Summary
Här beskriver vi en preklinisk stor-djur (svin) modell av ortotopisk hjärttransplantation som har varit fast etablerad och utnyttjas för att undersöka nya kardioprotektiva strategier.
Abstract
50-år efter den första lyckade rapporten, hjärttransplantation förblir guld-standardbehandling för berättigade patienter med avancerad hjärtsvikt. Flera små djurmodeller av hjärttransplantation har använts för att studera de akuta och långsiktiga effekterna av nya terapier. Men få testas och demonstreras framgångsrika i kliniska prövningar. Det är av avgörande betydelse att utvärdera nya terapier i en kliniskt relevant modell med stor djur för effektiv och tillförlitlig översättning av grund studiernas resultat. Här beskriver vi en preklinisk stor-djur (svin) modell av ortotopisk hjärttransplantation som har varit fast etablerad och tidigare använts för att undersöka nya kardioprotektiva strategier. Detta förfarande fokuserar på akut ischemia-reperfusion skada och är en pålitlig metod för att undersöka nya interventioner som har testats och validerats i mindre experimentella modeller, såsom murin modellen. Vi visar dess användbarhet vid bedömningen av hjärtats prestanda under den tidiga perioden efter transplantationen och andra potentiella möjligheter som modellen möjliggjort.
Introduction
50-år efter den första lyckade rapporten, hjärttransplantation förblir guld-standardbehandling för berättigade patienter med avancerad hjärtsvikt1. Även om ischemiska tider på upp till fyra timmar tolereras adekvat, en ischemisk tid på mer än sex timmar är förknippad med sämre resultat2. Dysfunktion i primär transplantatet förblir den huvudsakliga orsaken till tidig morbiditet och dödlighet efter transplantation2,3. Orsakerna till primära transplantat dysfunktion är multifaktoriell och inkluderar användning av marginella organ, mottagaren pulmonell vaskulär sjukdom, hyperakut avvisande, och ischa-reperfusion skada som uppkommit vid tidpunkten för transplantation3.
Flera studier har undersökt nya metoder för donator hjärta bevarande för att minska incidensen av primär transplantat dysfunktion4,5,6,7. Det är vanligt att bedöma nya tekniker och behandlingar i murina modeller av ischemia-reperfusion skada eller heterotopisk hjärttransplantation. Dessutom, små djurmodeller tillåter överlevnads modeller och långsiktig uppföljning för att undersöka utvecklingen av avstötning och kardiell transplantatavstötning vasculopati11,12,13. Men de flesta av dessa strategier misslyckas inledande kliniska pilotförsök eller aldrig nå detta skede. Det är av yttersta vikt att utvärdera nya terapier i en kliniskt relevant modell med stor djur för effektiv och tillförlitlig översättning av grund studiernas resultat.
Svin hjärtat är ofta anses vara den mest anatomiskt liknar det mänskliga hjärtat när man använder stora djurmodeller. Som sådan, det är en idealisk plattform för att utföra hjärt kirurgisk forskning. Emellertid, det finns flera viktiga faktorer att tänka på när du använder en porcin modell. Först är vävnaden typiskt beskrivas som bräcklig och spröda, särskilt i rätt förmak och lungartären, är benägna att tårar14. Dessutom, svin hjärtat anses känslig för manipulation och benägna att arytmier, varför man bör rutinmässigt administrera en anti-arytmisk till varje djur i början av experimentet. En viktig anatomisk skillnad mellan svin modell och klinisk hjärttransplantation är vänster hemiazygous ven i svin som rinner direkt in i hjärtats sinus. Detta måste vara och ligaturer under mottagar förfarandet för att undvika kontinuerlig blödning. Slutligen, svin modellen är mycket känslig för ischemia, men det är fortfarande lämpligt för akuta studier i hjärttransplantation15.
Detta manuskript beskriver en preklinisk stor-djur (svin) modell av ortotopisk hjärttransplantation som har varit fast etablerad och utnyttjas för att undersöka nya kardioprotektiva strategier5,6,8 ,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionella djuromsorg kommittén godkände alla experimentella protokoll och djur behandlades efter "guide för vård och användning av försöksdjur" utarbetats av Institutet för laboratoriedjur resurser, nationella forskningsrådet, 1996. Manlig Yorkshire svin (40 – 50 kg) användes för att utföra ortotopiska hjärttransplantationer (djur storlek kan variera beroende på utredarna diskretion och experimentella mål).
