Summary
ट्रांसजेनिक lck: egfp zebrafish एक्सप्रेस उच्च टी लिम्फोसाइटों में gfp, और टी सेल विकास और तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह लाइन बी कोशिकाओं, जो निचले स्तर पर एक्सप्रेस lck अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल lck से घातक और गैर-घातक बी कोशिकाओं की शुद्धि का वर्णन करता है : egfp zebrafish.
Abstract
zebrafish (डेनियो रेरियो) लिम्फोसाइट विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल हैं । स्तनधारियों की तरह, डी. रेरियो में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली होती है जिसमें बी और टी लिम्फोसाइट्स शामिल होते हैं । zebrafish लिम्फोपोइसिस के अध्ययन मुश्किल है क्योंकि एंटीबॉडी D. rerio सेल सतह मार्कर आम तौर पर उपलब्ध नहीं हैं, अलगाव और विभिन्न लिम्फोसाइट आबादी के लक्षण वर्णन, बी-वंश सहित कक्षों. वंश-विशिष्ट फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक लाइनें अक्सर इस चुनौती को दरकिनार करने के लिए उपयोग किया जाता है । ट्रांसजेनिक lck: egfp लाइन डी rerio टी सेल विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह भी मॉडल टी सेल विकास और तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) के लिए उपयोग किया गया है. हालांकि lck: egfp मछली व्यापक रूप से टी वंश का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, वे बी कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है. हाल ही में, हमें पता चला कि कई zebrafish बी कोशिकाओं को भी lckएक्सप्रेस, निचले स्तर पर । नतीजतन, lck: egfp बी कोशिकाओं को इसी तरह gfp के निंन स्तर व्यक्त करते हैं । इस खोज के आधार पर, हम lck से बी-वंश कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित : egfp zebrafish, जो हम यहाँ रिपोर्ट. हमारे विधि का वर्णन कैसे एक फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल सॉर्टर का उपयोग करने के लिए (facs) lck से बी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए : egfp मछली या संबंधित लाइनों, इस तरह के रूप में डबल transgenic rag2: hmyc; lck: egfp मछली । इन पंक्तियों में, बी कोशिकाओं, विशेष रूप से अपरिपक्व बी कोशिकाओं, कम लेकिन detectable स्तर पर एक्सप्रेस gfp, उंहें टी कोशिकाओं है, जो gfp उच्च एक्सप्रेस से प्रतिष्ठित होने की अनुमति । बी कोशिकाओं को मज्जा, थाइमस, प्लीहा, रक्त, या अन्य ऊतकों से अलग किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल डी. रीरियो बी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए एक नई विधि प्रदान करता है, जिससे बी सेल विकास और बी लिम्फोसाइट दुर्मताओं जैसे विषयों पर केंद्रित अध्ययनों को सक्षम किया जा सके ।
Introduction
zebrafish इस तरह के आनुवंशिक जोड़तोड़, उच्च फेकुडिटी, ऑप्टिकल पारभासी, और तेजी से विकास के रूप में शक्तिशाली गुण प्रदान करते हैं जो आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग कर रीढ़ के विकास का अध्ययन करने में मदद करते हैं । ये फायदे, एक साथ teleost और स्तनधारी हेमटोपोइसिस की साझा सुविधाओं के साथ, और वयस्कता भर में लार्वा में उनकी जल्द उपस्थिति से लसीकापोइसिस और लिम्फोसाइट समारोह के vivo विश्लेषण में के लिए डी. रीरियो आदर्श बनाते हैं । zebrafish में रक्त विकास अच्छी तरह से संरक्षित आनुवंशिक प्रक्रियाओं है कि स्तनधारियों के साथ साझा कर रहे है पर निर्भर करता है, और इन अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए विस्तार । इसके अतिरिक्त, लिम्फोइड विकास को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को zebrafish और स्तनधारियों के बीच उल्लेखनीय रूप से संरक्षित किया जाता है1.
