ nach FACS. - Ausschließen der Zelle Dubletten, entsprechend den Parametern der FACS-Maschine verwendet wird.
- Innerhalb der lymphatischen und/oder Vorläufer Tore bestimmen Sie die Anzahl und Prozentsatz der GFP+ Zellen.
- Toren ermitteln: Lymphozyten und Vorläuferzellen Zelle Tore mit forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) Parameter, ausgenommen Zelltrümmer (Abbildung 2A-C)17zu definieren. FSC und SSC entsprechen Zelle Größe/Durchmesser und Granularität, beziehungsweise.
- Verwenden Sie Phycoerythrin (PE) und GLP-Intensitäten, definieren Sie Tor für GFP– vs. GFPlo vs. GFPHallo Zellen.
Hinweis: B-Zellen weisen dim GFP Fluoreszenz und T-Zellen zeigen helle GFP in Lck:eGFP Linien. Viele lymphatischen Organe oder Tumorproben enthalten sowohl GFP+ Bevölkerung. B-Linie Zellen/B-ALL GFPlo und T-Linie Zellen/T-alle sind GLPHallo. Definieren Sie Tore GFP–, GFPlo, GFPHallo Zellen unterscheiden, und dieser Bevölkerungen getrennt zu sammeln (Abbildung 2A-C, Abb. 3A-C, Abbildung 4A und Figur 5a). - Jede Zellpopulation in verschiedenen 15 mL Polypropylen Röhrchen mit 2 mL des Sortierens Medien oder direkt in verschiedenen 1,5 mL Röhrchen mit einer entsprechenden Puffer für weitere Analysen (z. B. RNA oder DNA-Protein-Extraktion, allo-Transplantation, etc.) zu sortieren.
- Halten Sie die gereinigte Zellen auf dem Eis vor weitere Analysen.
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Representative Results
Wir nutzten Durchflusszytometrie analysiert und FACS, GFPlo und GFPHallo Zellen aus Thymus, Knochenmark Niere und Milz Lck:eGFP transgenen Zebrafisch zu isolieren. Analyse der 3-Monate-alten Fisch ergab, dass der Thymus enthalten meist GFP+ Lymphozyten. GFP+ Zellen wurden weitgehend auf die lymphatischen Tor zuvor beschrieben von Traver Et Al.17beschränkt. Zwei verschiedene Populationen der GFP+ , GFPlound GFPHallo, beobachtet werden im Thymus. GFPHallo Lymphozyten vertreten einen höheren Prozentsatz, ~ 60 %, während GLPlo Zellen weniger reichlich waren, ~ 40 % der gesamten Zebrafischembryonen Lymphozyten (Tabelle 1). Im Gegensatz zu Säugetieren ist Fisch blutbildenden Knochenmark innerhalb der Niere nicht im Knochen lokalisiert. Wir entschlossen B-Zellen, die ihren Wohnsitz in Niere Knochenmark auch express niedrige Konzentrationen von GFP (Abb. 2 b und Abb. 3 b). GFPlo Zellen im Knochenmark waren reichlich vorhanden, während GLPHallo Zellen knapp waren (Abb. 2 b und Abb. 3 b)), darauf hinweist, dass nur einen kleinen Prozentsatz von T-Lymphozyten im Knochenmark im Alter von 3 Monaten anwesend waren. Milz Proben zeigten ebenfalls höhere Prozentsätze der GFPlo als GFPHallo Zellen (Abbildung 2 und Abbildung 3). Wir analysieren auch nicht-bösartigen Lymphozyten aus Thymus, Knochenmark und Milz von Doppel-transgenen Lck:eGFP; Rag2:hMYC Zebrafisch, die anfällig für beide B - und T-alle11. In Fische, die alle noch nicht entwickelt hatte, waren die Ergebnisse aus Thymus, Knochenmark und Milz ähnlich wie Single-transgenen Lck:eGFP Fisch. Jedoch die Anzahl der Lymphozyten pro Organ war erhöht (Abbildung 3), vermutlich durch MYC-driven Ausbau der unreifen B und T-Zell Populationen, wo der rag2 Projektträger aktiv ist.
