Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Automatiserede målinger af søvn og bevægeapparatet aktivitet i mexicansk Cavefish

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59198
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

Denne protokol beskriver metoden til kvantificering af bevægeapparatet adfærd og sove i den mexicanske cavefish. Tidligere analyser er udvidet til at måle disse adfærdsmønstre hos socialt opstaldede fisk. Dette system kan anvendes bredt til at studere søvn og aktivitet i andre fiskearter.

Abstract

På tværs af phyla, er søvn kendetegnet ved stærkt bevarede adfærdsmæssige karakteristika, der omfatter forhøjede arousal tærskel, rebound efter søvnmangel og konsolideret perioder af adfærdsmæssige immobilitet. Den mexicanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), er en model til at studere træk evolution som reaktion på miljømæssige undertrykkelse af netbårne. A. mexicanus findes i eyed overflade-bolig former og flere blinde hulen-boligen befolkninger, der har robuste morfologiske og adfærdsmæssige forskelle. Søvn tab der er opstået i flere, selvstændigt udviklet cavefish populationer. Denne protokol beskriver en metode til kvantificering af søvn og bevægeapparatet aktivitet i A. mexicanus hule og overflade fisk. En omkostningseffektiv video aflytning ordning giver mulighed for adfærdsmæssige billeddannelse af individuelt opstaldede larve eller voksne fisk for perioder på en uge eller længere. Systemet kan anvendes til at fiske alderen 4 dage post befrugtning gennem voksenalderen. Metoden kan også tilpasses til at måle virkningerne af sociale interaktioner på søvn ved at optage flere fisk i en enkelt arena. Efter adfærdsmæssige optagelser og data er analyseret ved hjælp af automatiserede software til sporing og søvn analyse er behandlet ved hjælp af brugerdefinerede scripts, at kvantificere flere søvn variabler herunder varighed, bout længde og bout antallet. Dette system kan anvendes til foranstaltning søvn, døgnrytmen adfærd og bevægeapparatet aktivitet i næsten enhver fiskearter, herunder zebrafisk og hundestejler.

Introduction

Søvn er meget bevaret i hele dyreriget på fysiologiske, funktionelle og adfærdsmæssige niveauer1,2,3. Mens søvn i pattedyr forsøgsdyr vurderes typisk ved hjælp af electroencephalograms, elektrofysiologiske optagelser er mindre praktisk i lille genetisk medgørlige modelsystemer og dermed søvn måles typisk baseret på adfærd3 , 4. adfærdsmæssige karakteristika forbundet med søvn er meget bevaret i hele dyreriget og omfatter øget ophidselse tærskel, reversibilitet med stimulering og langvarig adfærdsmæssige ubevægelighed5. Disse foranstaltninger kan anvendes til at karakterisere søvn hos dyr lige fra den nematodeprøveudtagning orm, C. elegans, gennem mennesker6.

Brugen af adfærdsmæssige ubevægelighed at karakterisere søvn kræver automatiske tracking software. Med tracking software, perioder med aktivitet og immobilitet bestemmes over flere dage, og lange perioder med inaktivitet er klassificeret som sover7,8. I de seneste år, er flere tracking-systemer blevet udviklet for at erhverve aktivitetsdata blandt en mangfoldighed af små genetisk medgørlige modelsystemer; herunder orme, bananfluer og fisk9,10,11. Disse programmer er ledsaget af software, der giver mulighed for automatisk sporing af animalsk opførsel, herunder både open source freeware og kommercielt tilgængelige software7,12,13,14 . Disse systemer er forskellige i deres fleksibilitet og giver mulighed for effektiv screening og karakterisering af søvn fænotyper i talrige genetisk ændres modeller.

Genetiske undersøgelser af søvn i zebrafisk, Danio rerio, har ført til identifikation af mange gener og neurale kredsløb, der regulerer søvn15,16. Mens dette har givet et kraftfuldt system til undersøgelse af det neurale grundlag af søvn i en hvirveldyr laboratory animal, er langt mindre kendte om hvordan søvn udvikler sig og hvordan naturlige bidrager variation til at sove forordning. Den mexicanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), har udviklet sig dramatisk forskelle i søvn, bevægeapparatet aktivitet og døgnrytmen17,18. Disse fisk findes som eyed overflade fisk, der lever i floder i Mexico og det sydlige Texas og mindst 29 cave befolkninger rundt om regionen Sierra Del Abra nordøstlige Mexico19,20,21. Bemærkelsesværdigt, mange adfærdsmæssige forskelle, herunder søvn tab, synes at have opstået uafhængigt i flere cavefish populationer14,22. Derfor giver cavefish en model for at undersøge konvergent evolution af søvn, døgnrytmen, og social adfærd.

