Summary
Hier beschrijven we een pre-klinisch groot dier (Porcine) model van orthotopic harttransplantatie dat stevig is vastgesteld en gebruikt om nieuwe cardioprotective strategieën te onderzoeken.
Abstract
50-jaren na het eerste succesvolle rapport blijft harttransplantatie de Gold-standaardbehandeling voor in aanmerking komende patiënten met gevorderde hartinsufficiëntie. Er zijn meerdere modellen voor kleine dieren van harttransplantatie gebruikt om de acute en langetermijneffecten van nieuwe therapieën te bestuderen. Echter, weinigen zijn getest en bewezen succes in klinische proeven. Het is van cruciaal belang om nieuwe therapieën te evalueren in een klinisch relevant model voor grote dieren voor een efficiënte en betrouwbare vertaling van de bevindingen van basis studies. Hier beschrijven we een pre-klinisch groot dier (Porcine) model van orthotopic harttransplantatie die stevig is vastgesteld en eerder gebruikt om nieuwe cardioprotective strategieën te onderzoeken. Deze procedure richt zich op acute ischemie-reperfusie letsel en is een betrouwbare methode om nieuwe interventies te onderzoeken die zijn getest en gevalideerd in kleinere experimentele modellen, zoals het Murine-model. We tonen zijn nut bij het beoordelen van cardiale prestaties tijdens de vroege periode na de transplantatie en andere mogelijke mogelijkheden die het model mogelijk heeft.
Introduction
50-jaren na het eerste succesvolle rapport blijft harttransplantatie de Gold-standaardbehandeling voor in aanmerking komende patiënten met gevorderde hartfalen1. Hoewel ischemische tijden van maximaal vier uur voldoende worden getolereerd, een ischemische tijd van meer dan zes uur wordt geassocieerd met inferieure uitkomsten2. Primaire transplantaat dysfunctie blijft de belangrijkste oorzaak van vroege morbiditeit en sterfte na transplantatie2,3. De oorzaken van primaire transplantaat dysfunctie zijn multifactoriële en omvatten het gebruik van marginale organen, ontvanger pulmonale vaatziekten, hyperacute afwijzing, en ischemie-reperfusie letsel opgelopen op het moment van transplantatie3.
Meerdere studies hebben nieuwe methoden voor het behoud van donor hart onderzocht om de incidentie van primaire transplantaat disfunctie4,5,6,7te verminderen. Het is gebruikelijk om nieuwe technieken en behandelingen te beoordelen in Murine modellen van ischemie-reperfusie letsel of heterotopische harttransplantatie. Bovendien staan kleine diermodellen overlevings modellen en lange termijn follow-up toe om de ontwikkeling van afstoting en cardiale transplantaat vasculopathie11,12,13te onderzoeken. Echter, de meeste van deze strategieën mislukken initiële klinische pilot proeven of nooit bereiken dit stadium. Het is van het allergrootste belang om nieuwe therapieën te evalueren in een klinisch relevant model met een groot dier voor een efficiënte en betrouwbare vertaling van de bevindingen van basis studies.
Het hart van de varkens wordt vaak beschouwd als de meest anatomisch vergelijkbaar met het menselijk hart bij het gebruik van modellen met grote dieren. Als zodanig is het een ideaal platform om cardiale chirurgische onderzoek uit te voeren. Er zijn echter verschillende belangrijke factoren om te overwegen bij het gebruik van een varkens model. Ten eerste wordt het weefsel meestal beschreven als kwetsbaar en brokbaar, vooral in het rechter atrium en de longslagader, die gevoelig is voor tranen14. Bovendien, het varken hart wordt beschouwd als gevoelig voor manipulatie en gevoelig voor aritmie, dat is waarom men moet routinematig een anti-arrythmetic toedienen aan elk dier aan het begin van het experiment. Een belangrijk anatomisch verschil tussen het varkens model en de klinische harttransplantatie is de linker hemiazygeuze ader in de varkens die rechtstreeks in de coronaire sinus afvloeit. Dit moet worden geligeerd tijdens de ontvangende procedure om te voorkomen dat continue bloeden. Tot slot, het varkens model is zeer gevoelig voor ischemie, maar het is nog steeds geschikt voor acute studies bij harttransplantatie15.
Dit manuscript beschrijft een pre-klinisch groot dier (Porcine) model van orthotopic harttransplantatie die stevig is vastgesteld en gebruikt om nieuwe cardioprotective Strategies onderzoeken5,6,8 ,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het institutioneel Comité voor dierenverzorging keurde alle experimentele protocollen goed, en de dieren werden behandeld volgens de "gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren", opgesteld door het Instituut voor laboratorium dierlijk materiaal, nationale Onderzoeksraad, 1996. Mannelijke Yorkshire varkens (40 – 50 kg) werden gebruikt om de orthotopic harttransplantaties uit te voeren (dier grootte kan variëren afhankelijk van de onderzoekers discretie en experimentele doelen).