Wir analysieren auch Doppel-transgene Fische mit b- oder T-ALL, die fluoreszierende Krebserkrankungen von 6 Monaten entwickelt hatte. Wie vorauszusehen war, enthielt B-alle Fische mit schwach-fluoreszierende Krebserkrankungen meist GFPlo Zellen (Abb. 4A). Im Gegensatz dazu können hell-fluoreszierenden Fisch entweder isolierte T-ALL Hafen oder gemischte Populationen von sowohl GFPlo B-ALL und GFPHallo T-ALL Zellen (Abbildung 5). Ein Beispiel für gemischt alle, die unterschiedliche B - und T-ALL enthält, wird hier gezeigt (Abbildung 5). Um die Identitäten der GFPlo und GFPHallo Zellen als B und T-Linie bzw. bestätigen, analysierten wir B und T-Zelle-spezifische Protokolle durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR). Unsere Ergebnisse zeigen GFPlo Zellen express-höhere B-Zell-Transkripte bzw. GFPHallo Zellen höhere T-Zell-Gene (Abb. 2D, Abbildung3D, Abbildung4 b und Abbildung 5 b). Darüber hinaus Ausdruck von Lck und GFP in GLPlo alle der dim in Vivo GFP-Fluoreszenz von B-ALL entsprechen (Abb. 2D, Abbildung3D, Abbildung4 b und Abbildung5 b; qRT-PCR-Bedingungen und Primer Sequenzen von Borga Et al. beschrieben.) 11.
Abbildung 1: Unterschiedliche Fluoreszenz-Muster in Lck:eGFP transgene Fische. (A) Fluoreszenz-Mikroskopie Bilder von Rag2:hMYC; Lck:eGFP Fisch mit hell-Leuchtstofflampen T-ALL (links) oder schwach Leuchtstoff B-ALL (rechts). T-ALL ist mit niedrigen Belichtungseinstellungen sichtbar; B-ALL kann nur gesehen werden, mit hohen Expositionen. (B) hohe Belichtungseinstellungen zeigen schwache Zebrafischembryonen Fluoreszenz (gelbe Kreise) in Wildtyp Lck:eGFP (links) und Rag2:hMYC; Lck:eGFP Doppel-transgene Fische ohne alle (rechts). Skalieren von Balken = 20 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Lymphozyten-Populationen in Lck:eGFP Zebrafisch. Bilder oben zeigen einen 3 Monate alten WT, Lck:eGFP Fisch mit hohen Belichtungseinstellungen oder Computer-Erweiterung (Visualisierung). Skalieren von Balken = 20 mm. Flow durchflusszytometrischen Analyse der Thymus (A), Knochenmark (B) und Milz (C). Linken Tafeln zeigen FSC (x-Achse) und SSC (y-Achse), mit schwarze ovale Lymphozyten Tore angibt. Mittleren Platten zeigen Fluoreszenz basierende Anspritzung mit GFP (x-Achse) und PE (y-Achse). GFPHallo (blaues Rechteck), GFPlo (grünes Rechteck) und GLP– (schwarze ovale) Bevölkerungen sind gezeigt. Rechten Fenster zeigen die Histogramme der GFPHallo und GFPlo Zellen. Gestrichelte Linien zeigen gating Kriterien im mittleren Platten. (D) WT Lck:eGFP Thymi sortiert für GFPHallo (blau) und GLPlo (grün). Ausdruck des B-Zell-Gens (pax5), T (cd4) zellspezifische Gene)Lck und GLP. Ergebnisse werden normalisiert, Housekeeping-Gene (β-Actin und eef1a1l1) und als Fach-Änderung ± Standardfehler (S.E) angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Lymphozyten Populationen im Zebrafisch Pre leukämischen Rag2:hMYC; Lck:eGFP . Bilder oben zeigen einen 3-Monat -alten Rag2:hMYC; Lck:eGFP Fisch mit hohen und Computer-enhanced Expositionen. Maßstabsleiste = 20 mm. Platten Teile A-D sind in Abbildung 2identische Format dargestellt. (D) Ausdruck der GFP in FACS gereinigt, pax5, cd4und Lck Zebrafischembryonen GFPlo (grün) GLPHallo (blau) Zell-Populationen von Lck:eGFP Fischen. qRT-PCR-Ergebnisse werden angezeigt, wie Falten-Änderung ± S.E Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Analyse der B-ALL Rag2:hMYC; Lck:eGFP transgene Fische. (A) oben: 6-Monate-alten Rag2:hMYC; Lck:eGFP Fisch mit B-ALL mit hohen Belichtungseinstellung. Strömung durchflusszytometrischen Analyse von Tumorzellen von Fische Körper isoliert sind identische Format Abbildung 2. (B) Genexpression