Summary
유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.
Introduction
Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류1사이 보존 하 고.
지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식6드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS7thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.
최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 10, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도11를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP안녕하세요 FACS11를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP로 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피11. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우11.
여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.
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Protocol
제 브라와 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 오클라호마 대학 건강 과학 센터에 의해 승인 되었다.
1. 유전자 변형 lck:eGFP 생선 에서 비 악성 B 및 T 림프 구 분리
- 물고기 물고기 시스템 물에 0.02 %tricaine (MS-222)를 사용 하 여 anesthetize
- 제 브라와 다른 teleosts14의 아가미 구멍의 dorsomedial 측면에 있는 형광 thymi에 대 한 2-6 달 오래 된 물고기를 검사 합니다. (470/40 여기 파장과 525/50 방출 필터) GFP를 감지 하는 epifluorescence 현미경을 사용 합니다.
- 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) 포함 1% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 (정렬 미디어) x 필터 살 균 1의 50 mL를 사전에 준비 합니다. 사용 하지 않는 정렬 미디어 4 ° C에서 최대 2 개월까지 저장할 수 있습니다.
- 0.2% 들어 있는 비 커에 그것을 배치 하 여 물고기를 안락사 약 5 분, Tricaine 뒤에 얼음 목욕 침수. Opercular (길) 움직임의 정지에 의해 죽음을 확인 합니다.
- 안락사 물고기를 페 트리 접시에 놓고 GFP+ thymi14, 그리고 밝은 분야 현미경 검사 법 설정을 신장 골 수, 비장15를 해 부 해 부에 형광 현미경을 사용 하 여 관심사의 림프 기관 해 부 합니다. 여기에 제시 된 결과 3 개월 된 물고기를 사용 하 여 얻은 했다. 림프 구 비율과 절대 수 나이 및 유전자 형 (추가 세부 사항에 대 한 토론 참조) 마다 다릅니다.
- 각의 해 부 기관 미디어 정렬 감기 500 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.
- 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 얼음에 조직 균질
- 무 균된 조직 단일 세포 현 탁 액을 생성 하는 35 µ m 메쉬 필터를 통해 전달 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.
2. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라 에서 악성 세포 분리
-
2-4 개월에 시작에 불과합니다, 미세 스크린 rag2:hMYC; 비정상적인 GFP 패턴에 대 한 lck:eGFP 물고기.
참고: B 세포는 GFPlo lck:eGFP 배경에서 그래서 B-모든 필요 인식; 연습 T-모든 때문에, T 세포는 GFP안녕하세요. 결과적으로는 rag2:hMYC, lck:eGFP 듀얼-유전자 변형 라인은 두 개의 고기: 밝은 형광 T-모두, 일반적으로 thymus에서 발생 하 고 몸과 어렴풋이 형광 B-모든으로 확장.- 형광 현미경을 사용 하 여 화면 (200 ms, 2.4 x 이득) 밝은 T-모든 (그림 1A) 및 "높은 노출" 파악 "낮은 노출" 설정을 사용 하 여 물고기 (1.5 s, 3.4 x 이득) dim B-모든 (그림 1A)를 식별. WT 컨트롤 및 사전 leukemic 물고기 GFP thymus (그림 1B)에 있다.
- Anesthetize 고 1.1-1.2 단계에서 설명한 대로 물고기를 검사 하십시오.
- 간단한 3 카테고리 시스템을 사용 하 여 GFP 형광의 정도에 따라 생선을 분류:
참고: 레벨 1: 형광만 제한 지역 확산 thymic 종양으로 나타납니다.
레벨 2: thymus, 관련 된 넘어 형광 표시 < 신체의 50%.
레벨 3: 형광 신체의 50% 넘어 확장 됩니다. - 암 없는 그 모든 물고기를 구분 합니다. 모니터링 미리 leukemic 물고기 (GFP+ 종양 즉, 생선) 한 번 매달의 새로운 개발에 대 한. ~ 9 개월, 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 개발 T-모든, B-전체, 또는 둘 다.
- T 또는 B 모든 세포 격리를 위한 선택 레벨 3 물고기 (모든 관련 > 본문의 50%)는 항복 2 x 10 이상6 셀을 모두, 그리고 더 일반적으로 많은.
- 1.4 단계 에서처럼 물고기 안락사
참고: 모든 세포를 얻기 위해 두 가지 방법이 있다: 균질 및 복 막 세척 기술16몸 전체. 따라서, FACS 양의 시간이 필요 하 고 비용과 방법 셀 정렬, 수집된의 절대 수에 다 (더 자세한 내용 참조). - 두 메서드 중 하나에 대 한 먼저 안락사 물고기 페 트리 접시에 놓고 thymic 지역을 포함 한 머리 제거 면도칼 블레이드를 사용 하 여. 이 수는 별도로 처리, 원하는, 또는 조직학 얼룩에 사용 하는 경우.