1. donor procedure
- Anestheticum inductie en dier preparaat:
- Premedicate het dier met behulp van een intramusculaire injectie van ketamine (20 mg/kg), midazolam (0,3 mg/kg), en atropine (0,04 mg/kg). Voer anesthetische inductie en onderhoud uit met behulp van inhalationele Isofluraan (einde getijden concentratie: 1% – 3%) + 3 L/min O2 via gezichtsmasker.
- Bevestig anesthetische toereikendheid door te zorgen voor een ontspannen kaak Toon en een afwezigheid van pijn tijdens teen knijpen. Anesthetische toereikendheid moet de institutionele richtlijnen volgen.
- Zodra de verdoving is bevestigd, voert u een orotracheale intubatie uit met behulp van een endotracheale buis van maat 6.5 – 8 mm.
- Plaats een zuurstof verzadigings monitor op het oor of de onderlip voor continue bewaking. Plaats de cauterie elektrode op de rug van het dier.
- Plaats een perifere intraveneuze toegang via de oorader (bijv. 20 g Angiocath). Start een onderhouds infusie (bijv. 0,9% NaCl). Dien 2 g magnesium sulfaat toe om aritmie te voorkomen.
- Plaats een percutane centrale veneuze schede introducer met behulp van de Seldinger techniek in de rechter halsader ader als rechts-zijdige hartkatheterisatie en cardiale output metingen moeten worden uitgevoerd. Plaats het dier in Trendelenburg positie om veneuze toegang te vergemakkelijken. Als alternatief kan dit worden gedaan in de linker interne halsader ader. Als toegang niet tot stand kan worden gebracht, kan deze stap worden uitgevoerd na een middellijn sternotomie door het ontleden van de inwendige halsader (links of rechts) en het rechtstreeks plaatsen van de mantel.
- Aankoop van donor hart:
- Voer een middenlijn sternotomie uit vanaf het midden van de cervicale regio tot onder het xiphoïde proces met behulp van een cauterie pen. Open het borstbeen met een been zaag. Zorg voor adequate hemostase gedurende de gehele procedure (bijv. wij sternum, en/of toepassing van botwax).
- In de cervicale regio, intrekken van de sternocleidomastoïde spier naar het centrum en ontleden de rechter halsslagader (als alternatief, dit kan worden gedaan met de linker halsslagader). Plaats een arteriële toegangslijn (bv. 20 g Angiocath) in de juiste halsslagader voor invasieve arteriële Drukbewaking.
- Dissect en verwijder de thymus uit over het pericardium. Til de thymus voorzichtig uit het pericardium, gebruik het cauterie en ontleden de structuur van het pericardium. Om bloeden te voorkomen, cauteriseren de kleine vaten die afkomstig zijn van de aorta en de superieure vena cava (SVC) om de thymus te irrigeren.
- Open het pericardium. Ontleden de aortopulmonaire ruimte met behulp van de cauterie. Laat de assistent hiervoor de rechter ventriculaire uitstroom track ondeugdelijkheid en de longslagader naar links intrekken en de chirurg de aorta aan de rechterkant intrekken. Doe dit zorgvuldig om directe laesies aan de longslagader te voorkomen.
- Wis het voorste deel van de stijgende aorta van bindweefsel. Trek de rechter ventriculaire uitstroom tractus voorzichtig in en plaats een hechtdraad met behulp van een 4-0 prolene op de proximale oplopende aorta adventitia (Vermijd volledige dikte hechtingen). Beveilig deze hechting met een tourniquet.
- Dien 30.000 eenheden heparine (> 300 e/kg) toe om systemische anticoagulatie te bereiken. Plaats de cardioplegia Delivery canule (bijv. DLP aorta wortel canule) in de oplopende aorta tussen de eerder geplaatste portemonnee-snaar en Bevestig door de tourniquet aan te spannen. Bereid de cardioplegic-oplossing die zal worden gebruikt en maak verbinding met de lever canule.
- Open de SVC en inferieure vena cava (IVC) en de linker, inferieure pulmonale ader om een adequate hart ontvening te garanderen. Plaats de aorta cross-Clamp op de distale oplopende aortse (boven de cardioplegia canule). Als alternatief kan de linker ventrikel worden geventileerd door het openen van de linker atriale aanhangsel en het plaatsen van zuigkracht.
- Start cardioplegia-infusie gericht op een aorta-wortel druk van 80 tot 100 mmHg.