पिछले 2 दशकों में, ट्रांसजेनिक D. rerio लाइनों है कि लेबल विशिष्ट रक्त वंश और उत्परिवर्ती लाइनों इन प्रजातियों में कमी2,3,4,5बनाया गया है । इनमें से एक, lck: egfp ट्रांसजेनिक लाइन, zebrafish लिम्फोसाइट प्रोटीन tyrosine काइनेज (lck) प्रवर्तक gfp अभिव्यक्ति6ड्राइव करने के लिए उपयोग करता है. यह जीन, जो अत्यधिक दोनों टी-वंश पूर्ववर्ती और परिपक्व टी लिम्फोसाइटों द्वारा व्यक्त किया जाता है, वीवो में thymic टी सेल विकास और टी-वंश कोशिकाओं के पूर्व vivo शुद्धि के facs7द्वारा की अनुमति देता है । पहले, हम एक आगे-जेनेटिक ENU मुताजेनेसिस स्क्रीन में इस लाइन का इस्तेमाल किया कोशिका जो जर्मलाइन टी के लिए प्रवण म्यूटेंट की पहचान करने के लिए सभी और का अध्ययन करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से प्राप्त जेनेटिक टी सेल oncogenesis8,9से जुड़े घटनाओं ।
हाल ही में, हमारी प्रयोगशाला ने lck की उपयोगिता को आगे बढ़ाया : egfp zebrafish. In double-transgenic rag2: hmyc (ह्यूमन myc), lck: egfp D. rerio जो T-all 10को विकसित करने के लिए जाना जाता है, हमें पता चला कि B-lineage सभी भी11होते हैं । टी के विपरीत सभी इस मॉडल में, जो fluoresce उच्च gfp अभिव्यक्ति की वजह से तेज, बी-सभी dimly कम gfp स्तर के कारण फ्लोरोसेंट रहे हैं, बी के साथ मछली की अनुमति सभी टी के साथ उन लोगों से घोर प्रतिष्ठित हो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा सभी । यह अंतर gfp व्यंजक gfplo B-सभी कोशिकाओं से gfphi T-सभी कक्षों को facs11का उपयोग करके अलग करने की अनुमति भी देता है. इसके अलावा, कम lck अभिव्यक्ति zebrafish बी सभी के लिए अद्वितीय नहीं है, मानव बी के रूप में सभी भी lck11,12के निंन स्तर को व्यक्त करते हैं । इसी तरह, डी. रीरियो, चूहों, और मनुष्यों की सामान्य बी-वंश कोशिकाएं भी lck/lck/lckके निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं, अपरिपक्व बी कोशिकाओं के साथ उच्चतम अभिव्यक्ति11,13. प्रति सेल आधार पर, lckegfp zebrafish या डेरिवेटिव लाइनों एक्सप्रेस 1-10% में बी-वंश कोशिकाओं टी लिम्फोसाइटों के रूप में ज्यादा gfp के रूप में. इन gfpलो कोशिकाओं pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, और दूसरों के रूप में विशेषता बी सेल mrnas एक्सप्रेस, और मज्जा से शुद्ध किया जा सकता है, थाइमस, प्लीहा, या परिधीय रक्त11. इसलिए, दोनों बी और टी वंश कोशिकाओं lckegfp zebrafish से अलग किया जा सकता है, और rag2hMYCके मामले में, lckegfp जानवरों, बी-और टी सभी कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से11।
यहां, हम lck से गैर-घातक बी कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक facs-शुद्ध करने के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं : egfp zebrafish, और rag2hMYCके गैर घातक या घातक बी कोशिकाओं; lck: egfp मछली, विभिंन स्रोत के ऊतकों का उपयोग कर । ऐसी कोशिकाओं को इसी तरह facs अलगाव के बिना प्रवाह cytometry द्वारा मात्रा निर्धारित जा सकता है, अगर वांछित । कम lck अभिव्यक्ति की खोज-और फलस्वरूप, कम gfp अभिव्यक्ति बी कोशिकाओं द्वारा lckegfp zebrafish के लिए प्रयोगात्मक संभावनाओं के नए दरवाजे खोलता है, जैसे कि वीवो बी सेल विकासात्मक अध्ययन में । इस प्रकार, यह ट्रांसजेनिक लाइन, पहले २००४ में रिपोर्ट, नए जीवन के रूप में हम इसे ताजा zebrafish अनुकूली प्रतिरक्षा के विषय में अंतर्दृष्टि के लिए उपयोग करना चाहते हैं ।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं zebrafish शामिल संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (iacuc) द्वारा ओकलाहोमा स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय में अनुमोदित किया गया ।
1. ट्रांसजेनिक lck से गैर घातक बी और टी लिम्फोसाइटों isolating : egfp मछली
- मछली प्रणाली के पानी में ०.०२% tricaine (MS-२२२) का उपयोग कर मछली एनेस्थेटिज ।
- 2 की जांच करें-6 महीने की मछली फ्लोरोसेंट thymi, जो zebrafish और अंय14teleosts की क्लोम गुहा के डोर्सोडायल पहलू पर स्थित हैं । जीएफपी का पता लगाने के लिए एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप (470/40 उत्तेजन तरंगदैर्घ्य और 525/50 उत्सर्जन फिल्टर) का उपयोग करें ।
- पहले से तैयार करें ५० मिलीलीटर फ़िल्टर-निष्फल 1x roswell पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (rpmi) जिसमें 1% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (छंटाई मीडिया) शामिल हैं । अप्रयुक्त छंटाई मीडिया 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
- यह लगभग 5 मिनट के लिए ०.२% tricaine युक्त एक बीकर में रखकर मछली euthanize, बर्फ स्नान विसर्जन के बाद । ऑपरेकुलर (गिल) मूवमेंट की प्रेक्टिस से मौत की पुष्टि करें ।
- एक पेट्री डिश में euthanized मछली प्लेस और ब्याज की लिम्फोइड अंगों काटना, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने gfp+ thymi14काटना, और उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स गुर्दे मज्जा और तिल्ली15काटना । यहां प्रस्तुत परिणाम 3 महीने पुरानी मछली का उपयोग कर प्राप्त किए गए । लिम्फोसाइट अनुपात और निरपेक्ष संख्या उम्र और जीनोटाइप से बदलती है (आगे विस्तार के लिए चर्चा देखें).