1. givar förfarande
- Anestesi induktion och djur beredning:
- Premedicate djuret med en intramuskulär injektion av ketamin (20 mg/kg), midazolam (0,3 mg/kg), och Atropine (0,04 mg/kg). Utför bedövnings induktion och underhåll med hjälp av inhalationisofluran (end tidvatten koncentration: 1% – 3%) + 3 L/min O2 via ansiktsmask.
- Bekräfta anestesi tillräckligheten genom att säkerställa en avslappnad käk ton och frånvaro av smärta under tå nypa. Anestesi tillräckligheten måste följa de institutionella riktlinjerna.
- När anestesi tillräckligheten har bekräftats, utför en orotrakeal intubation med ett endotrakealrör av storlek 6.5 – 8 mm.
- Placera en syremättnadsövervakare på örat eller under läppen för kontinuerlig övervakning. Placera diatermi elektrodplattan på djurets rygg.
- För in en perifer intravenös åtkomst via öron venen (t. ex. 20 g Angiocath). Påbörja en underhålls infusion (t. ex. 0,9% NaCl). Administrera 2 g magnesiumsulfat för att förhindra arytmier.
- Sätt en perkutan Central venösa slidan introduktören med Seldinger tekniken i rätt halsvenen om högersidig hjärtkateterisering och hjärt minut tal mätningar ska utföras. Placera djuret i Trendelenburg läge för att underlätta venös tillgång. Alternativt kan detta göras i den vänstra inre halsvenen. Om tillgång inte kan fastställas, detta steg kan utföras efter mittlinjen sternotomi genom dissekera den inre halsvenen (vänster eller höger) och infoga slidan direkt.
- Donator hjärta upphandling:
- Utföra en mittlinjen sternotomi från mitten av cervikala regionen till under xiphoid processen med hjälp av en diatermi penna. Öppna bröstbenet med en Bensåg. Säkerställ adekvat hemostas under hela förfarandet (t. ex. bränna bröstben, och/eller tillämpning av benvax).
- I livmoderhalsen regionen, återkalla sternocleidomastoideus muskeln till centrum och dissekera den högra halspulsådern (alternativt, detta kan göras med vänster halspulsådern). Placera en arteriell åtkomst linje (t. ex. 20 g Angiocath) i rätt halspulsådern för invasiv arteriellt tryckövervakning.
- Dissekera och ta bort brässen från över hjärttäcken. Försiktigt lyfta brässen från hjärttäcken, med hjälp av cautery, och dissekera strukturen från hjärttäcken. För att förhindra blödning, bränna de små fartyg som kommer från aorta och överlägsen Vena Cava (SVC) att vattna brässen.
- Öppna Perikardium. Dissekera den aortopulmonell rymden med hjälp av cautery. För detta, har assistenten dra tillbaka den högra ventrikulära utflöde spår inferiorly och lungartären till vänster och har kirurgen återkalla aorta till höger. Gör detta noggrant för att undvika direkta lesioner till lungartären.
- Rensa främre delen av aorta ascendens från bindväv. Försiktigt dra tillbaka den högra ventrikulära utflödet och placera en Purse-String suturen med en 4-0 prolene på proximala stigande aorta adventitia (undvika full tjocklek suturer). Säkra denna sutur med en Tourniquet.
- Administrera 30 000 enheter heparin (> 300 U/kg) för att uppnå systemisk antikoagulation. Sätt in cardioplegia leverans kanyl (t. ex. DLP aorta root kanyl) i aorta ascendens mellan handväskan-String suturen tidigare placerats och säkert genom att dra åt Tourniquet. Förbered den cardioplegic lösning som kommer att användas och ansluta till leveransen kanyl.
- Öppna SVC och inferior Vena Cava (IVC), och den vänstra sämre pulmonell ven för att säkerställa adekvat hjärt ventilation. Placera aorta Cross-klämma på distala stigande aorta (ovanför cardioplegia kanyl). Alternativt kan vänster kammare ventileras genom att öppna vänster förmaks bihang och placera sug.
- Initiera kardioplegia infusion riktad mot ett aorta rotstryck på 80 till 100 mmHg.