Opmerking: de auteurs hebben een model toegepast met 1,5 L van een standaard extracellulaire hyperkaliëmische cardioplegische oplossing bij 4 °C. Verschillende oplossingen en volumes kunnen worden gebruikt volgens de experimentele opstelling. - Plaats ijsslush (0,9% NaCl) in de thoracische Holte en over het orgel voor koeling na het starten van cardioplegia. Nadat de cardioplegia infusie is voltooid, gaat u verder met cardiectomie op een traditionele manier. Sectie de aorta en de longslagader na de anoniem slagader en op de bifurcation, respectievelijk, om voldoende lengte voor het implantaat te garanderen.
- Na verwijdering, plaats het orgel in een orgaanzak met ten minste 500 mL conserverings oplossing (standaard extracellulaire hyperkaliëmische oplossing). Plaats dit op ijs en houd het op 4 °C. Deze stap kan worden aangepast volgens het experimentele ontwerp en de doelstelling.
2. procedure van de ontvanger:
- Anestheticum inductie en dier preparaat:
- Voer anesthesie en controle uit zoals beschreven in de donor procedure (stappen 1.1.1 tot 1.1.6).
- Na het inbrengen van de percutane centrale veneuze schede introducer in de rechter halsader ader, plaats een centrale veneuze katheter (bv. dubbel-lumen) in de linker halsader ader met behulp van de Seldinger techniek. Als alternatief kan dit worden gedaan na de middellijn sternotomie zoals hierboven beschreven.
- Cardiopulmonale bypass (CPB):
- Voer de middenlijn sternotomie uit en stel het hart en de grote vaten bloot zoals beschreven in de donor procedure (stappen 1.2.1 tot en met 1.2.4).
- Dissect tussen de SVC en de anoniem slagader, en de IVC en hartzakje met behulp van de metzenbaum en "rechts-hoek" Tang. Omcirkelen de SVC en IVC met behulp van een navelstreng (als alternatief kan een eenvoudige O-zijde hecht worden gebruikt). Bevestig elke tape/hechtdraad aan een tourniquet.
- Plaats 2 concentrische handtas-snaar hechtingen met behulp van een 4-0 prolene hechtmiddel op de distale oplopende aorta adventitia (Vermijd volledige dikte hechtingen). Plaats portemonnee-snaar hechtingen met behulp van 4-0 prolene op de IVC en de SVC op het niveau van de pericardiale reflectie. Beveilig deze hechtingen met tourniketten.
- Tijdens de CPB-voorbereiding, hebben een assistent Setup en prime het systeem volgens de onderzoekers ' en experimentele behoeften. De huidige procedure gebruikt dezelfde instellingen als de afdeling cardiovasculaire chirurgie van de instelling en maakt gebruik van de hulp van een getrainde parfusionist. Het bypass systeem is gevuld met 2 liter kristalloïde oplossing (bijv. Plasmalyte) met 500 mg solumedrol.
- Dien 30.000 eenheden heparine (> 300 e/kg) toe om systemische anticoagulatie te bereiken. Geactiveerde stollingstijd (ACT) moet hoger zijn dan 300 s, als de test beschikbaar is.
- Cannulaat de aorta met een 17 tot 21 F arteriële canule. Gebruik een Extracorporale membraan oxygenator (ECMO) canule (bijv. EOPA arteriële canule) ingebracht met behulp van de Seldinger techniek om deze stap te vergemakkelijken en bloedverlies te voorkomen. Als alternatief kan een standaard bypass arteriële canule worden gebruikt.
- Sluit de canule aan op de arteriële lijn van het bypass circuit met behulp van een 3/8-3/8-connector. Zorg voor volledige ontluchtend om te voorkomen dat de lucht embolie.
- Voer een bicaval-cannulatie uit. Voor dit, cannulaat de SVC en vervolgens de IVC met behulp van 24 tot 28 F rechte haaks ééntraps veneuze canule (bv. DLP enkelvoudige lumen haaks veneuze canule).
- Eerst, maak een kleine incisie (5 mm) in het midden van de portemonnee-string hecht. Laat de incisie met een klein schuin instrument (bijv. rechte hoek of een snap) verwijden. Plaats de canule die de hoek bovenzijde in de SVC en ondeugdelijkheid in de IVC (weg van het hart). Veilig door het aandraaien van de tourniquet met de handtas-snaar hecht.
- Tussen elke stap, bedekken de incisie met een vinger om overmatige bloeden te voorkomen. Sluit de canules aan op de veneuze lijn van het bypass circuit met behulp van een 3/8-3/8-1/2 Y connector. Zorg ervoor dat het ontluchten is om een luchtsluis in het systeem te vermijden.
- Start CPB. Pas flow rates aan om een arteriële druk boven 50 mmHg (ongeveer 4 L/min) te handhaven. Normothermia gedurende de hele procedure te handhaven.