Denne protokol beskriver et system til måling af søvn og bevægeapparatet adfærd i A. mexicanus larver og voksne. Et specialbygget infrarød-baserede optagelse system giver mulighed for videooptagelse af dyr under lys og mørke. Kommercielt tilgængelige software kan bruges til at måle aktivitet og brugerdefinerede makroer bruges til at kvantificere flere aspekter af inaktivitet og bestemme perioder af søvn. Denne protokol beskriver også eksperimentelle ændringer til sporing af aktiviteten af flere dyr i en tank, giver mulighed for at undersøge interaktioner mellem søvn og social adfærd. Disse systemer kan anvendes til foranstaltning søvn, døgnrytmen adfærd og bevægeapparatet aktivitet i yderligere fiskearter, herunder zebrafisk og hundestejler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Oprette systemer for adfærdsmæssige tracking i larver og voksne.

1. konstruere en søvn System for larver

Bemærk: Overvågningssystem for tracking larve gennem ungfisk i alderen 4 dage post befrugtning (dpf) gennem 30 dpf A. mexicanus kræver flere stykker af udstyr, herunder infrarød (IR) belysning, akryl IR lys diffusorer, automatiseret lys kontrol (timere), computere, kameraer og sekundære materialer såsom ledninger og power controllers (figur 1A). Følgende instruktioner vil informere hvordan man opbygger et system til at spore nøjagtigt bevægeapparatet adfærd for at studere søvn og døgnrytme i larve A. mexicanus.

  1. Konstruere en Belysningssystemet består af IR og hvide lysdioder (LED): placere tre IR lys i en trekant ca 7,62 cm fra hinanden på en 30,5 cm x 30,5 cm tynd metal platform heatsink. Wire lys i serie med elektriske ledninger og tilsluttes en strømkilde.
  2. Sted en enkelt hvidt lys LED i midten af de tre IR lys og vedhæfte dem til strømkilden.
  3. Tilslut strømkilden for LED til en lys timeren indstillet til en standard døgnrytmen tid.
  4. Konstruere en platform for larver tracking system. Bruge 0,33 cm tykke hvide tegn akryl for alle komponenter af platformen.
  5. Placere optagelse platform ovenpå den tændte firkantede heatsink på hvilke arenaer vil opholde sig der indeholder fisk under adfærdsmæssige tracking.
  6. Placer en anden akryl inde i boksen mellem lys og dyr til diffuse IR for optimal belysning og kontrast.
    Bemærk:     dimensioner for larver lyskasse er som følger: to 18 cm x 8,5 cm og to 17 cm x 8,5 cm lysdioder, som er kemisk bundet sammen til at danne en 18 cm x 18 cm firkantet er 8,5 cm høj. Derudover, kan akryl være let, klippe eller boret ved hjælp af de rigtige værktøjer for tilpassede dimensionering.
    1. Placere hele larve tracking scenen og belysning setup inden for en lukket plastikrør, og derefter placere kameraet oven på rør.
      Bemærk: Det er vigtigt at holde belysning refleksioner fra opført på tracking video, da dette vil forringe tracking nøjagtighed. Placeringen af kameraer på toppen af et rør, der omgiver platform forbedrer belysning og skarphed til de kameraer, der anvendes til disse eksperimenter.
  7. Manipulere en webcam (Se Tabel af materialer) til IR-baserede optagelse. Fjerne producent linsen ved hjælp af en roterende værktøj (Se Tabel af materialer).
  8. Fjerne de lille sølv skruer på ryg sider af kameraet for at fjerne den indre bolig.
  9. Fjern de lille sorte skruer inde i kroppen af kameraet for at løsne den resterende del af linsen. Bruge en lille skruetrækker til at fjerne eventuelle dele af linse boliger, der er tilbage efter skæring linsen.
  10. Fjern blå LED på den øverste del af den opladede kombineret enhed (CCD) boliger.
  11. Sætte kameraet tilbage sammen ved at placere den indre boliger tilbage til sin oprindelige orientering og skrue de to sølv skruer tilbage til deres originale position.
  12. Ruten inde i kameraet ved hjælp af en lille så til at passe med en afrundet plast routing bit. Glat ned de ekstra plastik indtil det kan passe en linse adapter.
  13. Installere en IR-pass filter inde i kameraet så tæt på CCD som muligt uden at gøre direkte kontakt med kameraet.
    Bemærk: Passe på ikke for at beskadige CCD chippen i boliger af kameraet. Sørg for at holde snittet så plan som muligt. Seal eventuelle åbne rum mellem ydersiden af IR-filter og krop af kameraet for at holde lyset i at nå CCD uden at blive filtreret.
  14. Fastgøre kameraet til en 35 mm fast linse (Se Tabel af materialer) ved at skrue adapteren foran kameraet ind i bagsiden af linsen.
  15. Placere kameraet og objektivet i hullet boret ind i låg oven på røret, der huser den fase og lys og tillægger computeren dyrene vil blive optaget fra USB.
    Bemærk: Placer fisk i en opførsel værelse, der er adskilt fra hvor bestanden fisk er opstaldet for at sikre minimale forstyrrelser under adfærdsmæssige optagelser. Sørge for at minimere udsving i temperatur og ventilation, som kan forvirre adfærdsmæssige eksperimenter.