-
복 막 세척 방법
- P1000 피 펫을 사용 하 여 씻어 감기 미디어, 세포와 미디어 5 mL 튜브에 수집을 정렬의 500 µ L로 생선 복 막 구멍.
- 신선한 피 펫 팁을 사용 하 여, 신체 구멍으로 차가운 정렬 미디어의 추가 200-300 µ L를 주사. 다음, 신체 구멍에서 세포를 돌출 시킬 물고기 몸에 부드러운 압력을 적용는 피 펫의 끝을 사용 하 여. 이 미디어를 수집 하 고 5 mL 튜브에 추가.
- 2.8.2 단계 2-3 회 반복 합니다. 얼음에 미디어를 정렬에 수집 된 셀을 계속.
- 35 µ m 메쉬 흐름 cytometry/FACS 전에 필터링 하 고 분석까지 얼음에 셀을 계속 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
-
몸 전체 균질
- 생선 머리를 제거 후 미디어 정렬의 200 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 시체를 놓습니다.
- 유 봉 마이크로 튜브 균질 화기를 사용 하 여 본문 균질
- 감기 미디어 정렬의 추가 300 µ L를 추가 합니다. 하지만 35 µ m 메쉬 필터 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 필터에 조직 파편만 남아 때까지 필터를 통해 모든 셀을 세척 하는 데 필요한 정렬 미디어를 추가 합니다. 분석까지 얼음에 셀을 계속.
3. Cytometric 분석 정상 또는 악성 B 세포의
- 흐름 cytometric 분석 및/또는 제조 업체의 설명서에 따라 FACS 매개 변수를 설정 합니다.
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처음 샘플을 특성화 하는 이벤트의 원하는 번호를 취득 합니다. 1 x 104 5 x 10 후속 정렬 단계에 대 한 특정 게이트 결정을 정렬 하기 전에4 이벤트를 분석 합니다.
- 결정 문: 림프 구 및 조상 세포 게이트 앞으로 산포 (FSC) 및 세포질 파편 (그림 2A-C)17제외 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 정의. FSC 그리고 SSC 셀 크기/직경 및 세분성에 각각 해당합니다.
참고: GFP-, GFP소호, 그리고 GFP안녕하세요 셀이이 인구 간단 합니다 (그림 2-5)의 분리를 만드는 10-에-100-배 그들의 GFP 형광 강도 측면에서 다릅니다. 살고 죽은 차별이 시점에서 propidium 요오드 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) 생존 얼룩을 사용 하 여 평가 될 수 있다. 이전 실험 PI와 일반적으로 입증 > FACS 후 GFP+ 세포의 생존 능력 95%. - 사용 중인 FACS 기계의 매개 변수에 따라 셀 남자를 제외 합니다.
- 림프 및/또는 전조 게이츠 내 수 및 GFP+ 세포의 백분율을 결정 합니다.
- 결정 문: 림프 구 및 조상 세포 게이트 앞으로 산포 (FSC) 및 세포질 파편 (그림 2A-C)17제외 측면 살포 (SSC) 매개 변수를 사용 하 여 정의. FSC 그리고 SSC 셀 크기/직경 및 세분성에 각각 해당합니다.
- GFPlo GFP안녕하세요 셀 대 대 게이트 GFP- 에 대 한 정의 phycoerythrin (PE) 및 GFP 농도 사용 합니다.
참고: Dim GFP 형광을 전시 하는 B 세포와 T 세포 lck:eGFP 라인에 밝은 GFP를 표시. 많은 림프 기관 또는 종양 샘플 포함 모두 GFP+ 인구. B 계보 세포/B-모든 GFPlo 와 T-계보 세포/T-모든은 GFP안녕하세요. GFP-, GFPlo및 GFP안녕하세요 셀, 사이 구별 하는 게이트를 정의 하 고 이러한 인구를 별도로 수집(그림 2A-C, 그림 3A-C, 그림 4A 와 그림 5A). - 미디어, 정렬의 2 개 mL를 포함 하는 다른 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 또는 추가 분석 (예를 들어, RNA, DNA, 또는 단백질 추출, 여 보세요-이식 등)에 대 한 적절 한 버퍼를 포함 하는 다른 1.5 mL 튜브에 직접 각 세포 인구를 정렬 합니다.