Opmerking: deze instellingen kunnen worden gewijzigd volgens het experimentele ontwerp. Vasoactieve medicatie mag alleen worden toegediend tijdens CPB indien nodig om te helpen bij de regulering van de druk (bv. adrenaline infusie).
- Implantatie van een donor hart:
- Na aanvang van de CPB, open de linker borstvlies en trek het oorspronkelijke hart naar rechts. Ontleden en omcirkelen de linker hemiazygeuze ader met behulp van een scherp dissectie-instrument (bijv. Metzenbaum) en een rechte hoek, respectievelijk. Ligate DISTAAL met een O zijde stropdas. Er is slechts één ligatuur nodig, omdat het oorspronkelijke hart wordt verwijderd.
- Cross-Clamp de ontvanger aorta proximaal naar de arteriële canule. Snare beide Vena Cava met de tourniquets eerder geplaatst met behulp van O Silk ties. Verwijder het oorspronkelijke hart van de ontvanger. Als alternatief kan het hart worden gearresteerd met behulp van standaard hypothermische bloed-gebaseerde cardioplegia.
- Zorg er tijdens de cardiectomie voor dat u grote manchetten in de ontvanger onderhoudt om het hart implantaat van donoren te vergemakkelijken. Hiervoor, sectie de aorta en longslagader proximaal, dicht bij hun wortels. Evenzo moeten de linker-en rechter atriums met grote manchetten worden gehouden. Laat de rechter en linker atriale aanhangsels in de ontvanger manchetten, die nodig kunnen zijn tijdens de anastomoses.
- Bereid het donor hart voor op het implantaat.
- Ontleden de longslagader van het linker atrium en scheid de longslagader volledig van de aorta. Laat ten minste 2-3 cm van elk vat om te worden bijgesneden tijdens het implantaat indien nodig. Ligate beide Vena Cava met een O zijde stropdas. Verenig alle pulmonale aderen, het creëren van een enkele linker atriale manchet te worden anastomosed.
- Vergelijk left Atrium Cuff maten (donor en ontvanger) en trim elke zo nodig om te worden van vergelijkbare maten. Het linker atriale aanhangsel van de ontvanger kan worden ingekort, of hiervoor kan het linker atriale dak en het aanhangsel van de donor worden geopend.
- Lever de eerste cardioplegia dosis aan het donor hart met behulp van de eerder geplaatste cardioplegia canule zoals beschreven in stap 1.2.6. Cardioplegische beschermende oplossing bestaat uit 500 mL van een 2:1 mengsel van bloed: kristalloïde bevattende 24 mEq kalium en geleverd bij 10 °C. Bereik de gewenste kaliumconcentratie door kaliumchloride toe te voegen aan het cardioplegische mengsel.
- Na de voltooiing van elke anastomose, lever een extra dosis van 300 mL cardioplegia bij 10 ° c met 8 mEq kalium.
- Na alle anastomosen en vóór verwijdering van de aorta-Kruis klem, dien je een extra dosis van 500 ml warme (37 °c) bloed cardioplegia toe met 8 meq kalium.
- Verwijder het donor hart uit de opslag en het implantaat met de standaard Biatriale anastomotische techniek in de volgende volgorde: linker Atrium, rechter Atrium, longslagader en aorta. Gebruik een 4-0 prolene hechtmiddel met een SH naald voor het linker en rechter Atrium, en de aorta en een 5-0 prolene hechtdraad met een BB naald voor de longslagader.
- Linker Atrium: plaats een 4-0 prolene hechtdraad op de kruising tussen het linker atrium en de IVC (rechter inferieure marge) en een andere op 180 ° vanaf de eerste, het aansluiten van de donor en ontvanger manchetten. Voltooi de achterste wand anastomose. Voltooi de anterieure wand anastomose. Dit wordt uitgevoerd vanuit de superieure hecht aan de inferieure hecht.
- Rechter Atrium: Open het donateurs rechter atrium van het aanhangsel naar de IVC, waardoor een donateurs manchet ontstaat die overeenkomt met de manchet maat van de ontvanger. Beginnend bij de inferieure hoek (kruising tussen IVC en rechter Atrium), voltooi de binnenwand anastomose en vervolgens de zijwand.
- Pulmonale slagader: Trim de randen van zowel de ontvanger als de longslagaders van de donor om bijpassende maten te creëren. Plaats een 5-0 prolene hechtdraad aan de linker zijwand met het verenigen van donor-en recipiënt vaten en een andere aan de rechter laterale rand. Voltooi de onderste wand anastomose en vervolgens de voorste wand anastomose.
- Aorta: Trim zoals beschreven met de longslagader. Plaats een hechtdraad aan de linker zijwand die donor-en ontvangende schepen verbindt. Voltooi de inferieure muur en vervolgens de voorste wand anastomose.