2. sove System for voksne

  1. Konstruere en IR belysningssystem til sporing af voksne fisk ved at skære IR strips til ca 46 cm mellemrum. En 46 cm strimler er tilstrækkelig for hver 10 L adfærd tank.
  2. Wire hver strimmel sammen i en serie, lodning hver strimmel til DC elektrisk ledning og tillægger en 9 V strømkilde.
  3. Tillægge en 51 cm x 5,1 cm stykke aluminium, der skal fungere som en køleplade hver IR strimmel.
  4. Placer en 46 cm x 5 cm, 0,32 cm tyk 9% lys-pass hvide tegn akryl ark direkte foran hver IR lys strimmel til diffuse IR lys.
  5. Placere alle tanke på et rack, der understøtter bagmonteret IR belysning.
  6. Brug uigennemsigtig plast dividers i 10 L glas tanke til at oprette individuelle arenaer.
    Bemærk: Arena størrelse kan varieres baseret på antallet delelinjer bruges og størrelsen af tanken. Arena størrelse påvirker bevægeapparatet aktivitet og søvn i hulen og overflade fisk23.
  7. Montere kameraer ca 4-6 m fra kampvogne. Hvert kamera kan typisk optage fra 3 tanke på et tidspunkt at give tilstrækkelig opløsning til sporing.
    Bemærk: Voksen adfærdsmæssige optagelser generelt kræver ikke en separat hvid belysningssystem til at styre dag-nat ændringer. Blot udnytter standard overhead lys i adfærdsmæssige værelse tilsluttet en timer er tilbøjelige til at være tilstrækkelig.

3. optagelse bevægeapparatet aktivitet

Bemærk: Alle adfærdsmæssige optagelser er lavet ved hjælp af en standard bærbar computer eller skrivebordet med et backup batteri kilde. På grund af den store filstørrelse af en 24-timers optagelse (60-100 GB), skal du gemme alle optagelser på eksterne harddiske.

