Summary
Bu iletişim kuralı Lokomotor davranış ve Meksika cavefish uykusunda miktarının için metodoloji ayrıntıları. Önceki analizlere bu davranışları sosyal yer alan balık ölçmek için genişletilir. Bu sistem uyku ve aktivite diğer balık türleri çalışmak için yaygın olarak uygulanabilir.
Abstract
Kültürlenebilen uyku yükseltilmiş uyarılma eşik dahil, Uyku yoksunluğu takip rebound ve davranışsal hareketsizlik dönemlerinde konsolide son derece korunmuş davranış özellikleri ile karakterizedir. Meksika cavefish Astyanax mexicanus (A. mexicanus), özelliği evrim çevre pertürbasyon karşılık olarak çalışmak için bir model var. A. mexicanus gözlü yüzey-konut formları ve sağlam morfolojik ve davranışsal farklılıklar içeren birden çok kör mağaralarda yaşayan nüfus olduğu gibi adlı biri yok. Uyku kaybı birden çok, cavefish bağımsız olarak gelişti nüfus oluştu. Bu iletişim kuralı için uyku ve yüzey balık ve A. mexicanus mağara Lokomotor aktivite miktarının bir metodoloji açıklar. Bir hafta veya daha uzun bir süre için ayrı ayrı muhafaza larva veya yetişkin balık davranış görüntüleme için uygun maliyetli bir video izleme sistemi sağlar. Sistem yaşında 4 gün sonrası döllenme yoluyla yetişkinliğe balık için uygulanabilir. Yaklaşım aynı zamanda tek bir alanda birden çok balık kaydederek sosyal etkileşimler uyku üzerinde etkileri ölçmek için adapte edilebilir. Davranış kayıtları, veri kullanarak izleme yazılımı otomatik analiz ve uyku analiz süresi, dersin uzunluğu ve dersin numarası da dahil olmak üzere birden çok uyku değişken ölçmek özel komut dosyaları kullanılarak işlenir. Bu sistem ölçü uyku, sirkadiyen davranış ve neredeyse herhangi bir balık türleri Zebra balığı ve takımıdır gibi Lokomotor aktivite için uygulanabilir.
Introduction
Uyku hayvanlar alemi, fonksiyonel, fizyolojik ve davranışsal düzeyleri1,2,3boyunca son derece korunmuş. Uyku memeli laboratuvar hayvanlarda genellikle electroencephalograms kullanarak değerlendirilir, Elektrofizyolojik kayıtlar küçük genetik olarak mükellef modeli sistemlerinde daha az pratik ve böylece uyku tipik olarak davranış3 üzerinde karşılaştırılmasıyla ölçülmüştür , 4. davranışsal özellikleri uyku ile ilişkili hayvanlar alemi son derece korunmuş ve artmış uyarılma eşik, uyarılma ve uzun süreli davranış sendika5ile reversibility dahil. Bu önlemlerin uyku sıra--dan belgili tanımlık yuvarlak kurt, C. elegans, ile insanlar6hayvanlarda karakterize etmek için kullanılabilir.
Uyku karakterize etmek için davranışsal sendika kullanımı otomatik izleme yazılımı gerektirir. Yazılım izleme, etkinlik ve hareketsizlik dönemleri birkaç gün üzerinden belirlenir ve uzun süre kullanılmadığında uyku7,8gibi sınıflandırılır. Son yıllarda, birden fazla izleme sistemi küçük genetik olarak mükellef model sistemleri bir çeşitlilik arasında etkinlik veri edinme için geliştirilmiştir; solucanlar, meyve sinekleri ve balık9,10,11de dahil olmak üzere. Bu programlar hayvan davranışları, açık kaynak ücretsiz ve ticari olarak mevcut yazılım7,12,13,14 dahil olmak üzere otomatik izleme için sağlayan yazılım eşlik eder . Bu sistemler ve onların esneklik farklı verimli tarama ve uyku fenotipleri çok sayıda genetik olarak iyileştirilebilir modellerinde karakterizasyonu için izin.