- Voer enkele gelaagde anastomoses uit, met uitzondering van de longslagader, waar een dubbellaagse anastomose nodig is. Het varkens weefsel is zeer kwetsbaar en moet zorgvuldig worden behandeld om tranen te voorkomen. Belangrijk is dat de longslagader anastomose de meest delicate stap van het implantaat is en met uiterste zorg moet worden gedaan. De implantaat techniek kan worden aangepast volgens de voorkeur van de chirurgen en het experimentele ontwerp.
- Na voltooiing van alle anastomosen en warme cardioplegia dosis levering zoals hierboven beschreven, verwijder de aorta Kruis klem. Inspecteer alle anastomosen op plaatsen van bloedingen, moeten ze op dit moment worden gecorrigeerd.
- Reparfuseer het donor hart voor 60 min op CPB. Ventriculaire aritmie kan worden behandeld met interne defibrillatie (20-50 J). Indien nodig kan ventriculaire pacing worden gebruikt om een hartslag van 100 slagen per minuut te handhaven. Antiaritmische geneesmiddelen (bijv. amiodaron, lidocaïne of magnesium sulfaat) kunnen, indien nodig, worden gebruikt bij de beoordelingsvrijheid van de onderzoekers.
- Na 60 minuten reperfusie, 1 g calciumchloride toedienen. Begin met spening van CPB door de stroom te verlagen naar de helft, vervolgens een kwart en vervolgens uit. De centrale veneuze lijn kan worden gebruikt voor het bewaken van de centrale veneuze druk, gericht op 10 mmHg. Initiëren infusie van vasoactieve en inotrope medicijnen (bijv. dobutamine, adrenaline, noradrenaline, en vasopressin) volgens het experimentele ontwerp of de discretionaire bevoegdheid van de onderzoekers.
- Het spenen wordt geacht succesvol te zijn als het dier gedurende meer dan 30 minuten na stopzetting van de CPB een systolische arteriële druk boven 60 mmHg handhaaft. Aangezien dit geen overlevings model is, de heparin niet omkeren; continu bloeden kan optreden van naald gaten en ontleed structuren (bv. borstbeen). Donor harten reageren goed op kleine en herhaalde doses van volume vervanging met behulp van het CPB-systeem. Daarnaast reageert het varkens model goed op dobutamine.
Opmerking: het beheer van de ontvangers moet worden afgestemd op de ervaring van de onderzoekers en het experimentele ontwerp. Een hart anesthesist kan op deze manier helpen.
3. beoordeling van de Graft:
- Functionele beoordeling:
- Dit grote diermodel heeft het voordeel dat er te allen tijde een open borst aanpak is, wat een directe functionaalbeoordeling vergemakkelijkt. Voor het meten van cardiale contractiliteit, gebruik van druk-volume (PV) lus analyses, echocardiografie, en/of rechts-zijdige katheterisatie.
- Druk-volume lussen10: plaats een navelstreng rond de IVC, en steek een PV geleiding katheter in de linker ventrikel door middel van een kleine apicale ventriculotomie om continue metingen van linker ventriculaire PV-relaties mogelijk te maken. Verkrijg Steady-State opnames om volumeafhankelijke parameters te genereren (bijv. ontwikkelde druk-en slagwerk) en verkrijg vervolgens occlusie opnames in drievulding door de IVC te occluderen om volume onafhankelijke parameters te genereren (bijv. aanwerpbare lijnwerk).
- Echocardiografie: hebben hart anesthesist te verkrijgen epicardial beelden met behulp van een standaard transesophageal sonde.
- Rechterzijde katheterisatie: plaats een zwanen-GANZ katheter door de veneuze schede geplaatst aan het begin van de procedure en de GUID naar de longslagader. Dit maakt het meten van de centrale veneuze druk, rechter ventriculaire druk, pulmonale slagader druk, pulmonale capillaire wedge pressure, en cardiale output met behulp van de thermodilutie techniek.
- Voer contractiele evaluatie uit op baseline en na 2 en 3 h post-reperfusie van het donor hart bij de ontvanger. Dit kan door de onderzoekers volgens het experimentele ontwerp worden gewijzigd.
- Metabole beoordeling:
- Voor metabole beoordelingen, verzamelen arteriële en veneuze (alternatief: gemengde veneuze) bloedmonsters en bewaar het plasma voor latere analyses. Ook real-time bloedgas analyses en lactaat niveaus moeten worden verkregen.
- Verzamel deze monsters bij aanvang van de donor, vóór de aanschaf bij de donor, bij aanvang van de ontvanger, en op 15, 30 en 60 minuten reperfusie van het donor hart (na het verwijderen van de dwars klem). Dit kan volgens het experimentele ontwerp worden aangepast.