Anmärkning: författarna tillämpade en modell med 1,5 L av en vanlig extracellulär hyperkalemisk kardioplegic lösning vid 4 ° c. Olika lösningar och volymer kan användas i enlighet med den experimentella uppsättningen. - Placera isslush (0,9% NaCl) i brösthålan och över orgeln för kylning efter initiering av cardioplegia. Efter den kardioplegia infusionen är klar, gå vidare med kardiektomi på ett traditionellt sätt. Avsnitt aorta och lungartären efter Innominate artär och vid bifurcation, respektive, för att säkerställa tillräcklig längd för implantat.
- Efter avlägsnande, placera orgeln i en orgel påse med minst 500 mL konserverings lösning (standard extracellulär hyperkalemilösning). Placera detta på is och håll vid 4 ° c. Detta steg kan ändras enligt experimentell design och mål.
2. förfarande för mottagande:
- Anestesi induktion och djur beredning:
- Utför anestesi och övervakning enligt beskrivningen i givar förfarandet (steg 1.1.1 till 1.1.6).
- Efter insättning av perkutan Central venösa slidan introduktören i rätt halsvenen, sätt en central venkateter (t. ex. dubbel-lumen) i den vänstra halsvenen med hjälp av Seldinger teknik. Alternativt, detta kan göras efter mittlinjen sternotomi som beskrivs ovan.
- Cardiopulmonary Bypass (CPB):
- Utför mittlinjen sternotomi och exponera hjärtat och stora fartyg som beskrivs i givar förfarandet (steg 1.2.1 till 1.2.4).
- Dissekera mellan SVC och Innominate artär, och IVC och hjärtsäck med hjälp av Metzenbaum och "rätvinklig" pincett. Omringa SVC och IVC med hjälp av en navel tejp (alternativt en enkel O Silk sutur kan användas). Säkra varje band/sutur med en Tourniquet.
- Placera 2 koncentriska handväska-strängsuturer med hjälp av en 4-0 prolene sutur på distala stigande aorta adventitia (undvika full tjocklek suturer). Placera handväska-strängsuturer med 4-0 prolene på IVC och SVC på nivån för perikardiell reflektion. Säkra dessa suturer med tourniquets.
- Under CPB beredning, har en assistent setup och Prime systemet enligt utredarna ' och experimentella behov. Den nuvarande proceduren använder samma inställning som används som institutionens kardiovaskulär kirurgi Division och sysselsätter hjälp av en utbildad parfysionist. Bypass-systemet är primade med 2 liter kristalloid lösning (t. ex. Plasmalyte) med 500 mg Solumedrol.
- Administrera 30 000 enheter heparin (> 300 U/kg) för att uppnå systemisk antikoagulation. Aktiverad koagulationstid (ACT) bör vara över 300 s, om testet är tillgängligt.
- Cannulate aorta med en 17 till 21 F arteriell kanyl. Använd en extrakorporeal membran oxygenator (ECMO) kanyl (t. ex. eopa arteriell kanyl) införas med hjälp av Seldinger teknik för att underlätta detta steg och undvika blodförlust. Alternativt kan en standard bypass arteriell kanyl användas.
- Anslut kanylen till den arteriella linjen i bypass-kretsen med en 3/8-3/8-kontakt. Säkerställ fullständig devädring för att undvika luftemboli.
- Utför en bicaval kanylering. För detta, kannulate SVC och sedan IVC med 24 till 28 F rätvinklig enstegs venös kanyl (t. ex. DLP enda lumen vinklad venös kanyl).
- Först gör ett litet snitt (5 mm) i mitten av handväskan-String suturen. Dilate snittet med ett litet vinklat instrument (t. ex. höger vinkel eller en Snap). Sätt kanyl styra vinkeln fint i SVC och inferiorly i IVC (bort från hjärtat). Säkra genom att dra åt Tourniquet håller handväskan-String suturen.
- Mellan varje steg, täck snittet med ett finger för att undvika överdriven blödning. Anslut kanyler till den venösa linjen i bypass-kretsen med en 3/8-3/8-1/2 Y-kontakt. Se till att devädring undviker en luft SLUs i systemet.
- Initiera CPB. Justera flödet för att bibehålla ett arteriellt tryck över 50 mmHg (cirka 4 L/min). Upprätthålla normothermia under hela förfarandet.