in B-ALL GFPlo Zellen (grünes Tor in Abbildung 4A), Rag2:hMYC; Lck:eGFP GFPHallo Thymozyten (blaues Tor in Abbildung 3A) und T-ALL GFPHallo Zellen (blaues Tor in Abbildung 5A ). Ausdruck von B (pax5, cd79a) und T (cd4) zellspezifische Gene, Lckund GLP. Ergebnisse werden normalisiert, Housekeeping-Gene (β-Actin und eef1a1l1) und gezeigt, wie Falten-Änderung ± S.E. Scale bar = 20 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Analyse der gemischt alle Rag2:hMYC; Lck:eGFP transgene Fische. (A) oben: 6 Monate alten Rag2:hMYC; Lck:eGFP Fisch mit gemischt-alle mit hohen Belichtungseinstellung. Strömung durchflusszytometrischen Analyse von Tumorzellen von Fische Körper isoliert sind identische Format Abbildung 2. (B) GLPHallo (blau) und GLPlo (grün) FACS Tore. Ausdruck von B (pax5, cd79a) und T (cd4) zellspezifische Gene, Lckund GLP. Ergebnisse werden normalisiert, Housekeeping-Gene (β-Actin und eef1a1l1) und gezeigt, wie Falten-Änderung ± S.E. Scale bar = 20 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir entwickelt und bieten ein Protokoll zur B-Zellen aus Lck:eGFP transgenen Zebrafisch, isolieren das Hinzufügen anderer D. Rerio Modelle mit B-Linie Etiketten3,4. Etwas überraschend ging die Identifizierung der GFPlo B Zellen in dieser Zeile seit seiner Beschreibung im Jahr 2004 unbemerkt. In der Regel Lck gilt als T-Zell-spezifische6, aber neuere Studien gefunden, unerwartete Lck Ausdruck von natürlichen Killer und myeloische Zellen, ebenso wie in B-Zellen, wie hier gezeigt18,19. In Absprache mit unserer Entdeckung, dass Zebrafisch B Zellen GFPlo, Pre-B, naiv und B Reifen express Zellen beim Menschen auch niedrige Konzentrationen von LCK11,13.
Aufgrund der unterschiedlichen GFP in B- und T-Zellen dieser Fische können Zellen der beiden Linien nun von dieser Linie isoliert werden. Obwohl diese Tiere klassisch verwendet wurden, um Zebrafischembryonen T-Lymphozyten Entwicklung und Verfolgung zu studieren, zeigen wir, dass ähnliche Studien auch möglich mit B-Zellen sind. Zu diesem Zweck identifizieren wir B-Zellen im Thymus, Knochenmark Niere und Milz hier, und im peripheren Blut und anderswo in früheren Arbeiten11.
In der B-ALL in Rag2:hMYCErkenntnis; LCK:eGFP Fisch erfordert ein gutes Auge, aber mit etwas Übung ist einfach. Als nächstes entscheiden, welche Methode Sie verwenden, um alle Zellen zu reinigen ist. Hier stellen wir zwei Methoden: peritoneal-Waschanlagen und Ganzkörper Homogenisierung. Peritoneal waschen ergibt eine viel geringere Anzahl von insgesamt Zellen, aber ein sehr hoher Prozentsatz der GFP+ Zellen. Infolgedessen ist wenig FACS-Zeit erforderlich, die Kosten zu minimieren. Für downstream-Anwendungen, wo die Gesamtausbeute weniger wichtig ist (z. B. qRT-PCR), dies ist effizienter. Alternativ Ganzkörper Homogenisierung führt zu größeren Einzelzelle Suspensionen mit vielen mehr Zellen, aber ein niedriger Prozentsatz der Zellen werden GFP+. So ist mehr FACS-Zeit erforderlich, um die gleiche Anzahl von GFP+ Zellen zu sammeln, wie mit peritoneal waschen, aber Millionen mehr Zellen gereinigt werden können. Für nachgeschaltete Studien, wo hoher Ausbeute wichtig ist (z. B. Western-Blot), dies kann die zusätzliche Kosten auszugleichen. Darüber hinaus fängt für alle Studien, Ganzkörper Homogenisierung die Vielfalt der Krebszellen vorhanden, mehr genau repräsentieren Tumor Heterogenität. Obwohl in unserem Protokoll nicht aufgeführt, ist es auch möglich, nur GFP+ Regionen/Körperorgane aus Fisch mit allen für die Homogenisierung durch Zerkleinern in einer Petrischale, damit Verringerung total FACS Zeit- und Kostenaufwand, vergleichbar mit peritoneal waschen zu sezieren.