- Beëindiging van het experiment en euthanasie:
- Zodra alle evaluaties zijn voltooid, exsanguinate het ontvangende dier in het veneuze reservoir van het CPB-circuit door het openen van de veneuze lijn klem. Als alternatief kan de exsanginatie worden bereikt door de cardiale alograft te oogsten om monsters te verzamelen (d.w.z. myocardiale biopsieën).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit pre-klinische model is met succes gebruikt sinds 19945,6,8,9. Tabel 1 toont representatieve resultaten van druk volume verhoudingen en echocardiografische parameters die zijn genomen bij aanvang en 3 uur na transplantatie in een reeks van 5 experimenten. Hoewel we een afname in de contractiliteit van myocadial zien na transplantatie, was dit niet statistisch significant.
Figuur 1 toont representatieve druk-volume lussen verzameld uit één experiment op dezelfde tijd-punten. Tijdens "steady-state"-evaluaties (Figuur 1, bovenste rij). volumeafhankelijke parameters worden geregistreerd, zoals de maximale en minimale snelheid van de ontwikkelde druk. Volume onafhankelijke parameters worden verkregen door intermitterende occlusie van de IVC. Hiermee neemt het volume van de linker ventrikel geleidelijk af en kunnen verschillende relaties worden berekend. In de middelste rij van Figuur 1zien we de eind-systolische en end-diastolische druk volume verhoudingen, die de relatie tussen de end-systolische of eind-diastolische druk vertegenwoordigen, respectievelijk, met de overeenkomstige eind diastolische volume. In de onderste rij od Figuur 1, zien we de opname van het aanwerpbare beroerte werk, dat is de relatie tussen de slagwerk en de bijbehorende eind-diastolische volume.
Tot slot, zoals te zien is in Figuur 2, kunnen verschillende andere metabole (bijv. lactaat niveaus en pH) en functionele parameters (bijv. cardiale output) met dit model worden gemeten om verschillende hypotheses te testen.
Figuur 1 . Representatieve druk-volume lussen in een steady-state, tijdens het interieur vena cava (IVC) occlusie, en relaties (aanwerpbare beroerte werk). A) één experiment op baseline. B) één experiment na 3 uur reperfusie. PRSW = voorladen aanwerpbaar slagwerk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 . Lactaat-en pH-trends tijdens het harttransplantatie protocol. Na reperfusie is er een significante toename van lactaat en afname van de pH. Dit kan worden beheerd door het handhaven van adequate perfusiedruk met juiste volume vervanging en vasoactieve druggebruik. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Basislijn | 3 uur na transplantatie | p-waarde | |
| Longslagader katheter | |||
| Cardiale index (L/min) | 3,7 ± 0,8 | 2,8 ± 0,3 | 0,485 |
| Druk volume analyse | |||
| PRSW (erg ∙ cm-3∙ 103) Max dP/DT (mmHg ∙ s-1) Min dP/DT (mmHg ∙ s-1) |
62,1 ± 7 2500 ± 425 -1537 ± 238 |
53,8 ± 10 1815 ± 410 -1427 ± 317 |
0,841 0,309 0,547 |
| Echocardiografie | |||
| LV EF (%) LV FAC (%) RV FAC (%) |
47,3 ± 3,0 53,8 ± 3,6 39,2 ± 1,3 |
37,0 ± 4,2 46,4 ± 2,9 32,8 ± 3,6 |
0,095 0,222 0,309 |
Tabel 1. Representatieve druk volume verhoudingen en echocardiografische parameters uit een set van 5 transplantaties uitgevoerd bij baseline en na 3 uur reperfusie. Gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout en vergeleken met de Wilcoxon ondertekende rang test. EF = ejectiefractie. FAC = fractionele gebieds wijziging. LV = linker ventrikel. Max dP/DT = maximumsnelheid van de drukverandering in de linker ventrikel. Min dP/DT = minimumsnelheid PF drukverandering in het linker ventricule. PRSW = voorladen aanwerpbaar slagwerk. RV = rechter ventrikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een groot dier pre-klinisch model van orthotopic harttransplantatie. Verschillende kleine diermodellen van heterotopische harttransplantatie zijn met succes gebruikt om de effecten van nieuwe behandelingen te bestuderen om het behoud van organen te verbeteren en om ischemie-reperfusie letsel te verminderen11,12, 13. Bovendien staan kleine diermodellen overlevings modellen en lange termijn follow-up toe om de ontwikkeling van afstoting en cardiale transplantaat vasculopathie11,12,13te onderzoeken. Echter, de meeste van deze nieuwe therapieën falen in of nooit te maken tot klinische proeven. Om de klinische vertaling te vergemakkelijken en te stroomlijnen, is een betrouwbaar en klinisch relevant model voor grote dieren nodig.