Obs: dessa inställningar kan ändras enligt experimentell design. Vasoaktiva läkemedel bör endast administreras under CPB om det behövs för att underlätta tryckreglering (t. ex. epinefrin infusion).
- Givare hjärta implantation:
- Efter initiering av CPB, öppna vänster lungsäcken och dra in det infödda hjärtat till höger. Dissekera och omringa vänster hemiazygous ven med hjälp av en skarp dissektion instrument (t. ex. Metzenbaum) och en rätvinklig, respektive. Ligat distalt med en O sidenslips. Endast en ligatur behövs som det infödda hjärtat kommer att tas bort.
- Cross-klämma mottagaren aorta proximalt till arteriell kanyl. Snare både Vena Cava med tourniquets som tidigare placerats med hjälp av O Silk ties. Ta bort mottagarens ursprungliga hjärta. Alternativt kan hjärtat gripas med hjälp av standard hypotermiska blodbaserade cardioplegia.
- Under kardiektomi, se till att bibehålla stora manschetter i mottagaren för att underlätta donator Hjärtaimplantat. För detta, avsnitt aorta och lungartären proximalt, nära sina rötter. På samma sätt måste vänster och höger atrier hållas med stora manschetter. Lämna höger och vänster förmaksbihang i mottagaren manschetter, som kan behövas under anastomoser.
- Förbered donatorns hjärta för implantat.
- Dissekera lungartären från vänster förmak och separera lungartären helt från aorta. Lämna minst 2-3 cm av varje fartyg som ska trimmas under implantatet efter behov. Ligate både Vena Cava med en O sidenslips. Förena alla pulmonell vener, skapa en enda vänster förmaksmanschetten att anastomosed.
- Jämför vänster förmaksmanschett storlekar (givare och mottagare) och trimma varje som behövs för att bli liknande storlekar. Mottagarens vänstra förmaks bihang kan förkortas, eller givarens vänstra förmakstak och bihang kan öppnas för detta.
- Leverera den första kardioplegia dosen till givar hjärtat med hjälp av den tidigare placerade kardioplegia kanyl som beskrivs i steg 1.2.6. Cardioplegic skyddande lösning består av 500 mL av en 2:1 blandning av blod: kristalloid som innehåller 24 mEq av kalium och levereras vid 10 ° c. Uppnå önskad kalium koncentration genom att tillsätta kaliumklorid i den kardioplegiska blandningen.
- Efter slutförandet av varje anastomos, leverera en extra dos av 300 mL av cardioplegia vid 10 ° c som innehåller 8 mEq av kalium.
- Efter alla anastomoser och innan avlägsnande av aorta kors klämma, administrera en extra dos av 500 mL varm (37 ° c) blod kardioplegia med 8 mEq av kalium.
- Ta bort givaren hjärta från lagring och implantat med standard biatriellt anastomotic teknik i följande sekvens: vänster förmak, höger förmak, lungartären, och aorta. Använd en 4-0 prolene sutur med en SH nål för vänster och höger förmak, och aorta och en 5-0 prolene sutur med en BB nål för lungartären.
- Vänster förmak: placera en 4-0 prolene sutur vid korsningen mellan vänster förmak och IVC (höger sämre marginal) och en annan på 180 ° från den första, ansluter donator och mottagare manschetter. Slutföra den bakre väggen anastomosis. Slutföra den främre väggen anastomosis. Detta utförs från den överlägsna suturen till sämre suturen.
- Höger förmak: öppna givaren höger Atrium från bihang mot IVC, skapa en donator manschetten som matchar mottagaren manschetten storlek. Börjar vid sämre vinkel (korsning mellan IVC och höger förmak), slutföra innerväggen anastomos och sedan den laterala väggen.
- Pulmonell artär: trimma kanterna på både mottagare och donator lungartärerna att skapa matchande storlekar. Placera en 5-0 prolene sutur på vänster sidovägg förenar givare och mottagare fartyg och en annan på den högra laterala kanten. Slutföra sämre väggen anastomos och sedan den främre väggen anastomos.
- Aorta: trim som beskrivs med lungartären. Placera en sutur på den vänstra laterala väggen anslutande givare och mottagare fartyg. Slutföra sämre väggen och sedan den främre väggen anastomosis.