Zebrafischembryonen GFP Ausdruck in Lck:eGFP Fisch zeigte, dass GFP so früh wie 5 Dpf6nachweisbar ist. Hier unsere Studien wurden durchgeführt in ausgewachsenen Fischen 3 Monate oder älter und zeigen, dass in diesem Alter B-Zellen im Knochenmark Niere und Milz reichlich, doch T-Zellen selten sind. Nachfolgende Studien mit Fisch aller Altersgruppen werden benötigt um festzustellen, ob T-Zellen häufiger zu unterschiedlichen Zeitpunkten sind. Ebenso nach 3 Monaten, T-Zellen sind im Thymus bereichert, aber eine beträchtliche Anzahl von Zebrafischembryonen B-Zellen sind ebenfalls vorhanden. Wenn diese Lymphozyten-Populationen variieren bei unterschiedlichen Alters ist derzeit unbekannt, aber insgesamt, Zebrafischembryonen Fluoreszenz verblasst in Lck:eGFP Fische ab Geschlechtsreife (~ 3 Monate), so ist es wahrscheinlich, dass die T-Zell-Zahlen zu vermindern, mit zunehmendem Alter, und B-Zellen auch. Ebenso, wenn GFPlo B Zellen besiedeln Zebrafisch Thymus ist derzeit unbekannt. Mit Lck:eGFP Fisch, ist es nun möglich, Zebrafischembryonen B und T-Zell-Entwicklung, Zustrom, Ausfluss und die spezifische Kinetik dieser Ereignisse zu überwachen. Darüber hinaus sind solche Fragen auch zu anderen anatomischen Seiten wo B-Zellen befinden, wie z. B. Niere, Knochenmark, Milz, Blut und Darm (Daten nicht gezeigt).
Neben der B-Zelle Studien fanden wir vor kurzem B-ALL in Lck:eGFP; Rag2:hMYC Doppel-transgene Fische11. Transgenen Rag2:hMYC war bekannt, dass T-ALL10 induzieren aber B-ALL war nicht erkannt. Durch die hohe Penetranz dieses Onkogen, beide Arten von alle sind weit verbreitet in diese Fische, und viele Fische entwickeln beide eigentlich alle Typen gleichzeitig11. Da B-ALL sind GLPlo, während T-ALL GFPHallo, lassen sich unterschiedliche GFP Ausdruck dieser beiden Entitäten durch FACS, isoliert werden, auch wenn im gleichen Tier (Abbildung 5A) auftreten. Entscheidend ist, in normalen und bösartigen Lymphozyten zeigen qRT-PCRresults, dass GFPlo und GFPHallo Zellen konsequent auf die B und T-Linien (Abbildung 2 und Abbildung 3) entsprechen.
Das ungenutzte Potenzial der Lck:eGFP Fisch war diese Arbeit, Hervorhebung der Tatsache, dass viele bereits vorhandene transgene Linien wahrscheinlich Dienstprogramm jenseits ihrer Zweckbestimmung haben. Hier präsentieren wir eine neuartige Protokoll um B- und T-Zellen aus D. Rerio mit transgenen Lck:eGFP, isolieren, öffnet die Tür zu neuen investigational Alleen, die zur normalen und maligner B-Lymphozyten. Die Ergebnisse solcher Studien werden zweifellos wieder beleben bereits eine wertvolle Ressource für die Blutbildung, Lymphopoiese und Krebs-Biologie-Felder.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Wir möchten danken Megan Malone-Perez für Zebrafisch Pflege und OUHSC Flow Cytometry Kern. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von Hyundai Hope auf Rädern, die Oklahoma Center for the Advancement of Science und Technology (HRP-067), ein NIH/NIGMS INBRE Pilotprojekt Award (P20 GM103447). JKF hält die E.L & Thelma Gaylord-Stiftungsprofessur in Pädiatrische Hämatologie-Onkologie an der Children Hospital Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
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