  1. Acclimate fisk aldre 4-30 dpf for 18-24 timer inden indledningen optagelser. Fodre larver fisk med levende artemia når først placeret i salen, optagelse, og 1 time forud for begyndelsen optagelsen. Acclimate voksne fisk 4-5 dage før optagelse adfærd og feed én gang dagligt med flagefoder eller med levende blackworms.
    Bemærk: Sørg for at placere larve fisk i ferskvand inden optagelsen, som sidesten artemia vil medføre sporing spørgsmål under senere analyse. Co dyrkning med hjuldyr giver en alternativ mulighed, da deres lille størrelse ikke interfererer med tracking.
  2. Plads fisk i alderen 4-6 dpf i 24-godt vævskultur plader. House fisk i alderen 20-30 dpf i 12-godt vævskultur plader til optagelse.
  3. Optag voksne i 10 L tanke passer med skillevægge at rumme fem individuelt opstaldet fisk eller uden skillevægge at optage søvn og aktivitet i en social indstilling.
    Bemærk: Passe til at fokusere kameraet før indlede optagelsen for at maksimere tracking nøjagtighed. Kan ikke åbne iris af kameralinsen for langt, som det vil drastisk at reducere skarphed i billedet. Der er en balance, dog; Hvis iris er lukket for langt, vil frame rate af videoen falde under 15,00 fps. Det er afgørende for senere analyse, framerate forbliver 15,00 rammens per Sørensen til brug med nogle brugerdefinerede-skrevet søvn script23,24.
  4. Indstille belysning/lysstyrke baggrund illuminations.
  5. Optimere belysning inden start af optagelse. Altid holde kontrasten på højeste niveau muligt og bruge lysstyrke og Baggrund belysning til at justere lysstyrken, indtil dyrene er mest tydelig.
  6. Rekord fisk til 24 eller 48 timer.
    Bemærk: Nødsituation backup batteripakker, der alle belysning, computere og kameraer bør købes i tilfælde af strømudfald. Alle batterier bør også sættes i emergency power salgssteder, hvis det er muligt. Batteripakker vil generelt ikke power udstyr for mere end et par minutter til en time på de fleste og tjene til bro mellem mister vigtigste strøm og overføre til nødstrøm system.

4. analyse af bevægeapparatet aktivitet i individuelt opstaldet fisk ved hjælp af automatiseret tracking Software

  1. Til at begynde analyse af adfærd, åbne tracking software, vælge Nyt eksperiment fra skabelon, og vælg derefter anvende en Pre-Defined skabelon.
  2. Da programmet vil nu spørge hvilke arter styr, skal du vælge fisk. Brug dropdown boksen til at vælge enten Zebrafisk larver af Zebrafisk voksen afhængigt af den eksperimentelle paradigme.
  3. Konfigurer de arenaer, hvor hvert dyr vil blive sporet. Larver, vælge godt plade, runde godt og Ingen Zone skabelon. For voksne, bruges feltet åben, torvet Nr Zone skabelonen. Derefter bestemme det korrekte antal arenaer, en for hvert dyr, der spores i videoen.
  4. Vælg modellen for optimal sporing, skal du klikke på spor midtpunkt, og være sikker på, at den animalske farve er udvalgt til at være mørkere end baggrunden. Anvende den billedhastighed, hvor videoen blev erhvervet. Tracking software vil automatisk opdager indeværende.
  5. Tegne en skala for at kalibrere den virkelige afstand af et objekt til præcist bestemme bevægeapparatet opførsel af fisk ved hjælp af Arena indstillinger.
  6. Redigere arenaer for at sikre, at sporet hele området, at fiskene er i; ellers vil prøver blive tabt under erhvervelse.
    Bemærk: Vær forsigtig, når du opretter områder. Larve fisk er især følsomme over for tracking fejl, hvis arenaerne er enten for stor eller lille. Dårlig belysning i eksperimentet kan også skabe skygger på væggene i godt plader, som programmet kan synes er et dyr, at skabe en falsk positiv.
  7. Klik på Avanceret. Under metode i Påvisning indstilling, Vælg Dynamisk subtraktion, så klik på baggrunden og vælg Start læring. Justere mørk kontrast signal/støj forholdet, indtil dyrene spores godt, og baggrunden er ikke forårsager tracking til at springe.
    Bemærk: Video kvaliteten kan variere mellem eksperimenter, så hvert forsøg skal bruge forskellige indstillinger i overensstemmelse hermed. Ved hjælp af funktionerne Emne kontur og Emne størrelse kan forbedre sporing resultater.
  8. Vælg retssagen liste og indlæse de korrekte parametre før du begynder at optage data i programmet.
  9. Klik på fanen erhvervelse , vælge Spor alle planlagte forsøg og klik på knappen Optag.
  10. Under Analyse profil, Sørg for afstand og tid & bevægelse er valgt.
    Bemærk: I orden til senere søvn analyse er det kritisk, at disse indstillinger er korrekte, som .perl fil skal læse disse data i den rigtige rækkefølge for at beregne søvn.
  11. Under eksport, vælge Rå Data, eksportere data som Unicode-tekst.