- Utföra enstaka lager anastomoser, med undantag för lungartären, där en dubbel lager anastomos krävs. Svin vävnaden är extremt bräcklig och bör hanteras försiktigt för att undvika tårar. Viktigt, den Pulmonell artär anastomos är det känsligaste steget av implantatet och måste göras med extrem omsorg. Implantat tekniken kan modifieras i enlighet med kirurgens preferenser och den experimentella utformningen.
- Efter slutförandet av alla anastomoser och varm cardioplegia dos leverans som beskrivs ovan, ta bort aorta Cross-klämma. Inspektera alla anastomoser för platser av blödning, de bör korrigeras på denna punkt.
- Reperfuse givaren hjärtat för 60 min på CPB. Ventrikulär arytmier kan behandlas med intern defibrillering (20-50 J). Vid behov kan ventrikulär pacing användas för att bibehålla en hjärtfrekvens på 100 slag per minut. antiarytmiska läkemedel (t. ex. amiodaron, lidokain, eller magnesiumsulfat) kan användas vid utredarna gottfinnande, om det behövs.
- Efter 60 min av reperfusion, administrera 1 g kalciumklorid. Initiera avvänjning från CPB genom att minska flödet till hälften, sedan en fjärdedel och sedan av. Den centrala venösa linjen kan användas för att övervaka Centralt ventryck, inriktning 10 mmHg. Initiera infusion av vasoaktiva och inotropa mediciner (t. ex. dobutamin, epinefrin, noradrenalin, och vasopressin) enligt experimentell design eller utredarna gottfinnande.
- Avvänjning bedöms vara framgångsrik om djuret upprätthåller ett systoliskt arteriellt tryck över 60 mmHg i över 30 minuter efter utsättning av CPB. Eftersom detta inte är en överlevnads modell, inte vända heparin; kontinuerlig blödning kan förekomma från nålhål och dissekerade strukturer (t. ex. bröstbenet). Givar hjärtan reagerar väl på små och upprepade doser av volym ersättning med hjälp av CPB systemet. Dessutom, svin modellen reagerar väl på dobutamin.
Obs: mottagar ledningen bör skräddarsys efter utredarnas erfarenhet och experimentella utformning. En hjärtanestesiolog får stöd på detta sätt.
3. bedömning av transplantat:
- Funktionell bedömning:
- Denna stora djurmodell har fördelen av att ha en öppen kista strategi hela tiden, vilket underlättar direkt funktionell bedömning. För att mäta hjärtkontraktilitet, Använd tryck-volym (PV) loop analyser, ekokardiografi, och/eller högersidig kateterisering.
- Tryck-volym slingor10: placera en navel band runt IVC, och infoga en PV värmeledningsförmåga kateter i den vänstra ventrikeln genom en liten apikal ventriculotomy att möjliggöra kontinuerliga mätningar av Vänsterkammar PV relationer. Få steady-state-inspelningar för att generera volym beroende parametrar (t. ex. utvecklat tryck-och strokearbete) och sedan erhålla ocklusionsinspelningar i tre exemplar genom att ockludera IVC för att generera volym oberoende parametrar (t. ex. preload-rekrytabel stroke arbete).
- Ekokardiografi: har hjärtanestesiologer få epikardiell bilder med hjälp av en vanlig transesofageal sond.
- Högersidig kateterisering: sätt i en svanar-Ganz kateter genom den venösa slidan placeras i början av förfarandet och GUID mot lungartären. Detta gör det möjligt för mätning av central ventryck, höger kammartryck, pulmonell artär tryck, pulmonell kapillär kil tryck, och hjärt minut effekt med hjälp av termodilutionsteknik teknik.
- Utföra kontraktila utvärdering vid baseline och efter 2 och 3 h efter reperfusion av givaren hjärtat i mottagaren. Detta kan modifieras av utredarna enligt experimentell design.
- Metabolisk bedömning:
- För metaboliska bedömningar, samla arteriella och venösa (alternativt: blandade venösa) blodprov och lagra plasman för efterföljande analyser. Blod gasanalyser och laktathalter i real tid bör också erhållas.
- Samla in dessa prover Vidbaslinjen i givaren, före upphandling i givaren, vid baseline i mottagaren, och vid 15, 30 och 60 min av reperfusion av givaren hjärta (efter avlägsnande av Cross-Clamp). Detta kan ändras enligt experimentell design.