Dit protocol is ontworpen om verschillende behandelings-en orgaan conserverings strategieën te onderzoeken om primaire transplantaat dysfunctie en ischemie-reperfusie letsel te voorkomen of te verlagen. Zoals hierboven vermeld, dit model is gebruikt sinds 1994. Auteurs toonden eerder de gunstige effecten van hypertone zoutoplossing infusie in de donor8 of ontvanger9 voorafgaand aan orgel aankoop of implantaat, respectievelijk. Bovendien onderzochten auteurs verschillende conserverings protocollen en-strategieën, zoals het gebruik van donorbloed infusies tijdens koude opslag6 en het effect van insuline suppletie in de cardioplegische oplossing5.
De belangrijkste beperking van de hier beschreven techniek is de korte termijn follow-up. Een Long-term Survival-harttransplantatie model zou een resource-intensieve zijn en gepaard gaan met hoge kosten. De hier beschreven procedure richt zich op acute ischemie-reperfusie letsel en is een betrouwbare preklinische methode om nieuwe interventies te onderzoeken die zijn getest en gevalideerd in kleinere experimentele modellen, zoals het muriene model. Bovendien kan deze techniek gemakkelijk aangepast worden aan de lange termijn follow-up experimenten. Dit zou betrekking hebben op adequate heparine omkering, dierlijke decannulatie, adequate hemostase, en borstsluiting.
Het hart van de varkens wordt vaak beschouwd als de meest anatomisch vergelijkbaar met het menselijk hart bij het gebruik van modellen met grote dieren. Als zodanig is het een ideaal platform om cardiale chirurgische onderzoek uit te voeren. Echter, het is belangrijk op te merken dat het weefsel wordt meestal beschreven als fragiel en broze, vooral in het rechter atrium en de longslagader, wordt gevoelig voor tranen14. Bovendien, het varken hart wordt beschouwd als gevoelig voor manipulatie en gevoelig voor aritmie, dat is waarom magnesiumsulfaat moet routinematig worden toegediend aan elk dier aan het begin van het experiment. Een belangrijk verschil tussen het varkens model en de klinische harttransplantatie is de linker hemiazygeuze ader in de varkens, die direct in de coronaire sinus afvloeit. Dit moet worden geligeerd tijdens de ontvangende procedure om te voorkomen dat continue bloeden. Ten slotte is het varkens model zeer gevoelig voor ischemie, wat geschikt lijkt voor acute studies bij harttransplantatie15.
Het beheer van ontvangers na transplantatie kan soms lastig zijn. Het is belangrijk om alle anastomosen te herzien en ervoor te zorgen dat er geen bloedingen zijn. Een bijzonder lastig gebied is rond de achterste longslagader. Zoals hierboven vermeld, de varkens weefsels en kwetsbaar en kan gemakkelijk scheuren; Als dit gebeurt, kan de chirurg snel teruggaan op CPB om het probleem op te lossen en opnieuw te proberen te spenen. Ventrikelfibrillatie treedt meestal op tijdens eerste reperfusie; Als dit niet oplost met eenvoudige defibrillatie, kunnen farmacologische ingrepen, zoals 2 g magnesiumsulfaat of 1 mg/kg lidocaïne, worden toegediend en moet een volgende defibrillatie worden toegepast. Normaal sinusritme kan gemakkelijk worden bereikt in minder dan 3 minuten.
Deze procedure vereist dat ten minste één getrainde chirurg wordt uitgevoerd; Verder zijn er 3 tot 5 experimenten nodig om het protocol binnen elke onderzoeksgroep te optimaliseren. Bovendien moet het team een lid toewijzen om uitsluitend dieren anesthesie en het beheer van de ontvanger uit te voeren indien nodig (bijv. inotrope ondersteuning). Vanwege de belangrijke overwegingen met betrekking tot het hierboven beschreven varkens model zijn de volgende stappen van cruciaal belang in deze procedure: anesthetische inductie en intubatie (belangrijk om te voorkomen dat hypoxische perioden verlengen), cardiale manipulatie tijdens de beoordeling, cannulatie voor Cardiopulmonaire Bypass, en rechter atriale en pulmonale slagader manipulatie en anastomose. Omdat dit echter routinematige stappen zijn die in de klinische praktijk worden uitgevoerd, moeten ze met zorg en aandacht voor detail worden uitgevoerd. Consistentie en herhaling zal leiden tot een geoptimaliseerde en betrouwbare model voor verschillende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amiodarone | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Angiocath 20G | BD | 381704 | |
| Calcium Chloride 1g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Cardioplegia solution | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Cautery Pencil | Covidien | E2515H | |
| Central Venous Catheter double-lumen | Cook Medical | C-UDLM-501J-LSC | |
| CPB pack | Medtronic | Custom-made cardiopulmonary bypass perfusion circuit. | |
| D5W 5% 250ml | Baxter | JB1064 | |
| DLP Aortic Root Cannula/stabber | Medtronic | 12218 | |