- एक १.५ मिलीलीटर ठंड छंटाई मीडिया के ५०० μl युक्त ट्यूब में प्रत्येक विच्छेद अंग प्लेस ।
- एक खल माइक्रो ट्यूब homogenize का उपयोग कर बर्फ पर ऊतक homogenize ।
- एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए एक ३५ μm मेष फिल्टर के माध्यम से homogenized ऊतक गुजरती हैं । कोशिकाओं को बर्फ पर विश्लेषण तक रखें.
2. डबल ट्रांसजेनिक rag2 से घातक लिम्फोसाइटों अलग : hmyc; lck: egfp zebrafish
-
2-4 महीने में शुरुआत, microscopically स्क्रीन rag2: hmyc; lck: असामान्य gfp पैटर्न के लिए egfp मछली.
नोट: बी कोशिकाओं lck में gfpलो कर रहे हैं : egfp पृष्ठभूमि, तो बी-सभी को पहचानने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है; टी सभी स्पष्ट है, क्योंकि टी कोशिकाओं gfpहायरहे हैं । नतीजतन, rag2: hmyc, lck: egfp दोहरी-ट्रांसजेनिक लाइन दो phenotypes है: चमकीले फ्लोरोसेंट टी-सभी, जो आम तौर पर थाइमस से उठता है और शरीर में विस्तार, और dimly-फ्लोरोसेंट बी-सभी ।- एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हुए, स्क्रीन "कम एक्सपोज़र" सेटिंग (२०० ms, 2.4 x लाभ) का उपयोग करके उज्ज्वल टी-ऑल (चित्र 1a) और "उच्च एक्सपोज़र" (१.५ s, 3.4 x लाभ) की पहचान करने के लिए मंद B-all (चित्र 1a) को पहचानें । wt नियंत्रण और पूर्व ल्यूकेमिक मछली केवल थाइमस (चित्रा 1b) में स्थानीयकृत gfp है ।
- एनेस्थेटाइज़ और मछलियों की जांच करें जैसा कि चरण 1.1 – 1.2 में वर्णित है ।
- एक साधारण तीन वर्ग प्रणाली का उपयोग कर, gfp प्रतिदीप्ति की हद के आधार पर मछली वर्गीकृत:
नोट: स्तर 1: प्रतिदीप्ति केवल सीमित स्थानीय प्रसार के साथ एक thymic ट्यूमर के रूप में प्रकट होता है ।
स्तर 2: प्रतिदीप्ति थाइमस से परे प्रकट होता है, जिसमें शरीर का 50% < शामिल होता है ।
स्तर 3: प्रतिदीप्ति शरीर के ५०% से परे फैली हुई है । - कैंसर के बिना उन लोगों से सभी के साथ मछली अलग । मॉनिटर पूर्व ल्यूसेमिक मछली (यानी, gfp+ ट्यूमर के बिना मछली) एक बार नए सभी के विकास के लिए मासिक । द्वारा ~ 9 महीने, सभी rag2: hmyc, lck: egfp मछली टी सभी, बी सभी, या दोनों का विकास ।
- टी के लिए या बी-सभी सेल अलगाव, स्तर का चयन 3 मछली (सभी शामिल > 50% शरीर के), जो अधिक से अधिक 2 x 106 सभी कोशिकाओं, और आम तौर पर कई और अधिक उपज ।
- १.४ कदम में मछली के रूप में euthanize ।
नोट: सभी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए दो तरीके हैं: पूरे शरीर एकरूपता और एक पेरिटोनियल धोने तकनीक16. विधियों छंटाई के लिए एकत्र कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या में अलग है, और इस प्रकार, facs समय की मात्रा की आवश्यकता है और लागत (आगे विस्तार के लिए चर्चा देखें) । - या तो विधि के लिए, पहले एक पेट्री डिश में euthanized मछली जगह और एक रेसर ब्लेड का उपयोग कर, thymic क्षेत्र सहित सिर को हटा दें । यह अलग से संसाधित किया जा सकता है, यदि वांछित, या हिस्टोलॉजिकल धुंधला के लिए इस्तेमाल किया ।
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पेरिटोनियल वॉश विधि
- एक P1000 pipette का उपयोग करना, ठंड छंटाई मीडिया के ५०० μl के साथ मछली पेरिटोनियल गुहा धोने, एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं और मीडिया का संग्रह ।