- Experiment uppsägning och dödshjälp:
- När alla bedömningar är avslutade, exsanguinate mottagar djuret i den venösa reservoaren av CPB krets genom att öppna den venösa linje klämman. Alternativt kan exsangination uppnås genom skörd av hjärt alograft att samla in prover (dvs. myokardiella biopsier).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna prekliniska modell har använts framgångsrikt sedan 19945,6,8,9. Tabell 1 visar representativa resultat från tryck-volymförhållanden och ekokardiografiska parametrar tagna vid baseline, och 3 h efter transplantation i en uppsättning av 5 experiment. Även om vi ser en minskning av myocadial kontraktilitet efter transplantation, var detta inte statistiskt signifikant.
Figur 1 visar representativa tryck-volymloopar som samlats in från ett experiment vid samma tidpunkter. Vid "steady-state"-bedömningar (figur 1, översta raden). volym beroende parametrar registreras, till exempel högsta och lägsta hastighet av utvecklat tryck. Volym oberoende parametrar erhålls genom intermittent ocklusion av IVC. Med detta minskar volymen av den vänstra ventrikeln successivt och olika relationer kan beräknas. I den mellersta raden i figur 1, vi ser de systoliska och end-diastoliska tryck-volymförhållanden registreras, som representerar förhållandet mellan det systoliska eller slutet diastoliska trycket, respektive, med motsvarande den änddiastoliska volymen. I den nedersta raden OD bild 1, ser vi inspelningen av preload rekrytabel stroke arbete, vilket är förhållandet mellan stroke arbete och motsvarande slutet diastoliska volym.
Slutligen, som framgår av figur 2, kan olika andra metaboliska (t. ex. laktathalter och pH) och funktionella parametrar (t. ex. hjärt minut tal) mätas med denna modell för att testa olika hypoteser.
Figur 1 . Representativ tryck-volym slingor i ett stabilt tillstånd, under interiören Vena Cava (IVC) ocklusion, och relationer (preload rekrytabel stroke arbete). A) ett experiment vid baseline. B ett experiment efter 3 h av reperfusion. PRSW = preload rekrytabel stroke arbete. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Mjölksyra-och pH-trender under hjärt transplantations protokollet. Efter reperfusion, det finns en signifikant ökning av laktat och minskning av pH. Detta kan hanteras genom att bibehålla adekvat perfusionstryck med rätt volym ersättning och vasoaktiv droganvändning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Originalplan | 3 timmar efter transplantation | p-värde | |
| Pulmonell artär kateter | |||
| Hjärt index (L/min) | 3,7 ± 0,8 | 2,8 ± 0,3 | 0,485 |
| Analys av tryck volym | |||
| PRSW (ERG ∙ cm-3∙ 103) Max dP/DT (mmHg ∙ s-1) Min dP/DT (mmHg ∙ s-1) |
62,1 ± 7 2500 ± 425 -1537 ± 238 |
53,8 ± 10 1815 ± 410 -1427 ± 317 |
0,841 0,309 0,547 |
| Ekokardiografi | |||
| LV EF (%) LV FAC (%) RV FAC (%) |
47,3 ± 3,0 53,8 ± 3,6 39,2 ± 1,3 |
37,0 ± 4,2 46,4 ± 2,9 32,8 ± 3,6 |
0,095 0,222 0,309 |
Tabell 1. Representativa tryck-volym relationer och ekokardiografiska parametrar från en uppsättning av 5 transplantationer utförs vid baseline och efter 3 h av reperfusion. Data som presenteras som medelvärde ± standardfel och jämförs med Wilcoxon undertecknade rank test. EF = ejektionsfraktion. FAC = bråk delområde förändring. LV = vänster kammare. Max dP/DT = maximal tryckförändring i vänster kammare. Min dP/DT = lägsta hastighet PF tryckförändring i vänster ventricule. PRSW = preload rekrytabel stroke arbete. RV = höger kammare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript beskriver en preklinisk modell av ortotopisk hjärttransplantation med stor djur. Olika små djurmodeller av heterotopisk hjärttransplantation har framgångsrikt använts för att studera effekterna av nya behandlingar för att förbättra organkonservering och minska ischemia-reperfusion skada11,12, 13. Dessutom, små djurmodeller tillåter överlevnads modeller och långsiktig uppföljning för att undersöka utvecklingen av avstötning och kardiell transplantatavstötning vasculopati11,12,13. Emellertid, de flesta av dessa nya terapier misslyckas eller aldrig göra det till kliniska prövningar. För att underlätta och effektivisera den kliniska översättningen behövs en tillförlitlig och kliniskt relevant modell för stora djur.
