Summary
Transgene lck:eGFP sebrafisk uttrykke GFP svært T-lymfocytter, og har blitt brukt til å studere T celle utvikling og akutt lymfatisk leukemi. Denne linjen kan brukes til å studere B celler, som uttrykker lck på lavere nivåer. Denne protokollen beskriver rensing av ondsinnethet og ikke-ondartet B celler fra lck:eGFP sebrafisk.
Abstract
Sebrafisk (Danio rerio) er en effektiv modell å studere lymfocytt utvikling. Som pattedyr har D. rerio en adaptive immunsystemet som inneholder B- og T-lymfocytter. Studier av sebrafisk lymphopoiesis er vanskelig fordi antistoffer gjenkjenne D. rerio celle overflate markører ikke er vanligvis tilgjengelig, kompliserer isolering og karakterisering av ulike lymfocytt befolkningen, inkludert B-linjen celler. Transgene linjer med slektslinje kundespesifikk fluorophore uttrykk brukes ofte til å omgå denne utfordringen. Transgene lck:eGFP linjen er brukt til å studere D. rerio T celle utvikling og også blitt benyttet til modell T celle utvikling og akutt lymfatisk leukemi (T-alle). Selv om lck:eGFP fisk har vært mye brukt til å analysere T-linjen, har de ikke brukt til å studere B-celler. Nylig oppdaget vi at mange sebrafisk B celler også uttrykke lck, om enn på lavere nivåer. Følgelig uttrykke lck:eGFP B celler på samme måte lave nivåer av GFP. Basert på dette funnet, utviklet vi en protokoll for å rense B-lineage celler fra lck:eGFP sebrafisk, som vi rapporterte her. Vår metode beskriver hvordan å utnytte fluorescerende-aktivert celle sortering (FACS) for å rense B celler fra lck:eGFP fisk eller relaterte linjer, for eksempel dobbel-transgene rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk. I disse linjene, B celler, spesielt umodne B celler, uttrykke GFP på lav men Detektbart nivåer, slik at de kan skilles fra T-celler, som uttrykker GFP høyt. B celler kan isoleres fra benmarg, thymus, milt, blod eller andre vev. Denne protokollen gir en ny metode for å rense D. rerio B-celler, slik at studier fokuserer på temaer som B celle utvikling og B-lymfocytt malignancies.
Introduction
Sebrafisk tilbyr kraftig attributter, for eksempel genetisk manipulability, høy fruktbarhet, optisk gjennomskinnelighet og rask utvikling som letter studere virveldyrenes utvikling med genetiske metoder. Disse fordelene, sammen med de delte funksjonene av teleost og pattedyr hematopoiesis, gjør D. rerio ideelt for i vivo analyser av lymphopoiesis og lymfocytt funksjon, fra deres første opptreden i Larvene gjennom hele voksenlivet. Blod utvikling i sebrafisk avhengig godt bevart genetisk prosesser som deles med pattedyr, og dette strekker til adaptive immunsystemet. I tillegg er molekylære mekanismer som styrer lymfoide utvikling bemerkelsesverdig bevart mellom sebrafisk og pattedyr1.
De siste 2 tiårene, transgene D. rerio linjer som etiketten bestemt blod overleveringslinjer og mutant mangelfull i disse linjene er opprettet2,3,4,5. En av disse, lck:eGFP transgene linjen, bruker sebrafisk lymfocytt protein tyrosin kinase (lck) arrangøren til å kjøre GFP uttrykk6. Dette genet, svært uttrykt både T-lineage prekursorer og modne T-lymfocytter, kan i vivo sporing av thymic T celle utvikling og ex vivo rensing av T-lineage celler av FACS7. Tidligere brukte vi denne linjen i fram-genetiske ENU mutagenese skjermen å identifisere germline mutanter utsatt for T-alle og studere somatically ervervet genetisk hendelser knyttet til T celle oncogenesis8,9.
Nylig, vårt laboratorium fremme utbygget nytten av lck:eGFP sebrafisk. I dobbel-transgene rag2:hMYC (menneskelige MYC), lck:eGFP D. rerio som er kjent for å utvikle T-alle 10, vi oppdaget at B-lineage alle også oppstå11. I motsetning til T-alle i denne modellen, som fluoresce lyst på grunn av høy GFP uttrykk, B-alle er svakt-lysrør på grunn av lave GFP nivåer, slik at fisken med B-alle skilles grovt fra de med T-alle av fluorescerende mikroskopi. Differensial GFP uttrykket også tillater separasjon av GFPlo B-alle celler fra GFPHei T-alle celler ved hjelp av FACS11. Videre er lav lck uttrykket ikke unikt for sebrafisk B-alt, som menneskelige B-alle også uttrykke lave nivåer av LCK11,12. Likeledes normale B-lineage celler D. rerio, mus og mennesker uttrykker også lave nivåer av lck/Lck/LCK, med umodne B-celler har den høyeste uttrykk11,13. På per celle basis uttrykke B-lineage celler i lckeGFP sebrafisk eller derivat 1-10% så mye GFP som T-lymfocytter. Disse GFPlo celler uttrykke karakteristisk B celle mRNAs som pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzog andre, og kan bli renset fra benmarg, thymus, milt eller tilleggsutstyr blod11. Derfor isolert begge B - og T-lineage celler kan være fra sebrafisk som lckeGFP , og ved rag2hMYC, lckeGFP dyr, B - og T-alle cellene også11.
Her presenterer vi våre protokollen effektivt FACS-renser ikke-ondartet B celler fra lck:eGFP sebrafisk og ikke-ondartet eller ondartet B celler med rag2hMYC; LCK:eGFP fisker, med ulike kilde vev. Slike celler kan likeledes kvantifiseres av flowcytometri uten FACS isolasjon, om ønskelig. Oppdagelsen av lav lck uttrykk- og derfor lav GFP uttrykk-av B celler åpner nye dører eksperimentelle muligheter for lckeGFP sebrafisk, som i vivo B celle utviklingsmessige studier. Dermed har transgene linjen, først rapportert i 2004, nytt liv som vi søker å utnytte for å fange opp ny innsikt om sebrafisk adaptiv immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer sebrafisk ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isolere ikke-ondartet B og T-lymfocytter fra transgene lck:eGFP fisk
- Bedøve fisken bruker 0.02% tricaine (MS-222) i fisk system vann.
- Undersøke 2 – 6 mnd fisk for fluorescerende thymi, som ligger på det dorsomedial aspektet ved branchial hulrom sebrafisk og andre teleoster14. Bruk en epifluorescence mikroskop 470/40 eksitasjon bølgelengde og 525/50 utslipp filter oppdage GFP.
- Forberede seg på forhånd 50 mL av filter-steriliseres 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) som inneholder 1% fosterets bovin serum og 1% penicillin-streptomycin (sortering media). Sortering er ubrukte medier kan lagres på 4 ° C for opptil 2 måneder.
- Euthanize fisken ved å plassere den i et beaker med 0,2% Tricaine i ca 5 min, etterfulgt av isen bad nedsenking. Bekreft død av opercular (gill) bevegelse.
- Legg euthanized fisken i en Petriskål og dissekere lymfoide organer av interesse, med fluorescerende mikroskopet for å dissekere den GFP+ thymi14, og lyse Feltinnstillinger mikroskopi å dissekere nyre marg og milt15. Resultatene presenteres her ble innhentet med 3 måneder gammel fisk. Lymfocytt proporsjoner og absolutte tall varierer etter alder og genotype (se diskusjon om nærmere).
- Plass hver dissekert orgel i en 1,5 mL tube som inneholder 500 µL kald sortering media.
- Homogenize vev på is med en pistil mikro-rør homogenizer.
- Homogenisert vev passere en 35 µm maske filter til å generere en enkeltcelle suspensjon. Holde cellene på is til analyse.
2. isolere ondartet lymfocytter fra dobbelt-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP sebrafisk
-
Begynnelsen på 2-4 måneder, mikroskopisk skjermen rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk for unormal GFP mønstre.
Merk: B-cellene er GFPlo i lck:eGFP bakgrunnen, så B-alle krever praksis å kjenne igjen; T-alle er åpenbare, fordi T celler er GFPHei. Følgelig, den rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgene linje har to fenotyper: lyst-fluorescerende T-alt, som vanligvis oppstår fra thymus og utvide til kroppen og svakt-fluorescerende B-ALL.- Bruke lysstoffrør mikroskop, skjermen fisken med "lav eksponering" innstillinger (200 ms, 2,4 x gevinst) for å identifisere lyse T-alle (figur 1A) og "høy eksponering" (1,5 s, 3,4 x gevinst) å identifisere dim B-alle (figur 1A). WT kontroller og pre leukemic fisk har GFP lokalisert i thymus (figur 1B).
- Bedøve og undersøke fisken som beskrevet i trinnene 1.1-1.2.
- Kategorisere fisken basert på omfanget av GFP fluorescens, med en enkel tre Kategori:
Merk: Nivå 1: Fluorescens vises som en thymic svulst med bare begrenset lokale spredt.
Nivå 2: Fluorescens vises utenfor thymus, involverer < 50% av kroppen.
Nivå 3: Fluorescens forlenger over 50% av kroppen. - Skill fisken med alt fra de uten kreft. Overvåke pre leukemic fisk (dvs. fisk uten GFP+ svulster) når månedlig for utvikling av ny alt. Av ~ 9 måneder, alle rag2:hMYC, lck:eGFP fisken utvikler T-alt, B-ALL eller begge deler.
- For T - eller B-alle celle isolasjon, Velg nivå 3 fisk (alt som involverer > 50% av kroppen), som gir mer enn 2 x 106 alle celler, og vanligvis mange flere.
- Euthanize fisken som i trinn 1.4.
Merk: Det finnes to metoder for å få alle celler: hele kroppen homogenisering og en peritoneal vask teknikk16. Metodene avvike i absolutte antallet celler samlet for sortering, og dermed mengder FACS tid nødvendig og kostnader (se diskusjon om nærmere). - For disse metodene, første Legg euthanized fisken i en Petriskål og bruker et barberblad, fjerne hodet i thymic området. Dette kan behandles separat, hvis ønskelig, eller brukes til histologiske flekker.
-
Peritoneal vask metode
- Bruker en P1000 pipette, vask fisk bukhulen med 500 µL kald sortering media, samle celler og medier i en 5 mL tube.
- Bruker en fersk pipette tips, injisere en ytterligere 200-300 µL av kaldt sortering media i kroppens hulrom. Spissen av pipette, bruk deretter lett trykk til fisk kroppen extrude cellene av kroppens hulrom. Samle dette mediet og legge til 5 mL tube.
- Gjenta trinn 2.8.2 2 – 3 ganger. Vær det avhentet celler sortering media på is.
- Filtrere celle suspensjon om en 35 µm mesh filtrere før flyt cytometri/FACS og holde cellene på is til analyse.
-
Hele kroppen homogenisering
- Etter fjerner plassere fisk hodet, kroppen i en 1,5 mL tube som inneholder 200 µL av sortering media.
- Homogenize kroppen med en pistil mikro-rør homogenizer.
- Legge til en ekstra 300 µL kald sortering media. Filtrere celle suspensjon om en 35 µm maske filter. Legge til sortering medier for å vaske alle celler gjennom filteret til bare Vev vrakrester forblir på filteret. Holde cellene på is til analyse.
3. Cytometric analyse av Normal eller ondartet B-lymfocytter
- Angi flyt cytometric analyse og/eller FACS parametere i henhold til produsentens guide.
-
Få ønsket antall hendelser som innledningsvis karakteriserer prøven. Analysere 1 x 104 til 5 x 104 hendelser før sortering å bestemme spesifikke portene for sortering fremgangsmåten.
- Bestemme gates: definere lymfocytt og stamfar celle gates frem xy (FSC) og siden xy (SSC) parametere, unntatt mobilnettet rusk (figur 2AC)17. FSC og SSC svarer til celle størrelsen/diameteren og detaljnivå, henholdsvis.
Merk: GFP-, GFPlo, og GFPHei forskjellige 10-til-100-fold i GFP fluorescens intensitet, gjør separasjon av disse befolkningene grei (tall 2-5). Live-død diskriminering kan vurderes foreløpig bruker propidium jod (PI) eller 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) levedyktighet flekker. Tidligere eksperimenter med PI vanligvis vise > 95% levedyktigheten til GFP+ celler etter FACS. - Ekskludere celle doublets, i henhold til parametrene av FACS maskinen brukes.
- I lymfoide og/eller forløper portene, bestemme antall og prosentandel av GFP+ celler.
- Bestemme gates: definere lymfocytt og stamfar celle gates frem xy (FSC) og siden xy (SSC) parametere, unntatt mobilnettet rusk (figur 2AC)17. FSC og SSC svarer til celle størrelsen/diameteren og detaljnivå, henholdsvis.
- Bruk phycoerythrin (PE) og GFP intensitet, definere porten for GFP- vs GFPlo vs GFPHei celler.