- एक ताजा पिपेट टिप का उपयोग, शरीर गुहा में ठंड छंटाई मीडिया के एक अतिरिक्त 200-300 μl सुई । फिर, पिपेट की नोक का उपयोग, शरीर गुहा से बाहर कोशिकाओं बाहर निकालना करने के लिए मछली शरीर के लिए कोमल दबाव लागू होते हैं । इस मीडिया लीजिए और 5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें ।
- कदम 2.8.2 2-3 बार दोहराएं । एकत्र कोशिकाओं बर्फ पर मीडिया छंटाई में रखो ।
- सेल निलंबन फ़िल्टर हालांकि एक ३५ μm मेष फ़िल्टर से पहले प्रवाह cytometry/facs और विश्लेषण तक बर्फ पर कोशिकाओं रखें ।
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पूरे शरीर homogenization
- मछली सिर को हटाने के बाद, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब छंटाई मीडिया के २०० μl युक्त में शरीर जगह है ।
- एक खल माइक्रो ट्यूब homogenize का उपयोग कर शरीर homogenize ।
- शीत छंटाई मीडिया के एक अतिरिक्त ३०० μl जोड़ें । एक ३५ μm मेष फिल्टर हालांकि सेल निलंबन फ़िल्टर । फिल्टर के माध्यम से सभी कोशिकाओं को धोने की जरूरत के रूप में छंटाई मीडिया जोड़ें, जब तक केवल ऊतक मलबे फिल्टर पर रहता है । कोशिकाओं को बर्फ पर विश्लेषण तक रखें.
3. सामान्य या घातक बी लिम्फोसाइटों के cytometric विश्लेषण
- निर्माता की मार्गदर्शिका के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण और/या facs पैरामीटर्स सेट करें ।
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शुरू में नमूना की विशेषता के लिए घटनाओं की वांछित संख्या प्राप्त करें । बाद छंटाई चरणों के लिए विशिष्ट गेट्स का निर्धारण करने के लिए छंटाई करने से पहले 1 x 104 से 5 x 104 घटनाओं का विश्लेषण करें ।
- गेट्स निर्धारित करें: सेलुलर मलबे (चित्रा 2a-सी)17को छोड़कर आगे तितर बितर (fsc) और साइड कैटरिंग (एसएससी) मापदंडों का उपयोग कर लिम्फोसाइट और जनक सेल गेट्स को परिभाषित । एफएससी और एसएससी क्रमशः सेल आकार/व्यास और ग्रैनुलैरिटी के अनुरूप हैं ।
नोट: gfp-, gfplo, और gfphi कोशिकाओं को उनके gfp प्रतिदीप्ति तीव्रता के मामले में 10-से-१००-गुना अलग, इन आबादियों सीधा (आंकड़े 2-5) का पृथक्करण कर रही है । लाइव-डेड भेदभाव प्रोपिडियम आयोडीन (पीआई) या 7-aminoactinomycin डी (7-aaad) व्यवहार्यता धुंधला का उपयोग कर इस बिंदु पर मूल्यांकन किया जा सकता है । PI के साथ पिछले प्रयोग आमतौर पर facs के बाद gfp+ कोशिकाओं की > 95% व्यवहार्यता प्रदर्शित करता है । - इस्तेमाल किया जा रहा facs मशीन के मापदंडों के अनुसार, सेल doublets बाहर ।
- लिम्फोइड और/या अग्रदूत गेट्स के भीतर, gfp+ कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत का निर्धारण करते हैं ।
- गेट्स निर्धारित करें: सेलुलर मलबे (चित्रा 2a-सी)17को छोड़कर आगे तितर बितर (fsc) और साइड कैटरिंग (एसएससी) मापदंडों का उपयोग कर लिम्फोसाइट और जनक सेल गेट्स को परिभाषित । एफएससी और एसएससी क्रमशः सेल आकार/व्यास और ग्रैनुलैरिटी के अनुरूप हैं ।
- phycoerythrin (PE) और gfp तीव्रता का उपयोग करें, gfp- बनाम gfplo बनाम gfphi कोशिकाओं के लिए गेट को परिभाषित.