5. sporing opstaldet socialt fisk

  1. Følg trin 4.1-4.4 at oprette eksperiment i tracking software.
  2. Vælg hvor mange dyr til at spore for eksperimentet i dropdown-menuen.
  3. I Arena indstillinger, trække den korrekte skala for at kalibrere den virkelige afstand.
  4. I indstillinger for registrering , bruge Dynamisk subtraktion, og justere den mørke kontrast for at bedst styr på dyr.
  5. Justere emne størrelse under indstillinger for registrering, således at kun en meget lille del af dyret er sporet.
    Bemærk: Ved at spore kun en lille del af dyret, vil dette reducere mængden af skifte mellem dyr, når de krydser stier under erhvervelse.
  6. Når sporene er erhvervet, bruge Track Editor hen til manuelt lave gange hvor fisk kan krydse stier.

6. udvinding af søvn Data fra bevægeapparatet aktivitet

Bemærk: Adfærdsmæssige definitionen af søvn i både larve og voksen A. mexicanus er 1 min eller mere af ubevægelighed. Denne definition var bestemmes ved hjælp af ophidselse tærskel eksperimenter, hvor en større sensorisk stimulus er forpligtet til at indlede en adfærdsmæssige reaktion i en sovende tilstand (> 60 s) i forhold til vågne14,17. For at tage hensyn til små bevægelser og drivende fælles til fiskearter, der er velocity tærskler anvendes til at adskille ægte bevægelse fra støj eller drift. Disse tærskler er beregningsteknisk afledte ved at sammenligne korrelationer mellem afstand og søvn varigheden til at finde de højeste R-kvadrerede værdier; derved bestemme den mest præcise hastighed for bevægelse og søvn. For larver fisk, de øvre og nedre grænser er både 12 mm/s så der er lidt at ingen drift. For voksne fisk er den nedre grænse 2 cm/s med en øvre grænse på 4 cm/s for at tage højde for afdrift.

  1. Installer Cygwin analyse computeren til at foretage henrettelsen af de brugerdefinerede-skrevet scripts til at udtrække bevægeapparatet og sove adfærd.
  2. Oprette et nyt eksperiment mappe i Cygwin hjem bibliotek.
  3. Importere de rå Unicode-data fra tracking software og udføre filen .sh i Cygwin konvertere kodning fra UTF-16 til UTF-8.
  4. Effektuere .perl fil i Cygwin at udtrække søvn data.
  5. Åbn filen makro og følg vejledningen i regnearket for at færdiggøre dataanalyse som ønsket.
    Bemærk: Et grundlæggende niveau kommandolinjen kodning vil være nødvendigt at gennemføre denne del af analysen. General Linux kommandoer vil være tilstrækkeligt. Hvis der er problemer med programmer læser data korrekt, kontrollere dataene fra tracking software i enhver frit tilgængelige teksteditor at sikre kodning og rækkefølge er korrekte for eksekverbare at skrive ordentligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larverne aldre 4-30 dpf pålideligt kan registreres i det brugerdefinerede-build lukkede system beskrevet i figur 1. Systemet omfatter både IR og synligt lys til at tillade registreringer under lys og mørke, under forskellige synlige lysforhold (figur 1A). Videoerne er derefter analyseret ved hjælp af sporingssoftware (figur 1BC) og efterfølgende behandles ved hjælp af en brugerdefineret søvn makro (Se Supplerende Download). Larve fisk fra tre uafhængige cavefish populationer vise en betydelig reduktion i søvn i forhold til overflade fisk (fig. 1 d) og 20 dpf, og denne søvn tab er konsistent på tværs af udviklingsstadier. Alder af fisk analyseret for søvn, er ofte afhængig af den eksperimentelle manipulation. For eksempel, spiser A. mexicanus ikke mad på 4 dage, så eksperimenter undersøger samspillet mellem søvn og fodring vil typisk forekomme i ældre larver25. Omvendt, morpholinos er kun effektiv i begyndelsen fry (typisk yngre end 4 dpf) så denne alder er brugt til æsler søvn24,26,27.