Merk: B celler exhibit dim GFP fluorescens og T celler Vis lyse GFP i lck:eGFP linjer. Mange lymfoide organer eller svulst prøver inneholder populasjonene GFP+ . B-lineage celler/B-alle er GFPlo og T-lineage celler/T-alle er GFPHei. Definere porter for å skille mellom GFP-GFPloog GFPHei celler, og samle disse populasjonene separat (figur 2A-C, figur 3A-C, figur 4A og figur 5a). - Sortere hver celle befolkningen i ulike 15 mL polypropylen rør som inneholder 2 mL sortering media, eller direkte i forskjellige 1,5 mL rør som inneholder en passende buffer for videre analyser (f.eks RNA og DNA utvinning, allo-transplantasjon, etc.).
- Holde renset celler på is før videre analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte flowcytometri til å analysere og FACS isolere GFPlo og GFPHei celler fra thymus, nyre marg og milten av transgene sebrafisk som lck:eGFP . Analyse av 3-måneden-gamle fisk avdekket thymus finnes hovedsakelig GFP+ lymfocytter. GFP+ cellene var i stor grad begrenset til lymfoide gate tidligere beskrevet av Traver et al.17. To forskjellige GFP+ bestander, GFPloog GFPHei,kan observeres i thymus. GFPHei lymfocytter representert en høyere prosentandel, ~ 60%, mens GFPlo celler var mindre rikelig, representerer ~ 40% av total thymic lymfocytter (tabell 1). I motsetning til pattedyr, er fisk blodkreft marg lokalisert inne i nyrene, ikke i bein. Vi bestemt B-celler som er bosatt i nyre marg også uttrykke lave nivåer av GFP (figur 2B og figur 3B). GFPlo celler i margtransplantasjon var rikelig, mens GFPHei celler var knappe (figur 2B og figur 3B)), som angir at bare en liten prosentandel av T-lymfocytter var til stede i margen på 3 måneder av alderen. Splenic-prøver viste likeledes høyere prosentandeler av GFPlo enn GFPHei celler (figur 2C og Figur 3 c). Vi også analysert ikke-ondartet lymfocytter thymus, marg og milten av sebrafisk som dobbel-transgene lck:eGFP, rag2:hMYC , som er utsatt for begge B - og T-alle11. I fisk som ikke hadde ennå utviklet alle, var resultater fra thymus, marg og milt lik for single-transgene lck:eGFP fisk. Imidlertid tallene av lymfocytter per orgel var økte (Figur 3), antagelig på grunn av MYC-drevet utvidelse av umodne B og T-celle populasjoner der rag2 er aktiv.
Vi også analysert dobbel-transgene fisk med B - og/eller T-alle som hadde utviklet fluorescerende kreft av 6 måneder. Forutsigbart, B-ALL fisken med svakt-fluorescerende kreft finnes hovedsakelig GFPlo celler (figur 4A). I kontrast sterkt-fluorescerende fisk kan inneholde enten isolert T-alle eller blandet bestander av både GFPlo B-alle og GFPHei T-alle celler (figur 5). Et eksempel på blandet alle, som inneholder forskjellige B - og T-ALL, er vist nedenfor (figur 5). For å bekrefte identiteten til GFPlo og GFPHei celler som B - og T-linje, henholdsvis, analyserte vi B - og T-celle-spesifikk transkripsjoner av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR). Våre resultater viser GFPlo celler uttrykke høyere nivåer av B celle utskrifter og GFPHei celler uttrykke høyere nivåer av T celle gener (figur 2D, figur3D, figur4B og figur 5B). videre uttrykk for lck og GFP i GFPlo alle tilsvarer GFP dim i vivo fluorescens B-alle (figur 2D, figur3D, figur4B og figur5B; qRT PCR forhold og primere sekvenser tidligere beskrevet ved Borga et al.) 11.