- 얼음 추가 분석 이전에 순화 된 셀을 유지.
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Representative Results
우리 사용 분석 cytometry FACS GFP소호 및 GFP안녕하세요 세포 thymus, 신장 골 수, 및 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish의 비장 으로부터 분리. 3 개월 된 물고기의 분석 thymus 포함 GFP+ 세포 주로 밝혔다. GFP+ 세포 림프 게이트 이전 Traver 외.17에 의해 설명에 주로 국한 되었다. 두 가지 GFP+ 인구, GFPlo와 GFP안녕하세요, thymus에서 관찰할 수있습니다 . GFP안녕하세요 세포 GFP로 셀은 덜 풍부 하 고, 총 thymic 세포 (표 1)의 40% ~ 60%, 더 높은 백분율 표현. 달리 포유류, 물고기 조 혈 골 수 대신 뼈 안에 신장 내에서 지역화 됩니다. 우리는 B 세포 신장 골 수 또한 익스프레스의 저급 GFP (그림 2B 와 그림 3B)에서 결정. GFP안녕하세요 셀 부족 동안 GFP로 세포 골 수에서 풍부, 했다 (그림 2B 와 그림 3B)), T 림프 톨의 단지 작은 비율을 나타내는 3 개월의 나이에 골 수에 존재 했다. 비장 샘플 마찬가지로 GFP로 의 GFP안녕하세요 셀 (그림 2C 와 그림 3C) 보다 높은 비율을 보였다. 우리는 또한 두 B 및 T 모든11. 경향이 thymus, 골 수, 이중 유전자 변형 lck:eGFP; rag2:hMYC zebrafish의 비장에서 비 악성 세포 분석 모두 아직 개발 하지 했다 물고기, 흉 선, 골 수, 비장에서 결과 단일 유전자 변형 lck:eGFP 물고기에 유사 했다. 그러나, 기관 당 세포의 숫자는 아마도 활성화 rag2 발기인이 되어 미 숙 B와 T 세포 인구의 MYC 기반 확장 때문 (그림 3)를 증가.
우리는 또한 B-또는 T-모든 6 개월에 의해 형광 암 개발 했다 이중 유전자 변형 물고기 분석. 예상 대로, B-모든 생선 어렴풋이 형광 암 주로 GFP로 셀 (그림 4A) 포함. 대조적으로, 밝은 형광 물고기는 격리 된 T-모두 항구 수 또는 혼합 인구와 모두의 GFP로 B-모든 GFP안녕하세요 T-모든 세포 (그림 5). 예 혼합으로 뚜렷한 B 및 T 모두 포함, 여기 (그림 5)에 표시 됩니다. 각각 GFPlo 와 GFP안녕하세요 셀의 정체성으로 B-및 T-혈통, 확인, 우리는 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 녹취 록 B 및 T-세포-관련 분석. 우리의 결과 보여 GFP로 세포 B 세포 성적 높은 수준의 표현 GFP안녕하세요 세포 T 세포 유전자 (그림 2D,3D 그림, 그림4B 및 그림 의 상부를 표현 5B). 또한, lck 그리고 GFP 에 GFP로 B-모든 dim vivo에서 GFP 형광에 해당 하는 모든 표현 (그림 2D,3D 그림 그림4B 및 그림5B; qRT-PCR 조건 및 뇌관 시퀀스 이전 Borga 외 설명.) 11.