Zebra balığı, Danio rerio, uykusunda genetik incelenmesi çok sayıda gen ve uyku15,16düzenleyen sinir devreleri tanımlaması için açmıştır. Bu ise daha az omurgalı laboratuvar hayvanı uykusunda nöral temeli soruşturma için güçlü bir sistem olması koşuluyla nasıl uyku geliştikçe hakkında bilinen ve ne kadar doğal varyasyon yönetmelik uyku katkıda bulunmaktadır. Meksika cavefish, Astyanax mexicanus (a. mexicanus), uyku, Lokomotor aktivite ve sirkadiyen ritim17,18dramatik farklılıklar gelişmiştir. Sierra Del Abra bölgenin etrafında nüfus kuzeydoğu Meksika19,20,21gözlü yüzey balık Meksika ve Güney Teksas ve en az 29 nehirler yaşamaktadır mağara gibi balıkların adlı biri yok. Dikkat çekici, uyku kaybı, dahil olmak üzere birçok davranış farklılıkları bağımsız olarak birden çok cavefish nüfus14,22yılında çıkmıştır görünmektedir. Bu nedenle, cavefish, uyku, sirkadiyen ve sosyal davranışlar yakınsak evrim soruşturma için bir model sağlar.
Bu iletişim kuralı uyku ve aLokomotor davranış ölçmek için bir sistem açıklar. mexicanus larva ve yetişkinler. Aydınlık ve karanlık koşullarda hayvanların video kaydı için özel olarak oluşturulmuş kızılötesi tabanlı kayıt sistemi sağlar. Piyasada bulunan yazılım etkinliğini ölçmek için kullanılabilir ve özel makrolar hareketsizlik çeşitli yönlerini ölçmek ve uyku dönemleri belirlemek için kullanılır. Bu iletişim kuralı da uyku ve sosyal davranışlar arasındaki etkileşimler incelemek olanağı sağlayan bir tank içinde birden fazla hayvan etkinliğini izlemek için deneysel değişiklikleri açıklar. Bu sistemler ölçü uyku, sirkadiyen davranış ve Zebra balığı ve takımıdır dahil olmak üzere ek balık türlerinin Lokomotor aktivite için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: sistemleri larva ve yetişkin davranış takibi için ayarlayın.
1. larvalar için bir uyku sistemi oluşturmak
Not: Birden çok kızılötesi (IR) aydınlatma, akrilik IR ışık Difüzörler, dahil olmak üzere ekipman parçaları ışık otomatik izleme çocuksu balık yaşlı 4 gün sonrası döllenme (dpf) aracılığıyla 30 dpf A. mexicanus ile larva için izleme sistemi gerektirir denetimleri (zamanlayıcılar), bilgisayar, kamera ve kablolama ve güç denetleyicileri (şekil 1A) gibi ikincil malzemeler. Aşağıdaki yönergeler nasıl doğru bir şekilde uyku ve sirkadiyen ritim larva olarak çalışmaya Lokomotor davranışını izlemek için bir sistem kurmak için size bilgi verecektir A. mexicanus.
- IR ve beyaz ışık yayan diyot (LED) oluşan bir aydınlatma sistem inşa: 30,5 cm x 30,5 cm ince metal platformu soğutucu diğer her bir üçgen yaklaşık 7,62 cm üç IR ışık yerleştirin. Işıklar serisi ile elektrikli tel tel ve bir güç kaynağına bağlayın.
- Tek bir beyaz ışık LED üç IR ışık ortasına yerleştirin ve güç kaynağına ekleyebilirsiniz.
- Bir standart sirkadiyen ayarlanmış bir ışık çekim için LED için güç kaynağına bağlayın.
- Larva izleme sistemi için bir platform oluşturmak. 0,33 cm kalın beyaz işareti akrilik tüm platform bileşenleri için kullanın.