| DLP single-lumen venous cannula (24F or 28F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Dobutamine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Electrode Polyhesive | Covidien | E7507 | |
| EOPA arterial cannula (17F or 21F) | This should be chosen at the investigators discretion. | ||
| Epinephrine | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Eppendorf Tubes, 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Gloves, nitrile, medium | Fischer | 27-058-52 | |
| Heparin 1000 IU/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Ketalean (Ketamine) inj. 100mg/ml, 50ml/vial | Health Canada | Requires health canada approval | |
| Lidocaine/Xylocaine 1% | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Magnesium Sulfate 5g/10ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Midazolam inj. USP 5mg/ml vial/10ml | Health Canada | Requires Health canada approval | |
| MPS Quest delivery disposable pack | Quest medical | 5001102-AS | |
| NACL 0.9% 1L | Baxter | JB1324 | |
| Organ Bag | CardioMed | 2990 | |
| Pipette Tips, 1 mL | Fisherbrand | 02-707-405 | |
| Propofol 1mg/ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Rocuronium | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Set Admin Prim NF PB W/Checkvalve | Smith Medical | 21-0442-25 | Intravenous infusion pump line. Researchers should choose infusion lines compatible with the infusion pump available at their facilities |
| Set Intro Sheath 8.5FRx 10CM | Arrow | SI-09880 | |
| Sofsilk 0 wax coated | Covidien | S316 | |
| Solumedrol 500mg/5ml | Purchased from institutional pharmacy | ||
| Suction tip | Covidien | 8888501023 | |
| Suction Tubing 1/4" x 120" | Med-Rx | 70-8120 | |
| Suture 5.0 Prolene BB | Ethicon | 8580H | |
| Suture Prolene Blum 4-0 SH 36 | Ethicon | 8521H | |
| Sutures 2.0 Prolene Blu M SH | Ethicon | 8523H | |
| Sutures BB 4.0 Prolene | Ethicon | 8881H | |
| Tracheal Tube, 6.5mm | Mallinckrodt | 86449 |
References
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-third Adult Heart Transplantation Report-2016; Focus Theme: Primary Diagnostic Indications for Transplant. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1158-1169 (2016).
- Lund, L. H., Edwards, L. B., et al. The Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation_ Thirty-first Official Adult Heart Transplant Report-2014; Focus Theme_ Retransplantation. The. Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 996-1008 (2014).
- Cosío Carmena, M. D. G., Gómez Bueno, M., et al. Primary graft failure after heart transplantation: characteristics in a contemporary cohort and performance of the RADIAL risk score. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 32 (12), 1187-1195 (2013).
- Fedak, P. W. M., Rao, V., et al. Combined endothelial and myocardial protection by endothelin antagonism enhances transplant allograft preservation. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129 (2), 407-415 (2005).
- Ramzy, D., Rao, V., et al. Cardiac allograft preservation using donor-shed blood supplemented with L-arginine. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 24 (10), 1665-1672 (2005).
- Rao, V., Feindel, C. M., Weisel, R. D., Boylen, P., Cohen, G. Donor blood perfusion improves myocardial recovery after heart transplantation. Journal of Heart and Lung Transplantation. 16 (6), 667-673 (1997).
- Wicomb, W. N., Cooper, D. K., Barnard, C. N. Twenty-four-hour preservation of the pig heart by a portable hypothermic perfusion system. Transplantation. 34 (5), 246-250 (1982).
- Badiwala, M. V., Ramzy, D., et al. Donor pretreatment with hypertonic saline attenuates primary allograft dysfunction: a pilot study in a porcine model. Circulation. 120, 11 Suppl 206-214 (2009).
- Ribeiro, R. V. P., Badiwala, M. V., Ramzy, D., Tumiati, L. C., Rao, V. Recipient Hypertonic Saline Infusion Prevents Cardiac Allograft Dysfunction. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. , (2018).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiments. (111), e53810 (2016).
- Ratschiller, T., Deutsch, M. -A., et al. Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Fukunaga, N., Bissoondath, V., Rao, V. Submandibular Gland-preserving Technique for Heterotopic Cervical Heart Transplantation in Mice. Transplantation. 1, (2018).
- Gong, W. Mouse Heterotopic Abdominal Heart Transplant Model. Rodent Transplant Medicine. , Chapter 11 107-118 (2014).
- Robinson, N., Souslian, L., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Dalmasso, A. P., Bianco, R. W. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 27 469-491 (2015).
- Bianco, R. W., Gallegos, R. P., Rivard, A. L., Voight, J., Dalmasso, A. P. Animal Models for Cardiac Research. Handbook of Cardiac Anatomy, Physiology, and Devices. , Chapter 25 393-410 (2009).