그림 1: 독특한 형광 패턴 lck:eGFP 유전자 변형 물고기에. 밝은 형광 T-모든 (왼쪽) 또는 어렴풋이 형광 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기의 (A) 형광 현미경 이미지 B-모든 (오른쪽). T-모든 낮은 노출 설정; 표시 됩니다. B-모든만 높은 노출을 사용 하 여 볼 수 있습니다. (B) 높은 노출 설정을 야생-타입 lck:eGFP 물고기 (왼쪽)와 모든 (오른쪽) 없이 rag2:hMYC; lck:eGFP 이중 유전자 변형 물고기에 희미 한 thymic 형광 (노란색 동그라미)를 표시 합니다. 바 규모 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: lck:eGFP 제 브라에서 림프 구 인구. 상단에 이미지 표시 3 개월 WT, lck:eGFP 물고기 높은 노출 설정 또는 컴퓨터 향상 (시각화를 촉진). 바 규모 = 20 mm. thymus (A), (B), 골 수 및 비장 (C)의 흐름 cytometric 분석. 왼쪽된 패널 표시 FSC (x 축) 및 SSC (y 축), 림프 구 게이트를 나타내는 검은 타원형. 가운데 패널 GFP (x 축)와 PE (y 축) 게이팅 형광 기반 묘사. GFP안녕 (파란색 사각형), GFPlo (녹색 사각형)과 GFP- (블랙 타원) 인구 표시 됩니다. 오른쪽 패널 GFP안녕 과 GFP로 셀의 막대 그래프를 표시합니다. 파선 중간 패널에 제어 조건을 나타냅니다. (D) WT lck:eGFP thymi GFP안녕 (파란색) 및 GFPlo (녹색)에 대 한 정렬. B 세포 유전자 (pax5), T (cd4) 세포 관련 유전자의 표현)lck 그리고 GFP. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라 및 eef1a1l1)으로 배 변화 ± 표준 오차 (S.E) 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 미리 leukemic rag2:hMYC; lck:eGFP 제 브라에서 림프 구 인구. 상단에 이미지 표시 3-달-오래 된 rag2:hMYC, lck:eGFP 물고기 높고 컴퓨터 강화 된 노출으로. 눈금 막대 = 20 m m. 패널 부품 A-D의 그림 2에 동일한 형태로 묘사 된다. Pax5, cd4, lck및 FACS 정화에 GFP 의 (D) 식 thymic GFPlo (녹색) GFP안녕 (블루) 세포 인구 lck:eGFP 물고기의. qRT-PCR 결과 표시 배 변화 ± 남동 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
B 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 유전자 변형 물고기의 그림 4: 분석. (A) 가기: B-모두가 높은 노출 설정을 사용 하 여 6 개월 rag2:hMYC; lck:eGFP 물고기. 물고기의 시체에서 분리 하는 종양 세포의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 동일한 형식입니다. (B) B-모든 GFP로 셀 ( 그림 4A에서 녹색 게이트), rag2:hMYC; lck:eGFP GFP안녕하세요 thymocytes ( 그림 3A에서 파란색 게이트), 및 T-모든 GFP안녕하세요 셀 ( 그림 5A에서에서 파란색 게이트에 유전자 발현 ). B (pax5, cd79a) 및 T (cd4) 세포 관련 유전자, lck, GFP의 식입니다. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라 및 eef1a1l1)으로 배 변화 ± 남동 규모 표시 바 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 분석의 혼합 모든 rag2:hMYC, lck:eGFP 유전자 변형 물고기. (A) 탑: 6 개월 rag2:hMYC; lck:eGFP 물고기 혼합 모든 높은 노출 설정을 사용 하 여. 물고기의 시체에서 분리 하는 종양 세포의 흐름 cytometric 분석은 그림 2에 동일한 형식입니다. (B) GFP안녕 (파란색)와 GFPlo (녹색) FACS 게이츠. B (pax5, cd79a) 및 T (cd4) 세포 관련 유전자, lck, GFP의 식입니다. 결과 내부 관리 유전자를 정규화 (β-말라 및 eef1a1l1)으로 배 변화 ± 남동 규모 표시 바 = 20 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련6, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck 식 자연 킬러에 의해 및 골수성 세포, 또한 같이18,19B 세포에서. 우리의 발견 zebrafish B 세포 GFPlo, 사전-B, 순진한, 그리고 성숙 B와 인간에서 세포 또한 LCK11,13의 저급을 표현 한다.
이 물고기의 B와 T 세포의 다른 GFP 수준 때문에 두 계보의 세포 이제이 라인 분리 수 있습니다. 비록 이러한 동물 고전적인 thymic T 림프 구 개발 및 추적 연구에 사용 된, 유사한 연구는 또한 B 세포와 가능한 설명 합니다. 이 위해, 우리 여기, 말 초 혈액에서 있고 다른 사전 작업11B 세포 thymus, 신장 골 수, 비장 식별합니다.
Rag2:hMYC;에 B-모든 인식 lck:eGFP 물고기 예리한 관찰력을 필요로 하지만 연습, 간단 합니다. 그런 다음 모든 셀 정화를 사용 하는 방법은 중요 한 선택. 여기, 우리는 두 가지 방법 제시: 복 막 세척 및 몸 전체 균질. 복 막 세척 GFP+ 세포의 매우 높은 비율로 하지만 총 셀의 훨씬 더 낮은 수를 생성합니다. 따라서, 작은 FACS 시간 비용을 최소화 하는 데 필요한입니다. 총 수익률은 덜 중요 한 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 (예를 들어,: qRT-PCR),이 더 효율적입니다. 또는 몸 전체 균질 결과 많은 포함 하는 큰 단일 셀 정지 셀, 하지만 셀의 낮은 비율 GFP+됩니다. 따라서, 더 많은 FACS 시간은 셀 순화 될 수 있다 복 막 세척, 하지만 수백만 GFP+ 세포의 동일한 수를 수집 합니다. 다운스트림 연구, 높은 수익률이 중요 (예: 서쪽 오 점),이 추가 비용을 상쇄 수 있습니다. 또한, 모든 연구에 대 한 총 몸 균질 캡처, 암 세포의 다양성 더 정확 하 게 종양이 대표. 비록 우리의 프로토콜에 나열 되지 않은, 따라서 감소 하는 총 FACS 시간 및 비용, 복 막 세척 유사 페 트리 접시에 닦지에 의해 유일한 GFP+ 신체 영역/기관에서 균질에 대 한 모든 물고기 해 부 수 이기도 합니다.
Lck:eGFP 물고기에서 thymic GFP 식 GFP 빠르면 5 dpf6감지는 보여주었다. 여기에 우리의 연구 성인 물고기에서 3 개월 이상, 수행 했다 그리고이 나이에, B 세포는 신장 골 수, 비장, 풍부 하지만 T 세포 드물다. 다양 한 연령대의 물고기와 후속 연구 T 세포 더 널리 다른 시간 지점에서 확인 하는 데 필요한 것입니다. 마찬가지로, 3 개월, T 세포, thymus에서 풍성 하 게 하지만 thymic B 세포의 상당수 존재. 이러한 림프 구 인구에 변화 하는 경우 다른 연령대는 현재 알려진 하지만 전반적으로, thymic 형광 페이드 그래서 그것은 T 세포 수 나이 증가 함께 감소 하 고 B 세포 수 성적 성숙 (3 개월)에서 시작 하는 lck:eGFP 물고기 또한. 마찬가지로, GFP로 B 셀 식민지 zebrafish thymus 현재 알려진 되지 않습니다. Lck:eGFP 물고기를 사용 하 여, 이제 가능 하다 thymic B와 T 세포 개발, 유입, 경과, 및 이러한 이벤트의 특정 활동을 모니터링. 또한, 같은 질문 B 셀이 있는, 신장 골 수, 비장, 혈액, 소장 (데이터 표시 되지 않음) 등 다른 해부학 사이트에 있습니다.
B 세포 발달 연구, 게다가 우리 최근 B 모두에서에서 발견 lck:eGFP; rag2:hMYC 이중 유전자 변형 물고기11. 유전자 변형 rag2:hMYC T-모든10 를 유도 하는 것으로 알려졌다 하지만 B-모든 알 수 없는 사라 했다. 이 oncogene의 높은 penetrance, 인해 두 종류 모두의이 물고기에는 및 많은 물고기는 실제로 둘 다 개발 모든 유형 동시에11. 때문에 B-모든 GFP로, T-모두는 GFP안녕하세요, GFP 표정 변화 (그림 5A) 같은 동물에서 발생 하는 경우에, FACS에 의해 고립 될이 두 가지 엔터티를 수 있습니다. 결정적인 정상 및 악성 세포 qRT-PCRresults는 GFPlo 와 GFP안녕하세요 셀 일관 되 게 해당 하는 B-및 T-계보, 각각 (그림 2 및 그림 3) 보여 줍니다.
Lck:eGFP 물고기의 숨은 잠재력 사실 많은 기존의 유전자 변형 라인 가능성이 그들의 의도 된 목적을 넘어 유틸리티를 강조 하는이 작품의 중심 이었다. 여기, 우리는 정상 및 악성 B 세포에 관한 새로운 조사 가능한도 문을 여 유전자 변형 lck:eGFP, D. rerio 에서 B 및 T 세포를 분리 하는 새로운 프로토콜 제시. 이러한 연구의 결과 다시 무슨 조, lymphopoiesis, 및 암 생물학 분야에 귀중 한 자원을 이미 활력 의심할 여 지 없이 것입니다.
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Disclosures
저자는 관심의 충돌을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 메 간 말론-페레즈 zebrafish 관리, 그리고 OUHSC 흐름 cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 현대 바퀴, 오클라호마 센터 발전의 과학 기술 (HRP-067), NIH/NIGMS INBRE 파일럿 프로젝트 수상 (P20 GM103447)에 대 한 희망에서 교부 금에 의해 지원 되었다. JKF 일정 & 델 마 게이 부여의 자에서 소아 혈액학-종양학 어린이 병원 재단의 보유합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 mL conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1x | Life Technologies | 11835-030 |
References
- Paik, E. J., Zon, L. I.
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
