Summary
Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) sono un potente modello per studiare lo sviluppo del linfocita. Come mammiferi, d. rerio possiedono un sistema immunitario adattativo che include i linfociti B e T. Gli studi di zebrafish linfopoiesi sono difficili perché anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule di d. rerio non sono generalmente disponibili, isolamento e caratterizzazione di popolazioni linfocitarie diverse, tra cui B-stirpe di complicazione cellule. Linee transgeniche con espressione fluoroforo lineage-specifici sono spesso utilizzati per aggirare questa sfida. La linea transgenica lck:eGFP è stata utilizzata per studiare lo sviluppo delle cellule di T di d. rerio e inoltre è stata utilizzata per lo sviluppo delle cellule di T di modello e leucemia linfoblastica acuta (LAL-T). Anche se lck:eGFP pesce sono stati ampiamente usati per analizzare il T-stirpe, essi non sono stati utilizzati per studiare le cellule B. Recentemente, abbiamo scoperto che molte cellule di zebrafish B esprimono anche lck, seppur a livelli inferiori. Di conseguenza, le cellule lck:eGFP B similarmente esprimono bassi livelli di GFP. Sulla base di questa individuazione, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le cellule di B-stirpe da lck:eGFP zebrafish, che segnaliamo qui. Il nostro metodo viene descritto come utilizzare un sorter fluorescente-attivata delle cellule (FACS) per purificare le cellule B da lck:eGFP pesce o righe correlate, ad esempio transgenici doppio rag2:hMYC; pesce LCK:EGFP . In queste righe, cellule B, cellule B particolarmente immature, GFP espressa a livelli bassi ma rilevabili, consentendo loro di essere distinto dalle cellule T, che esprimono GFP altamente. B cellule possono essere isolate da midollo osseo, timo, milza, sangue o altri tessuti. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per purificare le cellule di B di d. rerio , abilitazione studi incentrati su temi come lo sviluppo delle cellule B e le malignità del linfocita B.
Introduction
Zebrafish offrono potenti attributi, ad esempio manipolabilità genetica, alta fecondità, ottico traslucenza e rapido sviluppo che semplificano lo sviluppo vertebrato Studio utilizzando approcci genetici. Questi vantaggi, insieme con le funzionalità condivise di teleostei e mammiferi ematopoiesi, rendono d. rerio ideale per analisi in vivo della funzione del linfocita e linfopoiesi, dalla loro prima apparizione nelle larve durante l'età adulta. Sviluppo di sangue in zebrafish si basa su processi genetici ben conservati che vengono condivisi con i mammiferi, e questi si estendono per il sistema immunitario adattativo. Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo linfoide notevolmente sono conservate tra zebrafish e mammiferi1.
Negli ultimi 2 decenni, linee transgeniche d. rerio lignaggi di sangue specifico tale etichetta e linee mutanti carenti in queste linee cellulari sono state create2,3,4,5. Uno di questi, la linea transgenica lck:eGFP , utilizza il promotore di zebrafish del linfocita proteina tirosina chinasi (lck) a guidare la GFP espressione6. Questo gene, che è altamente espressa da precursori di LAL-T e i linfociti T maturi, permette in vivo monitoraggio dello sviluppo della cellula T timica ed ex vivo purificazione delle cellule di T-stirpe di FACS7. In precedenza, abbiamo usato questa linea in uno schermo di mutagenesi ENU avanti-genetica per identificare i mutanti di germline inclini a LAL-T e per studiare eventi genetici somatico acquisito legati a cellula T oncogenesi8,9.