A. mexicanus kan leve i op til 30 år i laboratoriet, men eksperimenter ved hjælp af voksne udføres typisk i fisk i alderen 6 måneder til 3 år. Fisk kan registreres i en række tank størrelser afhængig af eksperimentet og IR belysning giver mulighed for optagelser i lys og mørke perioder (figur 2A). Enkelte arenaer er mærket i sporing for at give mulighed for sporing af fisk, og efterbehandling ved hjælp af en brugerdefineret makro indeholder en udlæsning af søvn (figur 2BC). Søvn er betydeligt reduceret i Pachón, Molino og Tinaja cavefish, i forhold til overflade fisk (figur 2D). Hertil kommer, dette system giver mulighed for optagelse flere fisk i en enkelt arena (typisk 10 gallon tanke), giver mulighed for analyse af hvordan sociale interaktioner påvirker søvn (figur 2EF). Socialt boligbyggeri håndfast reducerer søvn i overflade fisk, uden at det påvirker søvn i Pachón cavefish (fig. 2 g). Manglen effekt i cavefish skyldes sandsynligvis en kælder effekt, hvor cavefish sove lidt, især i de større arenaer bruges til at undersøge social adfærd.

Figure 1
Figur 1: Optagelse søvn opførsel i larver og ungfisk A. mexicanus. (A) skematisk af larve sleep behavior setup: larve er placeret på en platform i en lys-kontrollerede tube. Infrarød og hvide belysningssystemer sidde under fisk i bunden af røret. En IR-pass kameraet sidder i toppen af røret og er forbundet til en bærbar computer, hvor videoen er optaget. Alle drevne systemer (belysning og laptop) er sluttet til backup magt. (B) Arena indstillinger i tracking software. Enkelte larver er holdt i brønde i en vævskultur plade, og arenas (cyan) er lavet for hvert dyr. (C) bevægeapparatet spor af fisk bevægeapparatet adfærd efter at erhverve data i tracking software. Røde spor repræsenterer 10 s aktivitet i 20 - dage gamle fisk. (D) resulterende sove data fra tracking software. Juvenile cavefish konvergerer på reduceret søvn adfærd i forhold til overflade fisk morphs (One-way ANAVA F(3, 116) = 76.12; Dunnett post-hoc analyse blev anvendt til at sammenligne hver cavefish befolkning med overflade fisk, P < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Voksen A. mexicanus system for søvn og døgnrytmen adfærd. (A) Diagram af søvn-optagelse system: fisk holdes i tanke på et rack overfor af tracking kameraer. En infrarød belysningssystem er placeret bag akvarier, mens IR-pass kameraer er knyttet til en bærbar computer for registrering af adfærd. Alle powered systemer er tilsluttet til et backup batterisystem magt udsving. (B) Arena setup i tracking software. Enkelte fisk er markeret ved at oprette separate arenaer (cyan) for at spore bevægeapparatet adfærd. (C) repræsentative bevægeapparatet spor (rød linje) af enkelte fisk efter at erhverve en adfærdsmæssige optagelse på tracking software. Spor repræsenterer 20 s aktivitet. (D) samlede søvn varigheden over 24 h reduceres betydeligt i tre adskilte populationer af cavefish i forhold til overflade fisk (One-way ANAVA F(3, 106) = 52.66; Dunnett post-hoc test blev anvendt mellem overflade fisk og hver cave befolkning, P < 0,001). (E) A single tank indeholdende flere fisk som en arena (orange) er lavet til at spore sociale interaktioner og søvn. (F) bevægeapparatet spor af flere fisk efter dataopsamling i tracking software (hver farve repræsenterer et enkeltfisk). (G) repræsentative data af overflade og Pachón cavefish i sociale søvn sporing. Overflade fisk reducere søvn i 10 L tanke i forhold til 2 L arenaer; Overflade fisk søvn reduceres yderligere, når fisk er socialt opstaldet. Cavefish søvn ændres ikke væsentligt i enhver tilstand (tovejs ANAVA F(2,46) = 4.545; post hoc analyser blev udført i hver befolkning til at teste effekten af tank størrelse og sociale tilstand på samlede søvn 10 L single, P = 0.013; 10 L sociale, P = 0,0003). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en brugerdefineret system for kvantificering af søvn og bevægeapparatet aktivitet i larve og voksen cavefish. Cavefish er dukket op som en førende model til at studere udviklingen af søvn, der kan bruges til at undersøge den genetiske og neurale grundlag af søvn forordning1. De afgørende skridt i denne protokol omfatter optimering af belysning og video kvalitet for at sikre præcis sporing, er nødvendigt at kvantificere søvn. System for erhvervelse og analyse beskrevet her er fuldt funktionel, ligesom mange andre systemer, både kommercielle og specialbyggede, at kvantificere bevægelse og adfærd28,29,30. Tidligere analysen undersøger søvn i enkelt fisk kan udvides til også at give mulighed for analyse af opstaldes fisk. Et væsentlig aspekt når fejlfinding eller designe assays er den tilintetgør sociale adfærd kan have på en individuel søvn. For eksempel, aggression er fælles i Astyanax, og aggression niveauer er forskellige mellem overflade fisk og cavefish31. Optimere antallet af fisk, arena, og kønsfordelingen størrelse, vil for at minimere aggression muliggøre reproducerbar målinger af søvn forordning.