नोट: बी कोशिकाओं प्रदर्शन मंद gfp प्रतिदीप्ति और टी कोशिकाओं lck में उज्ज्वल gfp दिखा : egfp लाइनों । कई लिम्फोइड अंगों या ट्यूमर के नमूनों में दोनों जीएफपी+ आबादी होते हैं । बी-वंश कोशिकाओं/बी-सभी gfpलो और टी-वंश कोशिकाओं रहे हैं-सभी gfpहायरहे हैं । gfp-, gfplo, और gfphi कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए गेट्स को परिभाषित करें, और इन आबादियों को अलग से इकट्ठा (चित्रा 2a-c, चित्रा 3a-c, चित्रा 4a और चित्रा 5a). - छंटाई मीडिया, या सीधे अलग १.५ मिलीलीटर आगे विश्लेषण (जैसे, आरएनए, डीएनए, या प्रोटीन निष्कर्षण, एलो-ट्रांसप्लांटेशन, आदि) के लिए एक उपयुक्त बफर युक्त ट्यूबों में की 2 मिलीलीटर युक्त अलग 15 मिलीलीटर polypropylene ट्यूबों में प्रत्येक कोशिका आबादी सॉर्ट करें ।
- आगे विश्लेषण करने से पहले बर्फ पर शुद्ध कोशिकाओं रखें ।
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Representative Results
हम का विश्लेषण करने के लिए प्रवाह cytometry का इस्तेमाल किया और facs gfplo और gfpहाय कोशिकाओं को अलग करने के लिए थाइमस, गुर्दे मज्जा, और lck की प्लीहा : egfp ट्रांसजेनिक zebrafish. 3 महीने की मछली के विश्लेषण से पता चला थाइमस शामिल ज्यादातर gfp+ लिम्फोसाइटों. gfp+ कोशिकाओं को काफी हद तक पहले traver एट अल.17द्वारा वर्णित लिम्फोइड गेट तक ही सीमित थे । दो अलग gfp+ आबादी, gfpलोऔर gfpहाय, थाइमस में देखा जासकता है . gfpहाय लिम्फोसाइटों एक उच्च प्रतिशत का प्रतिनिधित्व किया, ~ ६०%, जबकि gfpलो कोशिकाओं को कम प्रचुर मात्रा में थे, कुल thymic लिम्फोसाइटों की ~ ४०% का प्रतिनिधित्व (तालिका 1). स्तनधारियों के विपरीत, मछली हेमटोपोइटिक मज्जा गुर्दे के भीतर स्थानीयकृत है, बजाय हड्डी के भीतर । हम गुर्दे मज्जा में रहने वाले बी कोशिकाओं निर्धारित भी gfp (चित्रा 2b और चित्रा 3 बी) के निम्न स्तर को व्यक्त करते हैं । gfpलो मज्जा में कोशिकाओं को प्रचुर मात्रा में थे, जबकि gfpहाय कोशिकाओं दुर्लभ थे (चित्रा 2b और चित्रा 3b)), यह दर्शाता है कि टी लिम्फोसाइटों का केवल एक छोटा सा प्रतिशत में मज्जा में मौजूद थे 3 उम्र के महीने. प्लीहा के नमूने इसी तरह gfphi कोशिकाओं (चित्रा 2c और चित्रा 3c) की तुलना में जीएफपीलो के उच्च प्रतिशत दिखाया । हम भी गैर घातक लिम्फोसाइटों थाइमस से विश्लेषण, मज्जा, और डबल ट्रांसजेनिक lck की प्लीहा : egfp; rag2: hmyc zebrafish, जो दोनों बी और टी सभी11के लिए प्रवण हैं. मछली है कि अभी तक सभी विकसित नहीं किया था, थाइमस, मज्जा, और तिल्ली से परिणाम एकल ट्रांसजेनिक lck: egfp मछली के समान थे । हालांकि, प्रति अंग लिम्फोसाइटों की संख्या बढ़ गई (चित्रा 3), शायद myc के कारण-अपरिपक्व बी और टी सेल आबादी के विस्तार संचालित जहां rag2 promotion सक्रिय है.
हम भी बी के साथ डबल ट्रांसजेनिक मछली का विश्लेषण और/या टी-सभी कि 6 महीने से फ्लोरोसेंट कैंसर विकसित किया था । जाहिर है, बी dimly फ्लोरोसेंट कैंसर के साथ सभी मछली ज्यादातर gfpलो कोशिकाओं (चित्रा 4a) निहित । इसके विपरीत, चमकीले-फ्लोरोसेंट मछली या तो अलग टी बंदरगाह कर सकते है सभी gfpलो बी के सभी या मिश्रित आबादी-सभी और gfpहाय टी सभी कोशिकाओं (चित्रा 5) । मिश्रित सभी का एक उदाहरण है, जो अलग बी-और टी सब शामिल है, यहां दिखाया गया है (चित्रा 5) । b-और t-वंश के रूप में gfplo और gfphi कोशिकाओं की पहचान की पुष्टि करने के लिए क्रमशः, हमने मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (qrt-pcr) द्वारा b-और t-cell-विशिष्ट ट्रांस्क्रिप्ट्स का विश्लेषण किया. हमारे परिणाम दिखाएँ gfpलो कोशिकाओं बी सेल ट्रांस्क्रिप्ट्स के उच्च स्तर एक्सप्रेस और gfpहाय कोशिकाओं टी सेल जीन के उच्च स्तर को व्यक्त (चित्रा 2d, चित्रा3 डी, चित्रा 4b और चित्रा 5b). इसके अलावा, gfplo में lck और gfp की अभिव्यक्ति सभी बी-ऑल (चित्रा 2d, चित्रा3 डी, चित्रा4b के vivo gfp प्रतिदीप्ति में मंद करने के लिए संगत और चित्रा5b; qrt-पीसीआर शर्तों और प्राइमरों पहले borga एट अल द्वारा वर्णित दृश्यों.) 11.