Recentemente, il nostro laboratorio esteso ulteriormente l'utilità di lck:eGFP zebrafish. In transgenici doppio rag2:hMYC (MYC umano), lck:eGFP D. rerio che sono noti per sviluppare LAL-T 10, abbiamo scoperto che LAL-B si verificano anche11. A differenza di LAL-T in questo modello, che reagiscono in brillantemente dovuto l'alta espressione di GFP, B-tutti sono scarsamente-fluorescenti a causa di bassi livelli di GFP, permettendo il pesce con B-ALL per essere distinti grossolanamente da quelli con LAL-T da microscopia fluorescente. Questa espressione di GFP differenziale consente inoltre la separazione di cellule GFPlo B-tutti da GFPCiao cellule T-ALL usando FACS11. Inoltre, espressione di basso lck non è univoco per zebrafish B-ALL, come umano anche esprimere bassi livelli di B-ALL di LCK11,12. Allo stesso modo, le cellule normali di B-stirpe di d. rerio, topi e gli esseri umani esprimono anche bassi livelli di lck/LckLCK, con cellule di B acerbe che hanno la più alta espressione11,13. Su una base per cellula, le cellule di B-stirpe in linee di zebrafish o derivato di lckeGFP express 1-10% tanto GFP come linfociti T. Questi GFPlo cellule espressa caratteristica delle cellule di B mRNA come pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze altri e possa essere purificate dal midollo osseo, timo, milza o periferico 11del sangue. Di conseguenza, entrambi LAL-B e T-cellule possono essere isolato da lckeGFP zebrafish e nel caso di rag2hMYC, lckeGFP animali, anche le cellule di B - e T-ALL11.
Qui, vi presentiamo il nostro protocollo efficiente FACS-purificare B cellule benigne da lck:eGFP zebrafish e benigne o maligne cellule di B di rag2hMYC; LCK:EGFP pesce, utilizzando vari tessuti di origine. Tali cellule allo stesso modo possono essere quantificate mediante citometria a flusso senza isolamento FACS, se lo si desidera. Scoperta di espressione bassa lck - e di conseguenza bassa espressione di GFP-di B cellule apre nuove porte di possibilità sperimentali per lckeGFP zebrafish, come in vivo B cella studi evolutivi. Così, questa linea transgenica, primo luogo segnalata in 2004, ha una nuova vita come cerchiamo di utilizzarlo per raccogliere nuove intuizioni relative all'immunità adattativa zebrafish.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono zebrafish sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolare i linfociti T e B Non-maligne da transgenici lck:eGFP pesce
- Anestetizzare il pesce utilizzando 0,02% tricaina (MS-222) in pesci d'acqua del sistema.
- Esaminare il pesce di 2 – 6 mesi per thymi fluorescente, che si trovano presso l'aspetto di dorsomedial della cavità branchiale di zebrafish e altri Teleostei14. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza (470/40 lunghezza d'onda di eccitazione e filtro di emissione 525/50) per rilevare la GFP.
- Preparare in anticipo 50 mL di 1x filtro-sterilizzato di Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) contenenti 1% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina (ordinamento media). Supporti inutilizzati ordinamento possono essere memorizzati a 4 ° C fino a 2 mesi.
- Eutanasia il pesce mettendolo in un becher contenente 0,2% tricaina per circa 5 min, seguita da immersione in bagno ghiaccio. Confermare la morte causata dalla cessazione della circolazione opercular (gill).
- Mettere il pesce eutanasizzato in una capsula di Petri e dissezionare organi linfoidi di interesse, utilizzando il microscopio a fluorescenza per sezionare la GFP+ thymi14e impostazioni di microscopia del campo luminoso dissezionare il rene del midollo e della milza15. Risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando 3 mesi pesci. Le proporzioni dei linfociti e numeri assoluti variano a seconda dell'età e genotipo (vedi discussione per ulteriori dettagli).
- Posizionare ogni organo sezionato in una provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l di freddo l'ordinamento di media.
- Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio con un omogeneizzatore di micro-tubo di pestello.
- Passare tessuto omogeneizzato attraverso un filtro a maglia 35 µm per generare una sospensione unicellulare. Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.
2. isolare linfociti maligni da transgenici doppio rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafish
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All'inizio della 2-4 mesi, microscopicamente schermo rag2:hMYC; LCK:EGFP pesce per modelli anormali di GFP.
Nota: le cellule B sono GFPlo sullo sfondo di lck:eGFP , quindi B-ALL richiede pratica per riconoscere; T-ALL è evidente, perché le cellule T sono GFPCiao. Di conseguenza, il rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgenici linea ha due fenotipi: brillantemente-fluorescente T-ALL, che di solito derivano da timo e si estendono nel corpo e scarsamente fluorescente B-ALL.- Utilizzo di un microscopio a fluorescenza, schermo il pesce utilizzando le impostazioni di "bassa esposizione" (200 ms, 2,4 x guadagno) per identificare LAL-T luminoso (Figura 1A) e "alta esposizione" (1,5 s, 3,4 x guadagno) per identificare dim B-ALL (Figura 1A). Controlli WT e pesce pre-leucemiche hanno GFP localizzato solo nel timo (Figura 1B).
- Anestetizzare ed esaminare il pesce come descritto ai punti 1.1 – 1.2.
- Categorizzare il pesce basato sulla misura della fluorescenza di GFP, utilizzando un semplice sistema di 3 Categoria:
Nota: Livello 1: Fluorescenza appare come un tumore timico con solo limitata diffusione locale.
Livello 2: Fluorescenza appare di là del timo, che coinvolgono < 50% del corpo.
Livello 3: Fluorescenza si estende oltre il 50% del corpo. - Separare il pesce con tutto da quelli senza cancro. Controllo pre-leucemica pesce (cioè, senza tumori GFP+ ) una volta mensile per lo sviluppo di nuovo tutti. Da ~ 9 mesi, tutti i rag2:hMYC, lck:eGFP pesce sviluppare LAL-T, B-ALL, o entrambi.
- Per LAL-T o B cellula di isolamento, selezionare livello 3 pesci (tutti coinvolgendo > 50% del corpo), che producono più di 2 x 106 tutte le cellule e in genere molti di più.
- Eutanasia il pesce come descritto al punto 1.4.
Nota: Ci sono due metodi per ottenere tutte le celle: omogeneizzazione e una tecnica di lavaggio peritoneale16del corpo intero. I metodi differiscono per il numero assoluto delle cellule raccolte per l'ordinamento, e così, la quantità di FACS tempo richiesto e costo (vedi discussione per ulteriori dettagli). - Per entrambi i metodi, prima di mettere il pesce eutanasizzato in una capsula di Petri e usando una lama di rasoio, rimuovere la testa compresa la regione timica. Questo può essere elaborato separatamente, se lo si desidera, o utilizzato per la colorazione istologica.
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Metodo di lavaggio peritoneale
- Utilizzando una pipetta P1000, lavare la cavità peritoneale di pesce con 500 µ l di freddo ordinamento media, raccoglie le cellule ed i media in una provetta da 5 mL.
- Utilizzando un puntale fresco, iniettare un ulteriore 200 – 300 µ l di freddo media ordinamento nella cavità del corpo. Quindi, usando la punta della pipetta, applicare una leggera pressione per il corpo dei pesci per estrudere le cellule fuori della cavità di corpo. Raccogliere questa media e aggiungere alla provetta da 5 mL.
- Ripetere il passaggio 2.8.2 2 – 3 volte. Mantenere le cellule raccolte in ordinamento media sul ghiaccio.
- Filtrare la sospensione cellulare anche se una mesh di 35 µm filtrare prima del flusso cytometry/FACS e mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.
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Omogeneizzazione di tutto il corpo
- Dopo aver rimosso la testa di pesce, posizionare il corpo in una provetta da 1,5 mL contenente 200 µ l di ordinamento media.
- Omogeneizzare il corpo utilizzando un omogeneizzatore di micro-tubo di pestello.
- Aggiungere un ulteriore 300 µ l di freddo l'ordinamento di media. Filtrare la sospensione cellulare anche se un filtro a maglia 35 µm. Aggiungere file multimediali ordinamento come necessario per lavare tutte le cellule attraverso il filtro, fino a quando rimane solo detriti del tessuto sul filtro. Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.
3. Cytometric analisi dei linfociti B normali o maligni
- Impostare l'analisi cytometric di flusso e/o parametri FACS secondo la guida del produttore.
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Acquisire il numero di eventi per caratterizzare inizialmente il campione desiderato. Analizzare 1 x 104 a 5 x 104 eventi prima dell'ordinamento alla determinazione di specifiche porte per i successivi passaggi di ordinamento.
- Determinare i cancelli: definire dei linfociti e cellule progenitrici delle cellule Gate utilizzando forward scatter (FSC) e i parametri di dispersione (SSC) di lato, escluse detriti cellulari (Figura 2A-C)17. FSC e SSC corrispondono alle dimensioni/diametro delle cellule e granularità, rispettivamente.
Nota: GFP–, GFPloeCiao cellule GFP differiscono da 10-100-piegatura in termini di loro intensità di fluorescenza di GFP, rendendo la separazione di queste popolazioni semplice (figure 2-5). Vive-morte discriminazione può essere valutata a questo punto utilizzando iodio propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) vitalità colorazione. Precedenti esperimenti con PI dimostrano tipicamente > 95% attuabilità delle cellule GFP+ dopo FACS. - Escludere i doppietti di cella, secondo i parametri della macchina FACS utilizzato.
- All'interno dei cancelli linfoidi e/o precursore, determinare il numero e la percentuale di cellule GFP+ .
- Determinare i cancelli: definire dei linfociti e cellule progenitrici delle cellule Gate utilizzando forward scatter (FSC) e i parametri di dispersione (SSC) di lato, escluse detriti cellulari (Figura 2A-C)17. FSC e SSC corrispondono alle dimensioni/diametro delle cellule e granularità, rispettivamente.
- Utilizzare ficoeritrina (PE) e intensità di GFP, definire il cancello per GFP– vs GFPlo vsCiao cellule GFP.
Nota: Le cellule B presentano fluorescenza GFP dim e T cellule mostrano brillante GFP nelle linee di lck:eGFP . Molti organi linfoidi o campioni tumorali contengono entrambe le popolazioni GFP+ . LAL-B sono cellule/B-ALL GFPlo e T-stirpe cellule/T-tutti sono GFPCiao. Definire gate di distinguere tra GFP–, GFPloeCiao cellule GFP e raccogliere queste popolazioni separatamente(Figura 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A e Figura 5a). - Ordinare ogni popolazione di cellule in provette di polipropilene diverse 15 mL contenente 2 mL di ordinamento media o direttamente in tubi diversi 1.5 mL contenente un tampone appropriato per ulteriori analisi (ad es., RNA, DNA o estrazione di proteine, allo-trapianto, ecc.).
- Mantenere le cellule purificate su ghiaccio prima di ulteriori analisi.
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Representative Results
Abbiamo usato il flusso cytometry per analizzare e FACS per isolare GFPlo e GFPCiao cellule da timo, midollo del rene e la milza di zebrafish transgenici lck:eGFP . Analisi di pesce 3-month-old ha rivelato che il timo contenuto principalmente i linfociti GFP+ . Le cellule GFP+ in gran parte sono state limitate al cancello linfoide precedentemente descritto da Traver et al.17. Due popolazioni distinte di GFP+ , GFPloe GFPCiao,può essere osservato nel timo. Ciao linfociti GFP rappresentavano una percentuale più elevata, ~ 60%, mentrelo cellule GFP erano meno abbondanti, che rappresenta circa il 40% dei linfociti timici totali (tabella 1). A differenza dei mammiferi, pesci midollo ematopoietico è localizzato all'interno del rene, piuttosto che all'interno dell'osso. Abbiamo determinato le cellule di B che risiedono nel rene midollo anche esprimere i bassi livelli di GFP (Figura 2B e Figura 3B). GFPlo cellule nel midollo erano abbondanti, mentreCiao cellule GFP erano scarse (Figura 2B e Figura 3B)), che indica che solo una piccola percentuale di linfociti T erano presenti nel midollo a 3 mesi dell'età. Splenici campioni inoltre ha mostrati percentuali più elevate di GFPlo GFPCiao delle cellule (Figura 2 e Figura 3). Abbiamo anche analizzato i linfociti non-maligne da timo, midollo osseo e milza di zebrafish transgenici doppio lck:eGFP; rag2:hMYC , che sono inclini a entrambi di B - e T-ALL11. Nei pesci che non avevano ancora sviluppato tutti, risultati da timo, midollo osseo e la milza erano simili a singolo-transgenici lck:eGFP pesce. Tuttavia, i numeri dei linfociti per organo erano aumentato (Figura 3), presumibilmente a causa di MYC-driven espansione delle popolazioni di linfociti B e T immaturi dove il promotore rag2 è attivo.
Abbiamo anche analizzato pesci transgenici doppio con B - e/o T-tutti che avevano sviluppato cancri fluorescenti da 6 mesi. Com'era prevedibile, pesce B-ALL con tumori scarsamente-fluorescenti contenute principalmente GFPlo cellule (Figura 4A). Al contrario, brillantemente-fluorescente pesce può harbor sia isolato LAL-T o popolazioni di entrambi la GFPlo B-ALL e GFPCiao miste cellule LAL-T (Figura 5). Un esempio di mescolato tutto, che contiene distinti B - e T-ALL, è mostrato qui (Figura 5). Per confermare l'identità di GFPlo eCiao cellule GFP come B - e T-stirpe, rispettivamente, abbiamo analizzato le trascrizioni di B - e T-cellula-specifico di PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). I nostri risultati mostrano GFPlo cellule esprimono livelli più elevati di cellule B trascrizioni e GFPCiao cellule esprimono livelli più elevati di geni delle cellule T (Figura 2D, Figura3D, Figura4B e Figura 5B). Inoltre, espressione di lck e GFP a GFPlo tutti corrispondono alla fluorescenza di GFP dim in vivo di LAL-B (Figura 2D, Figura3D, Figura4B e Figura5B; qRT-PCR condizioni e primer sequenze precedentemente descritte da Borga et al.) 11.
Figura 1: Pattern di fluorescenza distinti nei pesci transgenici lck:eGFP . Immagini di microscopia fluorescente (A) di pesce rag2:hMYC; lck:eGFP con brillantemente-fluorescente T-ALL (a sinistra) o scarsamente fluorescente B-ALL (a destra). T-ALL è visibile con le impostazioni di esposizione basso; B-ALL può essere visto solo utilizzando alte esposizioni. (B) elevata esposizione impostazioni Mostra debole fluorescenza timica (cerchi gialli) in pesce selvaggio-tipo lck:eGFP (a sinistra) e rag2:hMYC; lck:eGFP pesci transgenici doppio senza tutti (destra). Scala bar = 20 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Popolazioni linfocitarie in zebrafish lck:eGFP . Immagini in alto mostrano un 3 mesi WT, lck:eGFP pesce con impostazioni di esposizione alta o miglioramento di computer (per facilitare la visualizzazione). Scala bar = 20mm analisi cytometric di flusso del timo (A), del midollo (B) e della milza (C). Pannelli a sinistra Visualizza FSC (asse x) e SSC (asse y), con ovali neri che indica di gate linfocitari. Pannelli centrali raffigurano basati sulla fluorescenza gating con GFP (asse x) e PE (asse y). GFPCiao (rettangolo blu), GFPlo (rettangolo verde) e popolazioni di GFP– (ovali neri) sono mostrati. Pannelli di destra visualizzano istogrammi di GFPCiao elo cellule GFP. Le linee tratteggiate indicano gating criteri in pannelli. (D) WT lck:eGFP thymi ordinati per GFPCiao (blu) e GFPlo (verde). Espressione del gene delle cellule di B (pax5), geni specifici delle cellule T (cd4))lck e GFP. Risultati sono normalizzati a geni housekeeping (β-actina ed eef1a1l1) e mostrato come piega-cambiamento ± errore Standard (s. e). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Popolazioni di linfociti in zebrafish pre-leucemica rag2:hMYC; lck:eGFP . Immagini in alto mostrano un 3-mese -vecchio rag2:hMYC; lck:eGFP pesce con esposizioni elevate e computer-rafforzata. Barra della scala = 20mm pannelli delle parti A-D sono rappresentati in formato identico alla Figura 2. (D) espressione della GFP in FACS-purificato, cd4, lcke pax5 timica GFPlo (verde) GFPCiao (blu) popolazioni cellulari di pesce lck:eGFP . qRT-PCR risultati sono mostrati come piega-cambiamento ± S.E. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi di pesci transgenici di B-ALL rag2:hMYC; lck:eGFP . Parte superiore (A): 6-mese-vecchio rag2:hMYC; lck:eGFP pesce con B-tutti utilizzando l'impostazione di esposizione elevata. Analisi cytometric di flusso delle cellule del tumore isolate dal corpo di pesce sono di formato identico alla Figura 2. (B) l'espressione genica in B-ALL GFPlo (cancello verde in Figura 4A), rag2:hMYC; lck:eGFP GFPCiao timociti (cancello blu in Figura 3A) e T-ALL GFPCiao cellule (cancello blu in Figura 5A ). Espressione di B (pax5, cd79a) e T (cd4) cellula-specifico geni, lcke GFP. Risultati sono normalizzati a geni housekeeping (β-actina ed eef1a1l1) e mostrato come piega-cambiamento ± S.E. scala bar = 20 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Analisi di misto di tutti i rag2:hMYC; lck:eGFP pesce transgenico. Parte superiore (A): 6 mesi rag2:hMYC; lck:eGFP pesci con misto-tutti utilizzando l'impostazione di esposizione elevata. Analisi cytometric di flusso delle cellule del tumore isolate dal corpo di pesce sono di formato identico alla Figura 2. (B) GFPCiao (blu) e cancellilo (verde) FACS GFP. Espressione di B (pax5, cd79a) e T (cd4) cellula-specifico geni, lcke GFP. Risultati sono normalizzati a geni housekeeping (β-actina ed eef1a1l1) e mostrato come piega-cambiamento ± S.E. scala bar = 20 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo sviluppato e fornire un protocollo per isolare le cellule B da lck:eGFP zebrafish transgenici, l'aggiunta di questo ad altri modelli di d. rerio con B-stirpe etichette3,4. Abbastanza sorprendentemente, l'identificazione delle GFPlo B cellule in questa linea passò inosservato dalla relativa descrizione nel 2004. In genere, lck è considerato specifico delle cellule T6, ma recenti studi trovano espressione imprevista lck da killer naturali e mieloidi le cellule, anche come nelle cellule B come illustrato di seguito18,19. In accordo con la nostra scoperta che le cellule zebrafish B sono GFPlo, pre-B, ingenuo e maturo B cellule negli esseri umani esprimono anche bassi livelli di LCK11,13.
A causa dei differenti livelli GFP in cellule B e T di questi pesci, cellule di entrambe le linee evolutive ora possono essere isolate da questa linea. Anche se questi animali classicamente sono stati usati per studiare il monitoraggio e lo sviluppo del linfocita T timica, dimostriamo che sono possibili con le cellule B anche studi simili. A tal fine, identifichiamo le cellule B nel timo, midollo del rene e la milza qui e nel sangue periferico e altrove nel lavoro anteriore11.
Riconoscendo B-ALL in rag2:hMYC; LCK:EGFP pesce richiede un occhio attento, ma con la pratica, è semplice. Successivamente, di scegliere quale metodo utilizzare per purificare tutte le cellule è critica. Qui, presentiamo due metodi: lavaggio peritoneale e omogeneizzazione di tutto il corpo. Lavaggio peritoneale produce un numero molto inferiore di cellule totali, ma una percentuale molto elevata di cellule GFP+ . Di conseguenza, poco tempo di FACS è necessaria, riducendo al minimo i costi. Per applicazioni a valle, dove il rendimento totale è meno importante (ad es., qRT-PCR), questo è più efficiente. In alternativa, omogeneizzazione di tutto il corpo si traduce in più grandi sospensioni singola cella contenente molte più cellule, ma una minore percentuale di cellule sarà GFP+. Quindi, più tempo di FACS è necessario per raccogliere lo stesso numero di cellule GFP+ come con lavaggio peritoneale, ma milioni più celle possono essere purificate. Per gli studi a valle, dove è importante ad alto rendimento (ad es., Western blot), potrebbe compensare il costo aggiunto. Inoltre, per tutti gli studi, omogeneizzazione totale corpo cattura la diversità delle cellule tumorali presenti, più con precisione che rappresenta eterogeneità del tumore. Anche se non elencati nel nostro protocollo, anche è possibile sezionare solo GFP+ di regioni organi da pesce con tutti per l'omogeneizzazione di macinazione in una capsula Petri, diminuendo così la totale FACS tempi e costi, simile a lavaggio peritoneale.