Detta protokoll har utformats för att undersöka olika behandling och organ bevarandestrategier för att förhindra eller minska primära transplantat dysfunktion och ischemia-reperfusion skada. Som nämnts ovan har denna modell använts sedan 1994. Författarna tidigare visat de positiva effekterna av hyperton saltlösning infusion i givaren8 eller mottagare9 före organ anskaffning eller implantat, respektive. Dessutom undersökte författarna olika bevarande protokoll och strategier, såsom användning av donator skjul blod infusioner under kall lagring6 och effekten av insulin tillskott i cardioplegic lösning5.
Den största begränsningen av den teknik som beskrivs här är kortsiktig uppföljning. En långsiktig överlevnad svin hjärttransplantation modell skulle vara resursintensiv och innebära höga kostnader. Det förfarande som beskrivs här fokuserar på akut ischemia-reperfusion skada och är en pålitlig preklinisk metod för att undersöka nya interventioner som har testats och validerats i mindre experimentella modeller, såsom murin modellen. Dessutom kan denna teknik lätt genom att anpassas för långsiktiga uppföljningsexperiment. Detta skulle innebära adekvat heparin återföring, djurdekanylering, adekvat hemostas, och bröstet stängning.
Svin hjärtat är ofta anses vara den mest anatomiskt liknar det mänskliga hjärtat när man använder stora djurmodeller. Som sådan, det är en idealisk plattform för att utföra hjärt kirurgisk forskning. Emellertid, det är viktigt att notera att vävnaden typiskt beskrivs som bräcklig och spröda, särskilt i rätt förmak och lungartären, är benägna att tårar14. Dessutom, svin hjärtat anses känslig för manipulation och benägna att arytmier, varför magnesiumsulfat måste rutinmässigt administreras till varje djur i början av experimentet. En viktig skillnad mellan svin modell och klinisk hjärttransplantation är vänster hemiazygous ven i svin, som rinner direkt in i hjärtats sinus. Detta måste vara och ligaturer under mottagar förfarandet för att undvika kontinuerlig blödning. Slutligen, svin modellen är mycket känslig för ischemia, vilket förefaller lämpligt för akuta studier i hjärttransplantation15.
Mottagarhantering efter transplantation kan vara utmanande ibland. Det är viktigt att revidera alla anastomoser och se till att ingen blödning. Ett särskilt besvärligt område är runt den bakre lungartären. Som nämnts ovan, svin vävnader och bräckliga och kan lätt Riva; om detta händer, kirurgen kan snabbt gå tillbaka på CPB att rätta till problemet och försök avvänjning igen. Ventrikelflimmer uppträder vanligtvis under initial reperfusion; om detta inte löser med enkla defibrillering, farmakologiska interventioner, såsom 2 g magnesiumsulfat eller 1 mg/kg lidokain, kan administreras och en följande defibrillering bör tillämpas. Normal sinus rytm kan lätt uppnås på under 3 min.