Figur 1: Distinkt fluorescens mønstre i lck:eGFP transgene fisk. (A) fluorescerende mikroskopi bilder fra rag2:hMYC, lck:eGFP med lyst-fluorescerende T-alle (venstre) eller svakt-fluorescerende B-alle (høyre). T-alle er synlige med lav eksponering innstillingene. B-alle kan bare ses ved hjelp av høy eksponeringer. (B) høy eksponeringsinnstillinger viser svak thymic fluorescens (gule sirkler) i vill-type lck:eGFP fisk (venstre) og rag2:hMYC, lck:eGFP dobbelt-transgene fisk uten alle (høyre). Skalere barer = 20 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Lymfocytt befolkningen i lck:eGFP sebrafisk. Bildene øverst viser en 3 måneder gamle WT, lck:eGFP fisk med høy eksponeringsinnstillinger eller datamaskin-ekstrautstyr (for å lette visualisering). Skalere barer = 20 mm. flyt cytometric analyser av thymus (A), marg (B) og milt (C). Venstre panel viser FSC (x-aksen) og SSC (y-aksen), med svart ovaler indikerer lymfocytt portene. Middels paneler skildrer fluorescens-baserte gating med GFP (x-aksen) og PE (y-aksen). GFPHei (blå firkant), GFPlo (grønn rektangel) og GFP- (svart ovaler) bestander vises. Høyre panel viser histogrammer for GFPHei og GFPlo celler. Stiplede linjer viser gating vilkår i midten paneler. (D) WT lck:eGFP thymi sortert for GFPHei (blå) og GFPlo (grønn). Uttrykk av B celle genet (pax5), T (cd4) celle-spesifikke gener)lck og GFP. Resultatene blir normalisert til housekeeping gener (β-utgangen og eef1a1l1) og vises som fold-endring ± standardfeil (S.E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Lymfocytt populasjoner i pre leukemic rag2:hMYC; lck:eGFP sebrafisk. Bildene øverst viser en 3-måneden -gamle rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med høy og datamaskinen forbedret eksponeringer. Skala bar = 20 mm. paneler av deler A-D er avbildet i figur 2identiske format. (D) uttrykk for pax5, cd4, lckog GFP i FACS-renset thymic GFPlo (grønn) GFPHei (blå) celle populasjoner av lck:eGFP fisk. qRT PCR resultatene vises som fold-endring ± S.E. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Analyse av B-alle rag2:hMYC; lck:eGFP transgene fisk. (A) topp: 6-måneden-gamle rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med B-alle med høy innstillingen. Flow cytometric analyser av tumorceller isolert fra fisken kropp er identiske format figur 2. (B) genuttrykk i B-alle GFPlo celler (grønne gate i figur 4A), rag2:hMYC, lck:eGFP GFPHei thymocytes (blå gate i figur 3A), og T-alle GFPHei celler (blå gate i figur 5A ). Uttrykk av B (pax5, cd79a) og T (cd4) celle-spesifikke gener, lckog GFP. Resultatene blir normalisert til housekeeping gener (β-utgangen og eef1a1l1) og vises som fold-endring ± se skala bar = 20 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Analyse av blandet alle rag2:hMYC; lck:eGFP transgene fisk. (A) topp: 6 måneder gamle rag2:hMYC; lck:eGFP fisk med blandet-alle med høy innstillingen. Flow cytometric analyser av tumorceller isolert fra fisken kropp er identiske format figur 2. (B) GFPHei (blå) og GFPlo (grønn) FACS portene. Uttrykk av B (pax5, cd79a) og T (cd4) celle-spesifikke gener, lckog GFP. Resultatene blir normalisert til housekeeping gener (β-utgangen og eef1a1l1) og vises som fold-endring ± se skala bar = 20 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet og inneholder en protokoll for å isolere B celler fra lck:eGFP transgene sebrafisk, å legge dette til andre D. rerio modeller med B-lineage etiketter3,4. Noe overraskende, gikk identifisering av GFPlo B celler i denne linjen ubemerket siden beskrivelsen i 2004. Vanligvis lck anses å være T celle-spesifikke6, men nyere studier fant uventet lck uttrykk av naturlige morder og myeloide celler, så vel som B-cellene som vist her18,19. Med våre funn at sebrafisk B celler er GFPlo, pre-B, naiv og modne B uttrykke celler hos mennesker også lave nivåer av LCK11,13.
På grunn av de ulike GFP nivåene i B- og T-cellene i disse Fiskene, kan cellene i begge linjene nå være isolert fra denne linjen. Selv om disse dyrene har klassisk brukt til å studere thymic T lymfocytt utvikling og sporing, viser vi at lignende studier er også mulig med B-celler. Dette kan vi identifisere B celler i thymus, nyre marg og milt her, og i perifert blod og andre steder i tidligere arbeid11.