Timica espressione di GFP in lck:eGFP pesce ha mostrato che la GFP è rilevabile fin da 5 dpf6. Qui i nostri studi sono stati effettuati in pesci adulti 3 mesi di età o più anziani e mostrano che a questa età, le cellule B sono abbondanti nel midollo del rene e la milza, ma le cellule T sono rare. Gli studi successivi con i pesci di diverse età sarà richiesti per determinare se le cellule T sono più prevalenti in diversi momenti. Allo stesso modo, a 3 mesi, le cellule T sono arricchite nel timo, ma è presente anche un considerevole numero di cellule di B del timo. Se queste popolazioni linfocitarie variano a diverse età è attualmente sconosciuto, ma nel complesso, timica fluorescenza sfuma in lck:eGFP pesce iniziando a maturità sessuale (~ 3 mesi), allora è probabile che i numeri delle cellule T diminuiscono con l'aumento dell'età, e cellule di B può anche. Allo stesso modo, quandolo B cellule GFP colonizzano il timo di zebrafish è attualmente sconosciuto. Usando i pesci lck:eGFP , ora è possibile monitorare lo sviluppo di linfociti B e T timico, afflusso, efflusso e la cinetica specifica di questi eventi. Inoltre, tali domande sono anche pertinenti alle altre sedi anatomiche dove risiedono le cellule B, come il midollo del rene, milza, sangue e intestino (dati non mostrati).
Oltre a studi evolutivi delle cellule di B, abbiamo trovato recentemente B-ALL in lck:eGFP; RAG2:hMYC pesci transgenici doppio11. Transgenici rag2:hMYC era conosciuta per indurre LAL-T10 ma B-tutto era andato non riconosciuto. Dovuto l'alta penetranza di questo oncogene, entrambi i tipi di tutti sono prevalenti in questi pesci, e molti pesci effettivamente sviluppano entrambi contemporaneamente tutti i tipi di11. Poiché B-tutti sono GFPlo, mentre T-tutti sono GFPCiao, variando l'espressione della GFP permette queste due entità essere isolato da FACS, anche quando che si verificano nello stesso animale (Figura 5A). Fondamentalmente, in linfociti normali e maligni, qRT-PCRresults dimostrare che GFPlo eCiao cellule GFP costantemente corrispondono per il B - e T-lignaggi, rispettivamente (Figura 2 e Figura 3).
Il potenziale inespresso di lck:eGFP pesce era centrale per questo lavoro, evidenziando il fatto che molti pre-esistenti linee transgeniche probabile avere utilità di là di loro scopo progettato. Qui, presentiamo un nuovo protocollo per isolare le cellule B e T da d. rerio con transgenici lck:eGFP, aprendo le porte a nuove vie in fase di sperimentazione riguardante i linfociti B normali e maligni. I risultati di tali studi saranno senza dubbio rivitalizzare la cosa è già stato una risorsa preziosa per l'ematopoiesi, linfopoiesi e campi di biologia del cancro.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Megan Malone-Perez per cura di zebrafish e il nucleo di cytometry di flusso OUHSC. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Hyundai Hope su ruote, il centro dell'Oklahoma per l'avanzamento della scienza e tecnologia (HRP-067), un premio del progetto pilota di NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF detiene il E.L. & Thelma Gaylord dotata di sedia in ematologia-oncologia pediatrica della Fondazione Ospedale dei bambini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
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