चित्रा 1: lck में अलग प्रतिदीप्ति पैटर्न : egfp ट्रांसजेनिक मछली. (क) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी rag2 के चित्र : hmyc; lck: उज्ज्वल के साथ egfp मछली-फ्लोरोसेंट टी सभी (बाएं) या dimly फ्लोरोसेंट बी-सभी (दाएं) । T-ALL कम एक्सपोज़र सेटिंग के साथ दिखाई देता है; B-सभी को केवल उच्च एक्सपोजर का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है । (ख) उच्च एक्सपोजर सेटिंग्स दिखाएं बेहोश thymic फ्लोरेसेंस (पीला हलकों) जंगली प्रकार lck में: egfp मछली (बाएं) और rag2: hmyc; lck: egfp डबल ट्रांसजेनिक मछली सभी (सही) के बिना । स्केल पट्टियां = 20 मिमी. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2: lck में लिम्फोसाइट आबादी : egfp zebrafish. शीर्ष पर छवियां एक 3 महीने पुराने wt, lck: उच्च प्रदर्शन सेटिंग्स या कंप्यूटर के साथ egfp मछली-वृद्धि (दृश्य की सुविधा के लिए) दिखाओ । स्केल पट्टियां = 20 मिमी. थाइमस (ए), मज्जा (बी), और प्लीहा (सी) के साइटोमेट्रिक विश्लेषण का प्रवाह । वाम पैनलों fsc (एक्स अक्ष) और एसएससी (y-अक्ष) दिखाने के लिए, काले अंडाकार लिम्फोसाइट गेट्स का संकेत के साथ । मध्य पैनलों को gfp (x-अक्ष) और PE (y-अक्ष) के साथ प्रतिदीप्ति-आधारित गेटिंग दर्शाती है । gfphi (नीला आयत), gfplo (हरा आयत) और gfp- (black ovals) आबादियों को दिखाया गया है । दायां पैनल gfphi और gfplo कोशिकाओं के हिस्टोग्राम को प्रदर्शित करते हैं । डैश्ड रेखाएं मध्य पैनल्स में गेटिंग मापदंड दर्शाती हैं । (घ) wt lck: egfp thymi gfphi (नीला) और gfplo (हरा) के लिए सॉर्ट किया जाता है । बी सेल जीन की अभिव्यक्ति (pax5), टी (सीडी4) सेल विशिष्ट जीन), lck और gfp। परिणाम हाउसकीपिंग जीन (β-actin और eef1a1l1) के लिए सामान्यीकृत हैं और गुना-परिवर्तन ± मानक त्रुटि (एस. ई) के रूप में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3: पूर्व leukemic rag2 में लिम्फोसाइट आबादी : hmyc; lck: egfp zebrafish. शीर्ष पर छवियां एक 3 महीनेपुराने rag2 दिखाएं: hmyc; lck: egfp मछली उच्च और कंप्यूटर के साथ बढ़ाया एक्सपोजर । स्केल बार = 20 मिमी. पार्ट्स ए-डी के पैनलों को चित्रा 2के समान प्रारूप में दर्शाया गया है । (घ) pax5, सीडी4, lckकी अभिव्यक्ति, और facs में gfp -शुद्ध thymic gfpलो (ग्रीन) gfpहाय (नीला) lck की सेल आबादी : egfp मछली । qrt-पीसीआर परिणाम गुना के रूप में दिखाया-परिवर्तन ± एसई कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कर रहे हैं ।
चित्रा 4: B-ALL rag2 का विश्लेषण : hmyc; lck: egfp ट्रांसजेनिक मछली. (क) शीर्ष: 6-माह-पुराना rag2: hmyc; lck: B-सभी उच्च एक्सपोज़र सेटिंग का उपयोग करके egfp मछली । मछली के शरीर से अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक समान स्वरूप है 2 चित्रा। (ख) बी में जीन अभिव्यक्ति-सभी gfpलो कोशिकाओं ( चित्रा 4aमें ग्रीन गेट), rag2: hmyc; lck: egfp gfpहाय thymocytes ( चित्रा 3aमें ब्लू गेट), और टी सभी gfpहाय कोशिकाओं (ब्लू गेट चित्रा 5a में ). बी की अभिव्यक्ति (pax5, cd79a) और टी (सीडी4) सेल-विशिष्ट जीन, lck, और gfp। परिणाम हाउसकीपिंग जीन (β-actin और eef1a1l1) के लिए सामान्यीकृत हैं और गुना-परिवर्तन ± एसई स्केल बार = 20 मिमी के रूप में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5: मिश्रित सभी rag2 का विश्लेषण : hmyc; lck: egfp ट्रांसजेनिक मछली. (क) शीर्ष: 6 माह-पुराना rag2: hmyc; lck: मिश्रित के साथ egfp मछली-सभी उच्च जोखिम सेटिंग का उपयोग कर । मछली के शरीर से अलग ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए एक समान स्वरूप है 2 चित्रा। (ख) gfphi (नीला) और gfplo (हरा) facs गेट्स. बी की अभिव्यक्ति (pax5, cd79a) और टी (सीडी4) सेल-विशिष्ट जीन, lck, और gfp। परिणाम हाउसकीपिंग जीन (β-actin और eef1a1l1) के लिए सामान्यीकृत हैं और गुना-परिवर्तन ± एसई स्केल बार = 20 मिमी के रूप में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
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Discussion
हम विकसित और lck से बी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान : egfp ट्रांसजेनिक zebrafish, बी-वंश लेबल3,4के साथ अन्य डी. रेरियो मॉडल के लिए इस जोड़ने. कुछ आश्चर्य की बात है, इस लाइन में gfpलो बी कोशिकाओं की पहचान २००४ में अपने विवरण के बाद से किसी का ध्यान नहीं चला गया । आम तौर पर, lck टी सेल विशिष्ट6माना जाता है, लेकिन हाल के अध्ययनों प्राकृतिक हत्यारा और माइलॉयड कोशिकाओं द्वारा अप्रत्याशित lck अभिव्यक्ति पाया, साथ ही बी कोशिकाओं में के रूप में यहां दिखाया18,19। हमारी खोज के साथ समझौते में है कि zebrafish बी कोशिकाओं gfpलो, पूर्व बी, भोली हैं, और परिपक्व बी कोशिकाओं मनुष्यों में भी lck11,13के निंन स्तर को व्यक्त करते हैं ।
इन मछलियों के बी और टी कोशिकाओं में भिन्न gfp स्तरों के कारण, दोनों प्रजातियों की कोशिकाओं को अब इस लाइन से अलग किया जा सकता है । हालांकि इन जानवरों प्रतिष्ठित thymic टी लिम्फोसाइट विकास और ट्रैकिंग अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हम इस तरह के अध्ययनों बी कोशिकाओं के साथ भी संभव है कि प्रदर्शन. इस अंत करने के लिए, हम thymus में बी कोशिकाओं की पहचान, गुर्दे मज्जा, और प्लीहा यहां, और परिधीय रक्त में और अन्य जगहों पर पहले काम11.
पहचानने B-ALL in rag2: hmyc; lck: egfp मछली एक गहरी आंख की आवश्यकता है, लेकिन अभ्यास के साथ, सीधा है । इसके बाद, सभी कक्षों को शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि चुनना महत्वपूर्ण है । यहां, हम दो तरीकों वर्तमान: पेरिटोनियल धोने और पूरे शरीर homogenization । पेरिटोनियल धोने कुल कोशिकाओं की एक बहुत कम संख्या में पैदावार, लेकिन gfp+ कोशिकाओं का एक बहुत ही उच्च प्रतिशत. नतीजतन, लागत को कम करने के लिए छोटे facs समय की आवश्यकता होती है । डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, जहां कुल उपज कम महत्वपूर्ण है (जैसे, qrt-पीसीआर), यह अधिक कुशल है । वैकल्पिक रूप से, पूरे शरीर एकरूपता कई और अधिक कोशिकाओं से युक्त बड़े एकल सेल निलंबन में परिणाम है, लेकिन कोशिकाओं का एक कम प्रतिशत gfp+हो जाएगा । इस प्रकार, अधिक facs समय पेरिटोनियल धोने के साथ के रूप में gfp+ कोशिकाओं की एक ही नंबर इकट्ठा करने के लिए आवश्यक है, लेकिन लाखों अधिक कोशिकाओं शुद्ध किया जा सकता है. डाउनस्ट्रीम अध्ययन के लिए, जहां उच्च उपज महत्वपूर्ण है (जैसे, वेस्टर्न ब्लॉट), यह जोड़ा लागत ऑफसेट हो सकता है । इसके अलावा, सभी अध्ययनों के लिए, कुल शरीर एकरूपता मौजूद कैंसर की कोशिकाओं की विविधता, और अधिक सही ट्यूमर heterogeneity का प्रतिनिधित्व कब्जा । हालांकि हमारे प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध नहीं है, यह भी संभव है केवल gfp+ शरीर क्षेत्रों/एक पेट्री डिश में नख़रेबाज़ द्वारा एकरूपता के लिए सभी के साथ मछली से अंगों को काटना, इस प्रकार कुल facs समय और लागत को कम करने, पेरिटोनियल धोने के सदृश ।