- Davranışsal izleme sırasında kayıt platformu üzerinde hangi alanlarda balık içeren ikamet edecek ışıklı kare soğutucu üzerine yerleştirin.
-
İkinci bir akrilik ışıklar ve IR optimum aydınlatma ve kontrast için diffüz hayvanlar arasında kutusu içine yerleştirin.
Not: larva ışık kutusu için boyutları ise şöyle: iki 18 cm x 8,5 cm ve iki 17 cm x 8,5 cm kimyasal olarak birlikte forma bir 18 cm x 18 cm bağlı LED kare yani 8,5 cm boyunda. Ayrıca, akrilik kolayca kesme veya delinmiş uygun araçları için özelleştirilmiş boyutlandırma kullanarak olabilir.- Bütün larva izleme sahne ve ışık Kurulum kapalı bir plastik tüp içinde yerleştirin ve sonra kameranın üst kısmında tüpü yerleştirin.
Not: Bu izleme doğruluğu zarar gibi izleme video görünmesini ışık yansımaları tutmak önemlidir. Kameralar platformu çevreleyen bir tüp üzerine yerleşimini aydınlatma ve netlik bu deneyler için kullanılan kameralar için geliştirir.
- Bütün larva izleme sahne ve ışık Kurulum kapalı bir plastik tüp içinde yerleştirin ve sonra kameranın üst kısmında tüpü yerleştirin.
- Bir web kamerası işlemek ( Tablo malzemelerigörmek) IR tabanlı kayıt için. Döner bir aracı kullanarak üretici objektif kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).
- İç konut kaldırmak için kameranın arka tarafta küçük gümüş vidayı çıkarın.
- Objektif geri kalanı gevşetmek için kamera gövdesi içinde küçük siyah vidayı çıkarın. Herhangi bir objektif kesim sonrası kalan lens konut bölümlerini kaldırmak için küçük bir tornavida kullanın.
- Şarj edilmiş üst kısmı üzerinde mavi LED kaldırma aygıt (CCD) Muhafazası birleştiğinde.
- Geri birlikte özgün yönünü geri iç konut yerleştirip özgün konumlarına geri iki gümüş vida vidalama kamerayı.
- Yuvarlak plastik yönlendirme ile biraz sığdırmak için rota küçük kullanarak kamera içini gördüm. Pürüzsüz bir lens adaptörü sığabilecek kadar ilave plastik aşağı.
- Fotoğraf makinesi ile doğrudan temas yapmadan CCD gibi mümkün olduğunca yakın kamera bünyesinde bir IR-pass filtre kurun.
Not: Fotoğraf makinesinin gövdesi içinde CCD çipi zarar vermemesi için dikkat ediniz. Kesme mümkün olduğunca düzey tuttuğunuzdan emin olun. Filtre uygulanan CCD ulaşan ışık tutmak için kamera gövdesi ve IR filtre dışında arasında boş bir alanı kapatın. - Kamera 35 mm sabit lens takmak ( Tablo malzemelerigörmek) adaptör kamera önünde lens arkasına vidalama tarafından.
- Kamera ve lens kapağı üstünde tepe-in belgili tanımlık sahne ve ışık evler tüp ayrıntılarına delik yerleştirin ve hayvanlar-ecek var olmak yazmak--dan bilgisayar USB ekleyin.
Not: Balık stok balık nerede en az kesintileri davranış kayıtları sırasında sağlamak yerleştirilmiştir üzerinden ayrı bir davranış Oda yerleştirin. Sıcaklık ve havalandırma hangi davranışsal deney yıkmak dalgalanmalar en aza indirmek için dikkat ediniz.
2. uyku sistemi yetişkinler için
- IR şeritler yaklaşık 46 cm aralıklarla keserek yetişkin balık izlemek için bir IR aydınlatma sistemi oluşturmak. Bir 46 cm şerit her 10 L davranış tank için yeterlidir.
- Her şerit birlikte bir dizi her şerit DC elektrik tel lehim, tel ve 9 V güç kaynağına takın.
- Her IR şerit soğutucu hareket edecek alüminyum 51 cm x 5,1 cm parçası takın.
- Bir 46 cm x 5 cm, 0,32 cm kalınlığında % 9 ışık taramalı beyaz işareti akrilik levha IR diffüz için doğrudan her IR ışık şerit önünde ışık yerleştirin.
- Tüm tankları arka monte IR aydınlatma destekleyen bir raf yerleştirin.
- Opak plastik bölücüler 10 L cam tanklarda bireysel alanlarda oluşturmak için kullanın.
Not: Arena boyutu kullanılan bölücülerin sayısını ve tank boyutu bağlı olarak farklı olabilir. Arena boyutu Lokomotor aktivite ve mağara ve yüzey balık23uyku etkiler. - Kameralar yaklaşık 4-6 m tankları uzak mount. Her kamera izleme için yeterli çözünürlük sağlamak için bir seferde 3 tank genellikle kaydedebilirsiniz.
Not: Yetişkin davranış kayıtları genellikle gündüz-gece değişiklikleri denetlemek için bir ayrı beyaz aydınlatma sistemi gerek yoktur. Sadece kullanmak için bir zamanlayıcı bağlı bir davranış odada standart genel gider ışıklar yeterli olması muhtemeldir.
3. kayıt Lokomotor aktivite
Not: Tüm davranış kayıtları bir standart dizüstü bilgisayar ya da okul sırası ile bir yedek pil kaynağı kullanılarak yapılır. 24 h (60-100 GB) kayıt büyük dosya büyüklüğü nedeniyle, dış sabit diskler üzerinde tüm kayıtları kaydedin.
- Balık yaşları 4-30 dpf kayıtları başlatmadan önce 18-24 h için alışmana. Canlı tuzlu su ilk kayıt odasında ve kayıt başlamadan önce 1 h yerleştirildiğinde karides ile larva balık yemi. 4-5 gün önce kayıt davranış yetişkin balık alışmana ve pul gıda veya canlı blackworms ile günde bir kez yem.
Not: Artık tuzlu karides daha sonra analiz sırasında izleme sorunları neden olur gibi tatlı su kayıt önce larva balık yerleştirdiğinizden emin olun. Onların küçük büyüklük izleme ile müdahale değil gibi Wrotek ile ortak kültür alternatif bir seçenek sağlar. - Yer balık 4-6 dpf 24-iyi doku kültürü tabak içinde yaşlı. House balık 12-iyi doku kültürü levha kayıt için 20-30 dpf yaşlı.
- 10 L tankları kayıt yetişkin beş ayrı ayrı ev Balık karşılamak için Bölücüler ile veya olmadan bölücüler kayıt uyku ve sosyal bir ortamda faaliyet için uygun.
Not: İzleme doğruluğu en üst düzeye çıkarmak için kayıt başlatma önce kamera odaklama için dikkat ediniz. Kamera objektifi gözü aç değil çok uzakta, bu büyük ölçüde görüntü keskinliğini azaltır. Ancak bir denge olduğunu; Iris çok ileri kapalıysa, video kare hızı 15.00 fps düşer. Kare hızı bazı uyku özel olarak yazılmış komut dosyası23,24ile 15.00 kare / s kullanım için kalır daha sonraki analizler için esastır. - Aydınlatma/parlaklık arka plan aydınlatma ayarlayın.
- Aydınlatma kayıt başlamadan önce en iyi duruma getirme. Her zaman kontrast olası en üst düzeyde tutmak ve en temiz hayvanlardır kadar parlaklığı ayarlamak için parlaklık ve Arka plan aydınlatma kullanın.
- Rekor balık için 24 veya 48 s.
Not: Aydınlatma, bilgisayar ve kameralar güç Acil yedek batarya bohça elektrik kesintileri durumunda satın. Tüm bataryaları da acil güç çıkışı, mümkünse takılmalıdır. Bataryaları genellikle değil en az bir saat için bir kaç dakikadan Geçitin güç ve ana güç kaybediyor ve acil durum güç sistemine transfer arasında köprü için hizmet vermektedir.
4. tek tek yer alan balık kullanarak izleme yazılımı otomatik Lokomotor aktivite analizi
- Davranış Analiz başlamak için yazılım izleme açın, Şablondan yeni denemeseçin, ardından Pre-Defined Şablonu Uygulaseçeneğini belirleyin.
- Program şimdi izlemek için ne tür sorar gibi balıkseçin. Zebra balığı yetişkin deneysel paradigma bağlı olarak her iki Zebra balığı larva seçmek için açılan kutuyu kullanın.
- Her hayvan izlenir arenalarda kadar ayarla. Larvalar için de plaka, yuvarlak iyi ve Hayır bölgesi şablonuseçin. Yetişkinler için Açık alan, Meydanı No bölgesi şablonuile kullanın. O zaman arenas, bir video izlenen her hayvan için uygun sayısını belirleyin.
- En uygun izleme için modelini seçin, tıkırtı üstünde Merkezi maddelik, takip ve hayvan renk arka plan daha koyu için seçili olduğundan emin olun. Hangi video satın alınmıştır kare hızı uygulayın. İzleme yazılımı bu otomatik olarak tanımalıdır.
- Doğru Arena ayarlarıkullanarak balık Lokomotor davranışını belirlemek için bir nesnenin gerçek mesafe ayarlamak için bir ölçek çizmek.
- İçinde balıklar tüm alanı izlenecek emin olmak için arenalarda düzenlemek; Aksi takdirde örnekleri Alım sırasında kaybolacaktır.
Not: Alanları ayarlarken dikkatli olun. Larva balık Eğer Arena ya çok büyük ya da küçük hataları izleme için özellikle duyarlıdır. Deneyinde kötü aydınlatma da program a yanlış mutlak oluşturma bir hayvandır düşünebilirsiniz iyi Kaplamalar, duvarlarda gölgeler oluşturabilirsiniz. - Gelişmiş' i tıklatın. Yöntemi Algılama ayarıaltında Dinamik çıkarma, sonra arka plan üzerinde tıklatın seçip Başlatmak öğrenme. Karanlık kontrast sinyal/noise oranı kadar hayvanlar de izlenir ve arka plan atlamak izleme neden olmuyor ayarlayın.
Not: Video kalitesi her farklı ayarlar, buna göre kullanmanız gerekebilir bu yüzden deneyler arasında değişebilir. Konu dağılımı ve Konu boyutu özelliklerini kullanarak izleme sonuçları önemli ölçüde artırabilir. - Deneme listesi seçin ve uygun parametreleri programa veri kaydetmeye başlamadan önce yükleyin.
- Alma sekmesini tıklatın, Parça tüm planlanan denemeler seçin ve ekrandaki Kaydet düğmesini tıklatın.
- Analiz profilaltında mesafe ve zaman ve hareket seçilir emin olun.
Not: Sırayla daha sonra uyku analiz, bu ayarlar doğru olduğu, .perl doğru sırada uyku hesaplamak için bu veri dosyasını okumak gerekir önemlidir. - İhracat, Ham veriseçin altında veri Unicode metin olarak dışa aktarma.
5. izleme sosyal balık muhafaza
- 4.1-4.4 izleme yazılımı deneyde kurmak için adımları izleyin.
- Kaç hayvan deneyi için takip için açılan menüden seçin.
- Arena ayarlarında, gerçek mesafe ayarlamak için doğru ölçek çizmek.
- Algılama ayarları, Dinamik çıkarmakullanın ve en iyi hayvan izlemek için karanlık karşıtlığı ayarlayın.
- Hayvan çok küçük bir bölümünü izlenir algılama ayarları altında konu boyutunu ayarlayın.
Not: Hayvan sadece küçük bir bölümünü takip ederek, bu satın alma sırasında yolları geçerken hayvanlar arasında geçiş miktarını azaltır. - Parça satın sonra Parça Editör nerede balık yolları çapraz kez el ile düzeltmek için kullanabilirsiniz.
6. Lokomotor aktivite uyumak veri çıkarımı
Not: Davranışsal larva ve yetişkin A. mexicanus uykusunda 1 dak veya daha fazla sendika tanımıdır. Bu tanım uyarılma eşik deneyler, nerede büyük bir duyusal uyarıcı bir davranışsal yanıt uyuyan bir devlet olarak başlatmak için gereken kullanarak tespit edilmiştir (> 60 s)14,17uyanma için karşılaştırıldığında. Küçük hareketleri ve ortak sürüklenen türler, orada balık hesabına hız eşikleri gürültü ya da drift gerçek hareketinden ayırmak için uygulanır. Bu eşikleri mesafe ve en yüksek R-kare değerlerini bulmak için uyku süresi arasındaki bağıntıları karşılaştırarak hesaplama açısından elde edilen; böylece hareket ve uyku için en doğru hız belirleme. Larva balık, üst ve alt sınırları her iki 12 mm/s olarak orada hiçbir drift için küçük. Yetişkin için alt sınırı 2 cm/sn ile 4 cm/s drift için hesap için bir üst sınır balıktır.
- Lokomotor ayıklamak ve davranış uyumak için özel olarak yazılmış komut dosyalarını yürütme taşımak için analiz bilgisayar için Cygwin yükleyin.
- Cygwin giriş dizini içinde yeni bir deneme klasör oluşturun.
- Yazılım izleme'den ham Unicode verileri alabilir ve UTF-16 UTF-8 kodlama dönüştürmek için Cygwin .sh dosya yürütmek.
- Uyumak veri ayıklamak için Cygwin içinde .perl dosyasını yürütün.
- Makro dosyasını açın ve istediğiniz gibi veri analizi tamamlamak üzere elektronik tablo içindeki yönergeleri izleyin.
Not: Komut satırı kodlama bir temel düzeyde analiz bu kısmını dışında taşımak için gerekli olacaktır. Genel Linux komutları yeterli olacaktır. Düzgün veri okuma programları ile ilgili sorunlar varsa, kodlama veri--dan takip yazılımı herhangi bir serbestçe kullanılabilir metin düzenleyicisinde emin olmak için denetleyin ve düzgün yazmak için yürütülebilir dosyaları için doğru emirdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Larva yaşları 4-30 dpf güvenilir bir şekilde kapalı şekil 1' de açıklanan özel yapı sistemindeki kaydedilebilir. Sistem IR ve görünür aydınlatma çeşitli koşullarda görünür ışık (şekil 1A), aydınlık ve karanlık koşullarda kayıtları için izin vermek için içerir. Videolar sonra izleme yazılımı (şekil 1BC) kullanılarak analiz ve özel uyku makro (bkz: Tamamlayıcı Download) kullanarak sonrası işlenen. Üç bağımsız cavefish nüfus larva balık yüzey balık (şekil 1 d) ve 20 dpf göre uyku belirgin bir şekilde azaltılmasına görüntülemek ve bu uyku kaybı gelişim dönemleri arasında tutarlıdır. Uyku için analiz balık sık sık üzerinde deneysel işleme bağımlı yaşıdır. Örneğin, A. mexicanus değil tüketmek yiyecek 4 gün, uyku ve beslenme arasındaki etkileşimler inceleyerek deneyleri genellikle büyük larva25içinde oluşacak bu yüzden. Tersine, bu nedenle bu yaş için kıçını uyku24,26,27kullanılmış morpholinos sadece erken fry (genellikle daha genç 4 dpf) etkili olur.
A. mexicanus laboratuvarda 30 yıla kadar yaşayabiliriz, ama yetişkin kullanarak deneyler genellikle 3 yıl için 6 ay yaşlı balık gerçekleştirilir. Balık tank boyutları deneme bağlı olarak çeşitli kaydedilebilir ve IR aydınlatma için kayıtlar açık ve koyu dönemlerde (şekil 2A) sağlar. Bireysel alanlarda balık izleme için izin vermek için izleme etiketlenir ve Post-işleme özel bir makro kullanarak uyku (şekil 2BC) bir okuma sağlar. Uyku yüzey balık (şekil 2B) göre Pachón, Molino ve Tinaja cavefish içinde önemli ölçüde azalır. Buna ek olarak, bu sistemi sağlar kayıt için nasıl sosyal etkileşimleri analiz için izin birden çok balık tek Arena (genellikle 10 galon tanklar), uyku (şekil 2EF) etkiler. Sosyal konut sağlam yüzey balık, uyku Pachón cavefish (Şekil 2 g) uykusunda etkilemeden azaltır. Cavefish yürürlükte eksikliği nerede cavefish az, özellikle sosyal davranış incelemek için kullanılan büyük arenalarda uyku Bodrum etkisi nedeniyle muhtemeldir.
Resim 1: Kayıt uyku davranış larva ve Juvenil A. mexicanus. (A)şematik larva uyku davranış Kurulum: Larva ışık kontrollü bir tüp içinde bir platformda yerleştirilir. Kızılötesi ve beyaz aydınlatma sistemleri tüpün dibinde balık aşağıda otur. IR taramalı kamera tüpü üst ve bağlı bir dizüstü üzerinde video kaydedilir. Tüm güç sistemleri (aydınlatma ve laptop) yedek güce bağlı. (B) Arena ayarları yazılım izleme. Bireysel larva Wells bir doku kültürü tabak içinde tutulur ve arenalarda (mavi) her hayvan için yapılır. (C) Balık Lokomotor davranış takip yazılımı verileri alınıyor sonra Lokomotor izleri. Kırmızı izler temsil 10 s 20 - gün eski balık faaliyete. (D) Resulting veri izleme yazılımı--dan uyumak. Juvenil cavefish yakınsama yüzey balık morphs için karşılaştırıldığında düşük uyku davranış üzerine (One-way ANOVA F(3, 116) 76.12; = Dunnett post-hoc analizi her cavefish popülasyon yüzey balık, P ile karşılaştırmak için uygulandığı < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Yetişkin A. mexicanus sistemi uyku ve sirkadiyen davranış. Uyku-kayıt sistemi(a)Diyagramı: balık tankları izleme kameraları bir raf üzerinde tutulur. IR taramalı kameralar davranış kayıt için bir dizüstü bilgisayar bağlı iken bir kızılötesi aydınlatma sistemi balık tank yer alıyor. Tüm güç sistemleri güç dalgalanmaları durumunda yedek batarya sistemi için takılı. (B) Arena kurulum izleme yazılımı. Bireysel balık Lokomotor davranışını izlemek için ayrı alanlarda (mavi) oluşturarak işaretlenir. (C) temsilcisi Lokomotor parça (kırmızı çizgiler) yazılım izleme davranış bir kayıt alınıyor sonra bireysel balık. Aktivite izleri temsil 20 s. (D) toplam uyku süresi 24 h üzerinden cavefish yüzey balığa göre üç ayrı nüfus önemli ölçüde azaltılmış (One-way ANOVA F(3, 106) 52.66; = Dunnett post-hoc testi uygulanan yüzey balık ve her mağara nüfus, P arasında < 0.001). (E) A tek tank içeren birden çok balık bir arena (turuncu) sosyal etkileşimler ve uyku izlemek için yapıldığı. (F) birden çok balık (her çizgi rengi temsil eden bireysel bir balık) yazılım izleme veri toplama sonra Lokomotor izleri. (G) temsilcisi veri yüzey ve sosyal uyku izleme Pachón cavefish. Yüzey balık uyku 10 L tankları 2 L arenalarda için karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltmak; Balık sosyal yerleştirilmiştir yüzey balık uyku daha da azalır. Cavefish uyku değil önemli ölçüde değişmiş herhangi bir durumda (Two-way ANOVA F(2,46) 4.545; = öğleden hoc çözümlemesi yapılan tank boyutu ve sosyal devlet toplam uyku 10 L tek, P üzerindeki etkisini test etmek için her nüfus içinde 0,013; 10 L sosyal, P = 0,0003 =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı uyku ve larva ve yetişkin cavefish Lokomotor aktivite miktarının için özel bir sistem açıklar. Cavefish uyku yönetmelik1genetik ve nöral temeli araştırmak için kullanılan uyku evrimi çalışmak için önde gelen bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu iletişim kuralı kritik adımlarda aydınlatma duruma getirilmesi ve video kalitesi doğru izleme sağlamak için uyku ölçmek için gerekli. Toplama ve burada açıklanan analiz sistemi tamamen işlevsel, birçok diğer sistemleri, ticari ve özel olarak oluşturulmuş, hareket ve davranış28,29,30ölçmek için olduğu gibi. Tek balık uykusunda inceleyerek önceki tahlil grubu yer alan balık analiz için izin vermek için genişletilebilir. Sorun veya tasarlarken deneyleri önemli unsurdur zihnimi karıştıran sosyal davranış bireyin uyku üzerinde sahip olabilir. Örneğin, saldırganlık Astyanaxiçinde yaygındır ve yüzey balık ve cavefish31saldırganlık düzeyleri farklıdır. En iyi duruma getirme balık sayısı, boyutu arena ve cinsiyet oranı, saldırganlık en aza indirmek için uyku yönetmelik tekrarlanabilir ölçümler için izin verir.
Bir teknik, açıklandığı gibi bireysel balık tahlil boyunca takip güvenilirlik eksikliği kısıtlamasıdır. Otomatik hayvan izleme yakın temas geldikleri zaman, hayvanlar kez geçiş yapar. Bu eşikleri dikkatli optimizasyonu veya el ile düzeltme herhangi bir anahtarları ele alınması. Buna ek olarak, açıklanan sistem akış yoluyla sistem değildir ve bu nedenle, su kalitesi daha--dan birkaç gün süren kayıtları sonra bir sorun haline gelebilir. Diğer akış sistemleri aracılığıyla Zebra balığı13 ' te açıklanan ve bunlar kolayca Meksika cavefish sty için uygulanabilir.
Açıklanan metodoloji çeşitli balık türlerinin davranışını ölçmek için onun geniş uygulanabilirliği nedeniyle önemlidir. Uyku takımıdır, çiklitleri ve kılıç kuyruklar32,33,34de dahil olmak üzere hemen hemen tüm deniz veya taze su balık karakterize edilebilir henüz. Uyku A. mexicanus ve diğer balık modelleri ölçmek için bu sistem çok yönlülük evrim ve uyku genetik temelleri hakkında çeşitli sorular adresi olabilir. Bu sistemi ile ilgili son derece uygun maliyetli, yüksek üretilen iş analizi farmakolojik ve uyku ve Lokomotor aktivite ecotoxilogical analizi için son derece erişilebilir ve sağlayan potansiyel yapma donanımdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.
Acknowledgments
Bu eser NIGMS Ödülü GM127872 ACK, NINDS Ödülü 105072 ERD ve ACK ve bildirim için NSF Ödülü 1656574 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
References
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J.
- Allada, R., Siegel, J. M.
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R.
- Gross, J. B.
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