Erkjennelsen B-ALL i rag2:hMYC; LCK:eGFP fisk krever et godt øye, men med praksis, er grei. Neste, velge hvilken metode du bruker å rense alle celler er avgjørende. Her presenterer vi to metoder: peritoneal vask og hele kroppen homogenisering. Peritoneal vask gir et mye lavere antall totale celler, men en svært høy andel av GFP+ celler. Derfor er lite FACS tid nødvendig, minimere kostnadene. For nedstrøms programmer, der totale avkastning er mindre viktig (f.eks qRT-PCR), det er mer effektivt. Alternativt, hele kroppen homogenisering gir større enkeltcelle suspensjoner som inneholder mange flere celler, men en lavere andel av cellene blir GFP+. Dermed er mer FACS tid nødvendig å samle samme antall GFP+ celler som med peritoneal vask, men millioner flere celler kan bli renset. For nedstrøms studier, hvor høy avkastning er viktig (f.eks Western blot), dette kan oppveie den ekstra kostnaden. I tillegg for alle studier fanger hele kroppen homogenisering mangfoldet av kreftceller, mer nøyaktig representerer svulst heterogenitet. Selv ikke vises i våre protokollen, er det også mulig å dissekere bare GFP+ kroppen regioner/organer fra fisk med alle homogenisering av hakking i en Petriskål, dermed redusere totale FACS tid og kostnader, som peritoneal vask.
Thymic GFP uttrykk i lck:eGFP fisk viste at GFP er synlig så tidlig som 5 dpf6. Våre studier her ble utført i voksen fisk 3 måneder eller eldre, og viser at i denne alderen, B-cellene er rikelig i nyre marg og milt, men T-celler er sjeldne. Studier med fisk i ulike aldre vil måtte finne ut om T-celler er mer utbredt på ulike tidspunkt. Likeledes på 3 måneder, T-celler er beriket i thymus, men et betydelig antall thymic B-cellene er også til stede. Hvis disse lymfocytt bestander varierer i ulike aldre er foreløpig ukjent, men samlet, thymic fluorescens tones lck:eGFP fisk fra seksuell modenhet (~ 3 måneder), så det er sannsynlig at T celle tall avtar med økende alder, og B-cellene kan også. Likeledes når GFPlo B celler kolonisere er sebrafisk brisselen foreløpig ukjent. Bruke lck:eGFP fisk, er det nå mulig å overvåke thymic B og T-celle utvikling, strøm, middelklasseinnbyggere og den bestemt kinetics av disse hendelsene. I tillegg er slike spørsmål også relevant for andre anatomiske nettsteder hvor B celler bor, som nyre marg, milt, blod og tarmen (data ikke vist).
Tillegg B celle utviklingsmessige studier funnet vi nylig B-ALL i lck:eGFP; rag2:hMYC dobbel-transgene fisk11. Transgene rag2:hMYC var kjent å indusere T-alle10 men B-alle hadde gått ukjent. På grunn av den høye penetrance av denne oncogene, begge typer alt er utbredt i disse fiskene og mange fisk faktisk utvikle både alle typer samtidig11. Siden B-alle GFPlo, mens T-alle er GFPHei, kan varierende GFP uttrykk disse to enhetene bli isolert av FACS, selv når forekommer i samme dyret (figur 5A). Avgjørende, viser både normal og ondartet lymfocytter, qRT-PCRresults at GFPlo og GFPHei celler konsekvent svarer til B - og T-linjen, henholdsvis (figur 2 og Figur 3).
Det uutnyttede potensialet av lck:eGFP fisk var sentralt i dette arbeidet, opplyser det faktum at mange eksisterende transgene linjer sannsynligvis ha nytte utover sitt tilsiktede formål. Her presenterer vi en ny protokoll for å isolere B og T celler fra D. rerio med transgene lck:eGFP, åpne døren til nye investigational veier om normal og ondartet B-lymfocytter. Resultatene av slike studier vil utvilsomt re vitalisere det som allerede er en verdifull ressurs til hematopoiesis, lymphopoiesis og kreft biologi felt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Megan Malone-Perez for sebrafisk omsorg, og OUHSC flyt cytometri kjernen. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Hyundai Hope på hjul, Oklahoma Center for fremme av vitenskap og teknologi (HRP-067), en NIH/NIGMS INBRE pilotprosjekt award (P20 GM103447). JKF holder E.L. og Thelma Gaylord utstyrt stol i pediatrisk hematologi-onkologi av barnas sykehus fundament.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
