Summary

Isolere Malignant og ikke-Malignant B celler fra lck:eGFP sebrafisk

Published: February 22, 2019
doi:

Summary

Transgene lck:eGFP sebrafisk uttrykke GFP svært T-lymfocytter, og har blitt brukt til å studere T celle utvikling og akutt lymfatisk leukemi. Denne linjen kan brukes til å studere B celler, som uttrykker lck på lavere nivåer. Denne protokollen beskriver rensing av ondsinnethet og ikke-ondartet B celler fra lck:eGFP sebrafisk.

Abstract

Sebrafisk (Danio rerio) er en effektiv modell å studere lymfocytt utvikling. Som pattedyr har D. rerio en adaptive immunsystemet som inneholder B- og T-lymfocytter. Studier av sebrafisk lymphopoiesis er vanskelig fordi antistoffer gjenkjenne D. rerio celle overflate markører ikke er vanligvis tilgjengelig, kompliserer isolering og karakterisering av ulike lymfocytt befolkningen, inkludert B-linjen celler. Transgene linjer med slektslinje kundespesifikk fluorophore uttrykk brukes ofte til å omgå denne utfordringen. Transgene lck:eGFP linjen er brukt til å studere D. rerio T celle utvikling og også blitt benyttet til modell T celle utvikling og akutt lymfatisk leukemi (T-alle). Selv om lck:eGFP fisk har vært mye brukt til å analysere T-linjen, har de ikke brukt til å studere B-celler. Nylig oppdaget vi at mange sebrafisk B celler også uttrykke lck, om enn på lavere nivåer. Følgelig uttrykke lck:eGFP B celler på samme måte lave nivåer av GFP. Basert på dette funnet, utviklet vi en protokoll for å rense B-lineage celler fra lck:eGFP sebrafisk, som vi rapporterte her. Vår metode beskriver hvordan å utnytte fluorescerende-aktivert celle sortering (FACS) for å rense B celler fra lck:eGFP fisk eller relaterte linjer, for eksempel dobbel-transgene rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk. I disse linjene, B celler, spesielt umodne B celler, uttrykke GFP på lav men Detektbart nivåer, slik at de kan skilles fra T-celler, som uttrykker GFP høyt. B celler kan isoleres fra benmarg, thymus, milt, blod eller andre vev. Denne protokollen gir en ny metode for å rense D. rerio B-celler, slik at studier fokuserer på temaer som B celle utvikling og B-lymfocytt malignancies.

Introduction

Sebrafisk tilbyr kraftig attributter, for eksempel genetisk manipulability, høy fruktbarhet, optisk gjennomskinnelighet og rask utvikling som letter studere virveldyrenes utvikling med genetiske metoder. Disse fordelene, sammen med de delte funksjonene av teleost og pattedyr hematopoiesis, gjør D. rerio ideelt for i vivo analyser av lymphopoiesis og lymfocytt funksjon, fra deres første opptreden i Larvene gjennom hele voksenlivet. Blod utvikling i sebrafisk avhengig godt bevart genetisk prosesser som deles med pattedyr, og dette strekker til adaptive immunsystemet. I tillegg er molekylære mekanismer som styrer lymfoide utvikling bemerkelsesverdig bevart mellom sebrafisk og pattedyr1.

De siste 2 tiårene, transgene D. rerio linjer som etiketten bestemt blod overleveringslinjer og mutant mangelfull i disse linjene er opprettet2,3,4,5. En av disse, lck:eGFP transgene linjen, bruker sebrafisk lymfocytt protein tyrosin kinase (lck) arrangøren til å kjøre GFP uttrykk6. Dette genet, svært uttrykt både T-lineage prekursorer og modne T-lymfocytter, kan i vivo sporing av thymic T celle utvikling og ex vivo rensing av T-lineage celler av FACS7. Tidligere brukte vi denne linjen i fram-genetiske ENU mutagenese skjermen å identifisere germline mutanter utsatt for T-alle og studere somatically ervervet genetisk hendelser knyttet til T celle oncogenesis8,9.

Nylig, vårt laboratorium fremme utbygget nytten av lck:eGFP sebrafisk. I dobbel-transgene rag2:hMYC (menneskelige MYC), lck:eGFP D. rerio som er kjent for å utvikle T-alle 10, vi oppdaget at B-lineage alle også oppstå11. I motsetning til T-alle i denne modellen, som fluoresce lyst på grunn av høy GFP uttrykk, B-alle er svakt-lysrør på grunn av lave GFP nivåer, slik at fisken med B-alle skilles grovt fra de med T-alle av fluorescerende mikroskopi. Differensial GFP uttrykket også tillater separasjon av GFPlo B-alle celler fra GFPHei T-alle celler ved hjelp av FACS11. Videre er lav lck uttrykket ikke unikt for sebrafisk B-alt, som menneskelige B-alle også uttrykke lave nivåer av LCK11,12. Likeledes normale B-lineage celler D. rerio, mus og mennesker uttrykker også lave nivåer av lck/Lck/LCK, med umodne B-celler har den høyeste uttrykk11,13. På per celle basis uttrykke B-lineage celler i lckeGFP sebrafisk eller derivat 1-10% så mye GFP som T-lymfocytter. Disse GFPlo celler uttrykke karakteristisk B celle mRNAs som pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzog andre, og kan bli renset fra benmarg, thymus, milt eller tilleggsutstyr blod11. Derfor isolert begge B – og T-lineage celler kan være fra sebrafisk som lckeGFP , og ved rag2hMYC, lckeGFP dyr, B – og T-alle cellene også11.

Her presenterer vi våre protokollen effektivt FACS-renser ikke-ondartet B celler fra lck:eGFP sebrafisk og ikke-ondartet eller ondartet B celler med rag2hMYC; LCK:eGFP fisker, med ulike kilde vev. Slike celler kan likeledes kvantifiseres av flowcytometri uten FACS isolasjon, om ønskelig. Oppdagelsen av lav lck uttrykk- og derfor lav GFP uttrykk-av B celler åpner nye dører eksperimentelle muligheter for lckeGFP sebrafisk, som i vivo B celle utviklingsmessige studier. Dermed har transgene linjen, først rapportert i 2004, nytt liv som vi søker å utnytte for å fange opp ny innsikt om sebrafisk adaptiv immunitet.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer sebrafisk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Oklahoma Health Sciences Center. 1. isolere ikke-ondartet B og T-lymfocytter fra transgene lck:eGFP fisk Bedøve fisken bruker 0.02% tricaine (MS-222) i fisk system vann. Undersøke 2 – 6 mnd fisk for fluorescerende thymi, som ligger på det dorsomedial aspektet ved branchial hulrom sebrafisk og andre teleoster<sup cla…

Representative Results

Vi brukte flowcytometri til å analysere og FACS isolere GFPlo og GFPHei celler fra thymus, nyre marg og milten av transgene sebrafisk som lck:eGFP . Analyse av 3-måneden-gamle fisk avdekket thymus finnes hovedsakelig GFP+ lymfocytter. GFP+ cellene var i stor grad begrenset til lymfoide gate tidligere beskrevet av Traver et al.17. To forskjellige GFP+ bestander, GFPloog GFPHei,<s…

Discussion

Vi utviklet og inneholder en protokoll for å isolere B celler fra lck:eGFP transgene sebrafisk, å legge dette til andre D. rerio modeller med B-lineage etiketter3,4. Noe overraskende, gikk identifisering av GFPlo B celler i denne linjen ubemerket siden beskrivelsen i 2004. Vanligvis lck anses å være T celle-spesifikke6, men nyere studier fant uventet lck uttrykk av naturlige morder og myel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Megan Malone-Perez for sebrafisk omsorg, og OUHSC flyt cytometri kjernen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Hyundai Hope på hjul, Oklahoma Center for fremme av vitenskap og teknologi (HRP-067), en NIH/NIGMS INBRE pilotprosjekt award (P20 GM103447). JKF holder E.L. og Thelma Gaylord utstyrt stol i pediatrisk hematologi-onkologi av barnas sykehus fundament.

Materials

35 µm mesh Sefar Filter technology 7050-1220-000-13
5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap Falcon Corning Brand 352235
50 ml conical tube VWR international 525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope Nikon
Cytoflex Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 Sigma E-10521
FACSJazz BD Biosciences
Fetal bovine Serum Thermo Fisher 10437028
FlowJo v10.2 FlowJo, LLC
lck:eGFP See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software Nikon Version 4.13
Penicilin -Streptomycin Sigma P4333
Pestle micro-tube homogenizers Electron Microscopy Sciences 64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1X Life Technologies 11835-030

References

  1. Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
  2. Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
  3. Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
  4. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
  5. Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
  6. Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
  7. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  8. Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
  9. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  10. Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
  11. Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
  12. Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
  13. Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
  14. Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
  15. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  16. Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
  17. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
  18. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  19. Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).

Play Video

Cite This Article
Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish. J. Vis. Exp. (144), e59191, doi:10.3791/59191 (2019).

View Video