Detta förfarande kräver minst en utbildad kirurg som skall utföras; Dessutom behövs 3 till 5 experiment för att optimera protokollet inom varje forskargrupp. Dessutom bör teamet tilldela en medlem att uteslutande utföra djur anestesi och Mottagarhantering som behövs (t. ex. inotropa stöd). På grund av de viktiga överväganden som rör den svin-modell som beskrivs ovan är följande steg kritiska i detta förfarande: anestesi induktion och intubation (viktigt för att undvika att förlänga hypoxemiska perioder), hjärt manipulation vid bedömning, kanylering för hjärt bypass, och rätt förmaks-och Pulmonell artär manipulation och anastomosis. Men eftersom dessa är rutinmässiga åtgärder som utförs i klinisk praxis, bör de utföras med omsorg och uppmärksamhet på Detaljer. Konsekvens och upprepning kommer att leda till en optimerad och tillförlitlig modell för olika användningsområden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Angiocath 20G | BD | 381704 | |
| Calcium Chloride 1g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Cardioplegia solution | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Cautery Pencil | Covidien | E2515H | |
| Central Venous Catheter double-lumen | Cook Medical | C-UDLM-501J-LSC | |
| CPB pack | Medtronic | Custom-made cardiopulmonary bypass perfusion circuit. | |
| D5W 5% 250ml | Baxter | JB1064 | |
| DLP Aortic Root Cannula/stabber | Medtronic | 12218 | |
| DLP single-lumen venous cannula (24F or 28F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Dobutamine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Electrode Polyhesive | Covidien | E7507 | |
| EOPA arterial cannula (17F or 21F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Epinephrine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Gloves, nitrile, medium | Fischer | 27-058-52 | |
| Heparin 1000 IU/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Ketalean (Ketamine) inj. 100mg/ml, 50ml/vial | Health Canada | Requires health canada approval | |
| Lidocaine/Xylocaine 1% | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Magnesium Sulfate 5g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Midazolam inj. USP 5mg/ml vial/10ml | Health Canada | Requires Health canada approval | |
| MPS Quest delivery disposable pack | Quest medical | 5001102-AS | |
| NACL 0.9% 1L | Baxter | JB1324 | |
| Organ Bag | CardioMed | 2990 | |
| Pipette Tips, 1 mL | Fisherbrand | 02-707-405 | |
| Propofol 1mg/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Rocuronium | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Set Admin Prim NF PB W/Checkvalve | Smith Medical | 21-0442-25 | Intravenous infusion pump line. Researchers should choose infusion lines compatible with the infusion pump available at their facilities |
| Set Intro Sheath 8.5FRx 10CM | Arrow | SI-09880 | |
| Sofsilk 0 wax coated | Covidien | S316 | |
| Solumedrol 500mg/5ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Suction tip | Covidien | 8888501023 | |
| Suction Tubing 1/4" x 120" | Med-Rx | 70-8120 | |
| Suture 5.0 Prolene BB | Ethicon | 8580H | |
| Suture Prolene Blum 4-0 SH 36 | Ethicon | 8521H | |
| Sutures 2.0 Prolene Blu M SH | Ethicon | 8523H | |
| Sutures BB 4.0 Prolene | Ethicon | 8881H | |
| Tracheal Tube, 6.5mm | Mallinckrodt | 86449 |
References
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-third Adult Heart Transplantation Report-2016; Focus Theme: Primary Diagnostic Indications for Transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1158-1169 (2016).
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation_ Thirty-first Official Adult Heart Transplant Report-2014; Focus Theme_ Retransplantation. The. Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 996-1008 (2014).
- Cosío Carmena, M. D. G., Gómez Bueno, M., et al. Primary graft failure after heart transplantation: characteristics in a contemporary cohort and performance of the RADIAL risk score. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 32 (12), 1187-1195 (2013).
- Fedak, P. W. M., Rao, V., et al. Combined endothelial and myocardial protection by endothelin antagonism enhances transplant allograft preservation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129 (2), 407-415 (2005).
- Ramzy, D., Rao, V., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Wicomb, W. N., Cooper, D. K., Barnard, C. N. Twenty-four-hour preservation of the pig heart by a portable hypothermic perfusion system. Transplantation. 34 (5), 246-250 (1982).
- Badiwala, M. V., Ramzy, D., et al. Donor pretreatment with hypertonic saline attenuates primary allograft dysfunction: a pilot study in a porcine model. Circulation. 120, 11 Suppl 206-214 (2009).
- Ribeiro, R. V. P., Badiwala, M. V., Ramzy, D., Tumiati, L. C., Rao, V. Recipient Hypertonic Saline Infusion Prevents Cardiac Allograft Dysfunction. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. , (2018).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Ratschiller, T., Deutsch, M. -A., et al. Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular Gland-preserving Technique for Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Transplantation. 1, (2018).
- Gong, W. Mouse Heterotopic Abdominal Heart Transplant Model. Rodent Transplant Medicine. , Chapter 11 107-118 (2014).
- Robinson, N., Souslian, L., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Dalmasso, A. P., Bianco, R. W. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 27 469-491 (2015).
- Bianco, R. W., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Voight, J., Dalmasso, A. P. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 25 393-410 (2009).