lck में thymic gfp अभिव्यक्ति : egfp मछली पता चला है कि gfp 5 dpf6के रूप में जल्दी के रूप में detectable है । हमारे यहां अध्ययन वयस्क मछली में प्रदर्शन किया गया उंर या पुराने के 3 महीने, और पता चलता है कि इस उंर में, बी कोशिकाओं गुर्दे मज्जा और प्लीहा में प्रचुर मात्रा में हैं, लेकिन टी कोशिकाओं दुर्लभ हैं । विभिन्न युगों की मछलियों के साथ बाद के अध्ययनों से यह निर्धारित करने की आवश्यकता होगी कि विभिन्न समय बिंदुओं पर टी कोशिकाएं अधिक प्रचलित हैं । इसी तरह, 3 महीने में, टी कोशिकाओं थाइमस में समृद्ध कर रहे हैं, लेकिन thymus बी कोशिकाओं की एक काफी संख्या में भी मौजूद हैं । यदि इन लिम्फोसाइट आबादी विभिंन उंर में बदलती वर्तमान में अज्ञात है, लेकिन कुल मिलाकर, lck में thymic प्रतिदीप्ति fades : egfp यौन परिपक्वता (~ 3 महीने) में मछली शुरुआत है, तो यह संभावना है कि टी सेल संख्या बढ़ती उंर के साथ कम है, और बी कोशिकाओं हो सकता है भी. इसी तरह, जब gfpलो बी कोशिकाओं zebrafish थाइमस वर्तमान में अज्ञात है । lck का प्रयोग: egfp मछली, यह अब thymic बी और टी सेल विकास, आमद, efflux, और इन घटनाओं के विशिष्ट कैनेटीक्स पर नजर रखने के लिए संभव है । इसके अलावा, इस तरह के सवाल अन्य परमाणु साइटों के लिए भी प्रासंगिक हैं, जहां बी कोशिकाएं रहते हैं, जैसे गुर्दे मज्जा, प्लीहा, रक्त, और आंत (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।
बी सेल विकासात्मक अध्ययन के अलावा, हम हाल ही में बी lck में सभी: egfpपाया; rag2: hmyc डबल ट्रांसजेनिक मछली11. transgenic rag2: hmyc टी प्रेरित करने के लिए जाना जाता था-सभी10 लेकिन बी-सभी अपरिचित चला गया था. इस oncogene के उच्च मर्मकरण के कारण, सभी के दोनों प्रकार के इन मछली में प्रचलित हैं, और कई मछली वास्तव में दोनों सभी प्रकार के एक साथ11का विकास । चूंकि B-सभी gfploहैं, जबकि T-all gfphiहैं, तो gfp अभिव्यक्ति बदलती है, इन दो संस्थाओं को facs द्वारा पृथक होने की अनुमति देती है, यहां तक कि जब एक ही जानवर में होती है (चित्र 5a) । महत्वपूर्ण रूप से, दोनों सामान्य और घातक लिम्फोसाइटों में, qrt-pcrresults प्रदर्शित करता है कि gfplo और gfpहाय कोशिकाओं लगातार बी-और टी-वंश के अनुरूप, क्रमशः (चित्रा 2 और चित्रा 3).
lck की अप्रयुक्त क्षमता : egfp मछली इस काम करने के लिए केंद्रीय था, तथ्य यह है कि कई पूर्व मौजूदा ट्रांसजेनिक लाइनों की संभावना अपने इच्छित उद्देश्य से परे उपयोगिता पर प्रकाश डाला । यहां, हम ट्रांसजेनिक lck के साथ डी. रेरियो से बी और टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक उपन्यास प्रोटोकॉल प्रस्तुत : egfp, सामान्य और घातक बी लिम्फोसाइटों के विषय में नए इंवेस्टिगेशनल रास्ते के लिए दरवाजा खोलने. ऐसे अध्ययनों के परिणाम निस्संदेह फिर से क्या पहले से ही हेमटोपोइजिस, लिंफोपोइसिस, और कैंसर जीव विज्ञान क्षेत्रों के लिए एक मूल्यवान संसाधन किया गया है vitalize होगा ।
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Disclosures
लेखकों हितों का कोई टकराव की घोषणा ।
Acknowledgments
हम मेलोन का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-पेरेस zebrafish देखभाल के लिए, और ouhsc प्रवाह cytometry कोर । इस काम के लिए अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था हुंडई होप ऑन व्हील्स, ओक्लाहोमा केंद्र की उन्नति के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी (hrp-०६७), एक nih/ jkf बच्चों के अस्पताल फाउंडेशन के बाल चिकित्सा रुधिर-ऑन्कोलॉजी में e.l. & थेलमा gaylord संपन्न कुर्सी रखती है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
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