En begrænsning af teknikken, er som beskrevet, en manglende pålidelighed efter enkelte fisk i hele analysen. Automatiseret animalske tracking skifter ofte dyr, når de kommer i tæt kontakt. Dette kan løses ved omhyggelig optimering af tærskler, eller af manuelt korrigere eventuelle parametre. Derudover systemet beskrevet er ikke en gennemstrømnings-system, og derfor vandkvaliteten kan blive et problem efter optagelser varer mere end et par dage. Andre flow gennem systemer har været beskrevet i zebrafisk13 og disse let kunne anvendes til stald af mexicanske cavefish.

Den metode der beskrives er væsentlig på grund af dens bred anvendelighed til at måle adfærd i forskellige fiskearter. Søvn har endnu at være kendetegnet i næsten enhver marine eller frisk vand fisk, herunder hundestejler, cichlider og swordtails32,33,34. Alsidigheden af dette system til at måle sove i A. mexicanus og andre fisk modeller kan løse diverse spørgsmål om evolution og genetiske fundament af søvn. Den hardware, der er forbundet med dette system er meget omkostningseffektiv, hvilket gør det yderst tilgængelig og giver potentiale for høj overførselshastighed analyse af farmakologiske og ecotoxilogical analyse af søvn og bevægeapparatet aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSF award 1656574 til ACK. NIGMS award GM127872 ACK og NINDS award 105072 ERD og ACK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V power adaptor Environmental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Acrylic dividers (adults) TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Adult infrared light power source Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Battery pack CyberPower CP850PFCLCD
Camera lens (adult) Navitar Zoom 7000 Zoom 7000
Camera lens (larval) Fujian 35mm f/1.7 B01CHX7668 Purchase on Amazon
Camera lens adapter d 1524219
Camera mount CowboyStudio Super Clamp B002LV7X1K Purchase on Amazon
Fish tank Deep Blue Professional ADB11006
Heat sink (adult) M-D Building products SKU: 61085 Cut to fit
Heat sink (larval) M-D Building products SKU: 57000 Cut to fit
Infrared lights (adults) Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip irrf850-5050-60-reel Cut to fit
Infrared lights (larval) LED World B00MO9H7H4 Purchase on Amazon
IR-diffusing acrylic TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Laptop/computer N/A N/A Any laptop will work.
LED light Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) B06XKTRSP7 Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel
light timer Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded
Plastic wall mount for IR Everbilt Plastic pegboard Model # 17961
Power cable BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire B01K4RPE0Y
Power source Rapid LED MOONLIGHT DRIVER (350MA)
Tissue culture plates Fisherbrand 12-well (FB012928) 24-well (FB012929)
Tripod Ball head Demon DB-44 B00TQ54CZO Purchase on Amazon
USB Hardrive Seagate 3TB backup STDT3000100
USB Webcam Microsoft LifeCam Q2F-00014 Purchase on Amazon
Wall mount for camera LDR Industries 1/2" Steel pipe 307 12X36 Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
  2. Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
  3. Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
  4. Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
  5. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
  6. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  7. Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
  8. Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
  9. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  10. Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
  11. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  12. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
  13. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
  14. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
  15. Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
  16. Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  17. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
  18. Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
  19. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  20. Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  21. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  22. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
  23. Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
  24. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
  25. Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  26. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  27. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
  28. Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
  29. Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
  30. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
  31. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  32. Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
  33. Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
  34. Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).

Tags

Adfærd sag 145 cavefish tracking søvn social adfærd bevægeapparatet aktivitet konvergent evolution
Automatiserede målinger af søvn og bevægeapparatet aktivitet i mexicansk Cavefish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto,… More

Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (145), e59198, doi:10.3791/59198 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter