Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Automatisert målinger av søvn og Locomotor aktivitet i meksikansk Cavefish

Published: March 21, 2019 doi: 10.3791/59198
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2
1Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, 2Jupiter Life Science Initiative, Florida Atlantic University, 3Harriet L. Wilkes Honors College, Florida Atlantic University

Summary

Denne protokollen detaljer metodikken for kvantifisere locomotor atferd og sove i den meksikanske cavefish. Tidligere analyser er utvidet for å måle disse atferd i sosialt plassert fisk. Dette systemet kan bli mye brukt for å studere søvn og aktivitet i andre fiskearter.

Abstract

Over rekker, er søvn preget av høyt konservert atferdsmessige egenskaper som inkluderer opphøyet opphisselsen etterpå fulgte søvnmangel og konsolidert perioder atferdsmessige ubevegelighet. Den meksikanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), er en modell for å studere egenskap utviklingen svar på miljømessige forstyrrelsene. A. mexicanus finnes i eyed overflaten-bolig-skjemaer og flere blind hulen-bolig populasjoner med robust morfologiske og atferdsmessige forskjeller. Søvn tap oppstod flere uavhengig utviklet cavefish bestander. Denne protokollen beskriver en metode for kvantifisering søvn og locomotor aktivitet i A. mexicanus cave og overflate fisk. En kostnadseffektiv video overvåking systemet tillater atferdsmessige imaging individuelt huses larver eller voksen fisk for perioder på en uke eller lenger. Systemet kan brukes fiske alderen 4 dager innlegget befruktning til voksen alder. Tilnærming kan også tilpasses for å måle effekten av sosial interaksjon på søvn ved flere fisk i en enkelt arena. Etter atferdsmessige innspillinger, dataene er analysert ved hjelp av automatisert sporing og sove analyse er behandlet ved hjelp av tilpassede skript som kvantifisere flere søvn variabler inkludert varighet, bout lengde og kamp nummer. Dette systemet kan brukes å mål søvn, circadian atferd og locomotor aktivitet i nesten alle fiskearter inkludert sebrafisk og sticklebacks.

Introduction

Søvn er svært bevart i hele dyreriket på nivåene fysiologiske, funksjonelle og atferdsmessige1,2,3. Mens søvn i pattedyr forsøksdyr er vanligvis vurdert ved hjelp electroencephalograms, elektrofysiologiske opptak er mindre praktisk i små genetisk mottagelig modellsystemer og dermed sove er vanligvis målt basert på atferd3 , 4. atferdsmessige egenskaper tilknyttet søvn er svært bevart i hele dyreriket og inkluderer økt opphisselsen, Reversibilitet med stimulering og langvarig atferdsmessige gågaten5. Disse tiltakene kan brukes å karakterisere søvn i dyr fra Rundormer ormen, C. elegans, til mennesker6.

Automatisk sporing krever bruk av atferdsmessige gågaten å karakterisere søvn. Med sporingsprogrammer, aktivitet og ubevegelighet bestemmes over flere dager, og lange perioder med inaktivitet er klassifisert som sove7,8. De siste årene, er flere sporingssystemer utviklet for å skaffe aktivitetsdata mellom et mangfold av små genetisk mottagelig modellsystemer; inkludert ormer, frukt fluer og fisk9,10,11. Disse programmene er ledsaget av programvare som tillater automatisk sporing av dyr atferd, inkludert åpen kildekode freeware og kommersielt tilgjengelig programvare7,12,13,14 . Disse systemene varierer i deres fleksibilitet og muliggjør effektiv screening og karakterisering av søvn fenotyper i mange genetisk amendable modeller.

Genetisk undersøkelse av søvn i sebrafisk, Danio rerio, har ført til identifisering av mange gener og nevrale kretser som regulerer sove15,16. Mens dette har gitt et kraftig system for å undersøke nevrale grunnlaget for søvn i en virveldyr laboratorium dyr, mye mindre er kjent om hvordan søvn utvikler seg og hvordan naturlige bidrar variasjon til sove regulering. Den meksikanske cavefish, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), har utviklet seg dramatisk forskjeller i søvn, locomotor aktivitet og døgnrytme17,18. Disse fiskene finnes som eyed overflate fisk som bor i elvene i Mexico og sørlige Texas og minst 29 cave befolkninger regionen Sierra Del Abra nordøst Mexico19,20,21. Bemerkelsesverdig, mange atferdsdata forskjeller, inkludert søvn tap, synes å ha dukket opp uavhengig i flere cavefish bestander14,22. Derfor gir cavefish en modell for konvergent evolusjon av søvn, circadian, og sosiale atferd.

Denne protokollen beskriver et system for å måle søvn og locomotor atferd i. mexicanus larver og voksne. Spesialbygde infrarød-basert opptak systemet tillater for video opptak av dyr under lyse og mørke forhold. Kommersielt tilgjengelig programvare kan brukes til å måle aktivitet og egendefinerte makroer brukes å kvantifisere flere aspekter ved inaktivitet og bestemme perioder med søvn. Denne protokollen beskriver også eksperimentelle endringer for å spore aktiviteten til flere dyr i en tank, gir muligheten til å undersøke interaksjoner mellom søvn og atferd. Disse systemene kan brukes å mål søvn, circadian atferd og locomotor aktivitet i flere fiskearter inkludert sebrafisk og sticklebacks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Definere systemer for atferdsdata sporing i larver og voksne.

1. opprette en søvn System for larver

Merk: Overvåkingssystem for sporing larver gjennom juvenile fisk alderen 4 dager innlegget befruktning (dpf) gjennom 30 dpf A. mexicanus krever flere stykker av utstyr inkludert infrarød (IR) lys, akryl IR lys diffusers, automatisert lys Kontroller (tidtakere), datamaskiner, kameraer og andre materialer som ledninger og makt-kontrollere (figur 1A). Følgende instruksjoner vil informere om hvordan å bygge et system for å nøyaktig spore locomotor atferd for å studere søvn og biologiske rytmer i larver A. mexicanus.

  1. Konstruere en belysning IR og hvitt lys emitting dioder (LED): plassere tre IR lys i en trekant ca 7,62 cm fra hverandre på en 30,5 cm x 30,5 cm tynn metall plattform heatsink. Wire lys i serien med elektrisk ledning og koble til en strømkilde.
  2. Plasser et enkelt hvitt lys LED i midten av tre IR lys og knytte dem til strømkilden.
  3. Koble strømforsyningen til lampen til en lystimer satt til en standard circadian gang.
  4. Lage en plattform for larver sporingssystem. Bruk 0,33 cm tykk hvit tegn akryl for alle komponenter av plattformen.
  5. Plass opptak plattformen på tent kvadrat heatsink på hvilke arenaer med fisk vil ligge under atferdsmessige sporing.
  6. Plass en andre akryl inne boksen mellom lys og dyrene å spre IR for optimalt lys og kontrast.
    Merk:     dimensjonene for larver lyset boksen er som følger: to 18 cm x 8,5 cm og to 17 cm x 8,5 cm lysdioder som er kjemisk limt sammen for å danne en 18 cm x 18 cm firkantet som 8,5 cm høy. I tillegg kan akryl være lett kutt eller boret bruke de riktige verktøyene for egendefinert skalering.
    1. Plasser hele larver sporing scenen og belysning oppsett i en lukket plastrør, og deretter plassere kameraet på røret.
      Merk: Det er viktig å holde belysning refleksjoner vises på sporing video, som dette vil svekke sporing nøyaktighet. Plassering av kameraer på toppen av et rør som omgir plattform forbedrer belysning og skarphet for kameraene som brukes for disse eksperimentene.
  7. Manipulere webcam (se Tabell for materiale) for IR-baserte opptak. Fjerne produsenten linsen med et roterende verktøy (se Tabell for materiale).
  8. Fjern de små sølv skruene på baksiden sidene av kameraet å fjerne indre huset.
  9. Fjern de små svarte skruene inne i kroppen av kameraet for å løsne resten av linsen. Bruk en liten skrutrekker til å fjerne alle deler av linseholderen som er igjen etter klipping linsen.
  10. Fjern blå ledet på den øverste delen av den ladet kombinert enhetshus (CCD).
  11. Sette kameraet tilbake sammen ved å plassere indre huset tilbake til den opprinnelige retningen og skru de to sølv skruene tilbake til utgangsposisjonen.
  12. Ruten innsiden av kameraet med en liten så for å passe med en avrundet plast ruting bit. Jevne ned ekstra plast før det kan passe en linse-adapter.
  13. Installere en IR-pass filter inne kameraet så nær CCD som mulig uten å gjøre direkte kontakt med kameraet.
    Merk: Ta vare ikke for å skade CCD-brikken i huset av kameraet. Husk å holde kuttet som nivå som mulig. Sel noen åpne plassen mellom utsiden IR filter og kroppen av kameraet til å holde lys fra kommet med CCD uten filtreres.
  14. Feste kameraet til en 35 mm fast linse (se Tabell for materiale) Drei adapteren foran kameraet på baksiden av linsen.
  15. Plasser kameraet og objektivet i hullet boret inn i lokket på røret som huser scenen og lys og koble USB til datamaskinen dyrene registreres fra.
    Merk: Sett fisken i en oppførsel rom som er atskilt fra der lager fisk er plassert slik minimale forstyrrelser under atferdsmessige innspillinger. Ta vare for å minimere svingninger i temperatur og ventilasjon som kan forvirre atferdsmessige eksperimenter.

2. sove System for voksne

  1. Konstruere en IR-belysning for å spore voksne fisk ved å kutte IR strimler til ca 46 cm mellomrom. En 46 cm stripen er tilstrekkelig for hver 10 L atferd tank.
  2. Wire hver stripe sammen i en serie, lodding hver stripe til DC Elektrisk ledning og legge til 9 V strømkilden.
  3. Fest hver IR stripe en 51 cm x 5,1 cm stykke aluminium som skal fungere som en kjøleribbe.
  4. Plass et 46 cm x 5 cm, 0.32 cm tykk 9% lys-pass hvite tegn akryl ark rett foran hver IR lys stripe å spre IR lys.
  5. Plassere alle tanker på et stativ som støtter bakmontert IR belysning.
  6. Bruk ugjennomsiktig plast skillevegger 10 L glass stridsvogner for å opprette personlige arenaer.
    Merk: Arena størrelsen kan endres basert på antall skillevegger brukes og størrelsen på akvariet. Arena størrelse påvirker locomotor aktivitet og sove i hulen og overflate fisk23.
  7. Montere kameraer ca 4-6 meter fra tanker. Hvert kamera kan vanligvis ta opp fra 3 akvarier å gi tilstrekkelig løsning for sporing.
    Merk: Voksen atferdsmessige opptak generelt krever ikke en separat hvit belysning å kontrollere dag-natt endringer. Bare bruker standard overhead lys på atferdsdata rommet koblet til en tidtaker er sannsynlig å være tilstrekkelig.

3. Locomotor opptaksaktiviteten

Merk: Alle opptreden opptakene er gjort med en standard bærbar PC eller desktop med en backup-batterikilde. På grunn av det store arkiv størrelsen på en 24 timer opptak (60-100 GB), kan du lagre alle opptak på eksterne harddisker.

  1. Acclimate fisk aldre 4-30 dpf 18-24 h før starte opptak. Mate larver fisk med live saltlake reker når først plassert i innspillingen kammeret og 1 time før begynnelsen innspillingen. Acclimate voksne fisk 4-5 dager før innspillingen atferd og mate én gang daglig med flake næringen eller med live blackworms.
    Merk: Pass på å plassere larver fisk i ferskvann før opptak, da leftover saltlake reker vil forårsake oppfølging av problemer under senere analyse. Co dyrking med Wrotek gir et alternativ, som sin lille størrelse ikke forstyrrer sporing.
  2. Sted fisk i alderen 4-6 dpf i 24-og vev kultur plater. Huset fisk i alderen 20-30 dpf i 12-vel vev kultur plater for opptak.
  3. Registrere voksne i 10 L tanker passer med skillevegger for fem individuelt ligger fisk, eller uten skillevegger posten søvn og aktivitet i en sosial setting.
    Merk: Ta vare for å fokusere kameraet før starte innspillingen for å maksimere sporing nøyaktighet. Ikke åpne iris på kameraets objektiv for langt, da dette vil drastisk redusere skarpheten i bildet. Det er en balanse, imidlertid; Hvis iris er lukket for langt, vil bildefrekvensen for videoen falle under 15.00 fps. Det er viktig for senere analyse at rammehastigheten forblir 15.00 bilder per s for bruk med noen tilpasset skrevet sove skript23,24.
  4. Angi lys/lysstyrken bakgrunn illuminations.
  5. Optimalisere belysning før starten av innspillingen. Alltid holde kontrasten på høyeste nivå mulig og bruke lysstyrke og Bakgrunn lys justere lysstyrken til dyrene er mest tydelig.
  6. Rekord fisk for 24 eller 48 h.
    Merk: Nødsituasjonen sikkerhetskopien batteripakker som makten alle lys, datamaskiner, og kameraer skal kjøpes i tilfelle strømbrudd. Alle batterier bør også kobles til nødstrøm utsalgssteder, hvis mulig. Batteripakker vil vanligvis ikke makt utstyr for mer enn noen få minutter til en time på det meste og tjene til bro mellom mister strøm og overfører til nødstrøm systemet.

4. analyse av Locomotor aktivitet i individuelt huses fisk ved hjelp av automatisert sporing

  1. For å begynne analyse av atferd, åpne sporing, velg Nytt eksperiment fra malog velger Bruk Pre-Defined mal.
  2. Som programmet vil nå spørre hva arter å spore velge fisk. Bruk dropdown-boksen til å velge enten Sebrafisk larver av Sebrafisk voksen avhengig av eksperimentelle paradigmet.
  3. Definer arenaene der hvert dyr spores. For larvene, velger du vel Plate, runde godt og Ingen mal for sonen. For voksne, kan du bruke Åpne-feltet, torget med Ingen mal for sonen. Deretter bestemme riktig antall arenaer, en for hvert dyr i videoen.
  4. Velg modell for optimal sporing, klikk på spore midtpunkt, og sørg for at dyr fargen er valgt å være mørkere enn bakgrunnen. Bruke bildefrekvensen for videoen ble kjøpt. Sporing skal automatisk registrere dette.
  5. Tegne en skala for å kalibrere virkelige avstanden objektets å nøyaktig fastslå locomotor atferden til fisken med Arena innstillinger.
  6. Redigere arenaene sørge for at hele området som fisken i spores; ellers går prøver tapt under oppkjøpet.
    Merk: Vær forsiktig når du konfigurerer områder. Larver fisk er spesielt følsomme for sporing feil hvis arenaene er enten for stor eller liten. Dårlig belysning i eksperimentet kan også lage skygger på veggene i godt platene som programmet tror er et dyr, å skape en falsk positiv.
  7. Klikk på Avansert. Under metode i Gjenkjenningvelger Dynamisk subtraksjon, klikk på bakgrunnen og velg Starter læring. Justere mørke kontrast signal/støy-forhold til dyrene spores også, og bakgrunnen ikke forårsaker sporing hoppe.
    Merk: Videokvaliteten kan variere mellom eksperimenter, så hvert forsøk må bruke forskjellige innstillinger, tilsvarende. Bruke funksjonene Emnet kontur og Emne størrelse kan betydelig forbedre sporing av resultater.
  8. Velg prøve og belaste riktige parametere før du begynner å registrere data i programmet.
  9. Klikk i kategorien oppkjøpet , velger Spor alle planlagt forsøk og klikker på opptaksknappen.
  10. Kontroller avstand og tid og bevegelse er valgt under Analyse profil.
    Merk: For at senere søvn analyse er det avgjørende at disse innstillingene er riktige, som .perl må lese disse dataene i riktig rekkefølge for å beregne søvn.
  11. Under eksport Velg Rådata, eksportere dataene som Unicode-tekst.

5. sporing ligger sosialt fisk

  1. Fremgangsmåten 4.1-4.4 å konfigurere eksperimentet i sporingsprogramvare.
  2. I dropdown menyen velger du hvor mange dyr å spore eksperimentet.
  3. I Arena innstillinger, tegne riktig skalaen Kalibrer virkelige avstanden.
  4. I innstillinger for duplikatregistrering , bruke Dynamisk subtraksjonog justere mørke kontrasten for å spore beste dyret.
  5. Justere emnet størrelsen under innstillinger for duplikatregistrering, slik at bare en liten del av dyret spores.
    Merk: Ved å spore bare en liten del av dyret, vil dette redusere bytte mellom dyr når de krysser stier under oppkjøpet.
  6. Når sporene er ervervet, bruke Spor Editor å manuelt rette ganger hvor fisken kan krysse baner.

6. utvinning av søvnen Data fra Locomotor aktivitet

Merk: Atferdsmessige definisjonen av søvn i både larver og voksne A. mexicanus er 1 minutt eller mer av gågaten. Denne definisjonen ble bestemt bruker opphisselse terskelen eksperimenter, der en større sensoriske stimulans er nødvendig for å starte en behavioral respons i en sovende tilstand (> 60 s) sammenlignet med våkne14,17. Kontoen for små bevegelser og drivende vanlig fiske arter, det brukes hastighet terskler for å skille ekte bevegelse fra støy eller drift. Disse grensene er beregningsmessig-avledet ved å sammenligne sammenhenger mellom avstand og søvn varighet å finne høyeste R-kvadrerte verdien; dermed å finne den mest nøyaktige hastigheten for bevegelse og hvile. For larver fisk, øvre og nedre grensene er både 12 mm/s som det er liten eller ingen drift. For voksne fisk er den nedre grensen 2 cm/s med en øvre grense på 4 cm/s står for drift.

  1. Installere Cygwin analyse datamaskinen utføre gjennomføring av tilpasset skrevet skriptene locomotor og sove atferd.
  2. Opprette en ny eksperiment mappe i Cygwin startmappen.
  3. Importere Unicode rådata fra sporing og Kjør filen .sh i Cygwin konvertere koding fra UTF-16 til UTF-8.
  4. Kjør filen .perl i Cygwin trekke ut søvnen data.
  5. Åpne makrofilen og følg instruksjonene i regnearket for å fullføre dataanalyse som ønsket.
    Merk: Et grunnleggende nivå av kommandolinjeverktøyet koding vil være nødvendig å gjennomføre denne delen av analyse. General Linux kommandoer vil være nok. Hvis det er problemer med programmer lese dataene riktig, kontroller data fra sporing i alle fritt tilgjengelig teksteditor å forsikre koding og rekkefølgen er riktig for startbar å skrive ordentlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larvene aldre 4-30 dpf pålitelig kan registreres i skreddersy lukket system beskrevet i figur 1. Systemet omfatter både IR og synlig lys å tillate under en lys og mørke forhold, til under ulike synlig lys (figur 1A). Videoene er da analysert ved hjelp av sporingsprogramvare (figur 1BC) og post-behandlet ved hjelp av en egendefinert søvn makro (se Ekstra nedlasting). Larver fisk fra tre uavhengige cavefish bestander viser en betydelig reduksjon i søvn sammenlignet overflate fisk (figur 1 d) og 20 dpf, og sove tapet er konsistent gjennom utviklingsstadier. Alderen av fisk analysert for søvn er ofte avhengig av eksperimentelle manipulering. For eksempel forbruker A. mexicanus ikke mat på 4 dager, så eksperimenter undersøke interaksjoner mellom søvn og fôring ville oppstår vanligvis i eldre Larvene25. Derimot er morpholinos bare effektiv i tidlig yngel (typisk yngre enn 4 dpf) så denne alderen brukes til esler søvn24,26,27.

A. mexicanus kan leve opp til 30 år i laboratoriet, men eksperimenter ved hjelp av voksne er vanligvis utføres i fisk alderen 6 måneder til 3 år. Fisk kan registreres i ulike tanken størrelser avhengig av eksperimentet og IR belysning gir opptak i lyse og mørke perioder (figur 2A). Individuelle arenaer er merket i sporing for å tillate sporing av fisk, og etterbehandling med en egendefinert makro gir en presentasjon av søvn (figur 2BC). Søvn er betydelig redusert i Pachón og Molino Tinaja cavefish, sammenlignet med overflate fisk (figur 2D). I tillegg lar systemet for opptak flere fisk i en enkelt arena (vanligvis 10 gallon tanker), slik at analyse av hvordan sosiale interaksjoner påvirker søvn (figur 2EF). Sosiale boliger robust reduserer søvn i overflate fisk, uten at det påvirker søvn i Pachón cavefish (figur 2 g). Mangel på effekten i cavefish trolig på grunn av en kjeller effekt, hvor cavefish sove litt, spesielt i de større arenaene brukes til å undersøke sosial atferd.

Figure 1
Figur 1: Opptak søvn oppførsel i larver og juvenile A. mexicanus. (A) skjematisk av larver søvn atferd setup: Larven er plassert på en plattform i en lys-kontrollerte rør. Infrarød og hvit belysning systemer sitte under fisken på bunnen av røret. En IR-pass kameraet sitter på toppen av røret og er koblet til en bærbar PC som video registreres. Alle drevet systemer (belysning og bærbar PC) er koblet til strøm. (B) Arena for sporing. Individuelle Larvene holdes i brønner i en vev kultur plate og arenaer (cyan) opprettes for hvert dyr. (C) Locomotor spor av fisk locomotor virkemåte etter å skaffe dataene i sporing. Rød spor representerer 10 s aktivitet i 20 - dagers gammel fisk. (D) noe som resulterte sove data fra sporing. Juvenile cavefish sammen på redusert søvn atferd sammenlignet overflate fisk morphs (enveis ANOVA F(3, 116) = 76.12; Dunnett innlegg-hoc analyse ble brukt til å sammenligne hver cavefish befolkningen med overflate fisk, P < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Voksen A. mexicanus system for søvn og circadian atferd. (A) Diagram av søvn-opptak system: fisken holdes i tanker på et stativ midt imot å spore kameraer. En infrarød belysning er plassert bak fisken tank, mens IR-pass kameraer er knyttet til en bærbar PC for innspillingen atferd. Alle drevet systemer er koblet til et backup-batteri system ved spenningsvariasjoner. (B) Arena oppsett i sporing. Fisk er markert ved å opprette separate arenaer (cyan) for å spore locomotor atferd. (C) representant locomotor spor (røde linjer) av fisk etter å anskaffe en opptreden opptak på sporing. Spor representerer 20 s aktivitet. (D) Total søvn varighet over 24 h er betydelig redusert i tre forskjellige populasjoner av cavefish sammenlignet med overflate fisk (enveis ANOVA F(3, 106) = 52.66; Dunnett innlegg-hoc tester ble brukt mellom overflate fisk og hver hule befolkningen, P < 0,001). (E) A enkelt tank som inneholder flere fisk som en arena (oransje) er laget for å spore sosiale interaksjoner og søvn. (F) Locomotor spor av flere fisk etter datainnsamling i sporing (hver fargen representerer en fisk). (G) representant data overflate og Pachón cavefish i sosiale søvn sporing. Overflate fisk redusere søvn i 10 L tanker sammenlignet med 2 L arenaer; Overflate fisk sove er ytterligere redusert når fisk ligger sosialt. Cavefish søvn er ikke betydelig endret i enhver tilstand (toveis VARIANSANALYSE F(2,46) = 4.545; post hoc-analyse ble gjennomført innenfor hver befolkningen å teste effekten av tankstørrelse og sosiale tilstand på totalt sove 10 L singel, P = 0.013, 10 L sosiale, P = 0.0003). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver et egendefinert system for kvantifisere søvn og locomotor aktivitet i larver og voksne cavefish. Cavefish har dukket opp som en ledende modell for å studere utviklingen av søvn som kan brukes til å undersøke genetiske og nevrale grunnlaget for søvn regulering1. De avgjørende skritt i denne protokollen inkluderer optimalisering av belysning og video kvalitet for å sikre nøyaktig sporing som er nødvendig å kvantifisere søvn. Systemet for oppkjøp og analyse beskrevet her er fullt funksjonell, som mange andre systemer, både kommersielle og spesialbygde, å kvantifisere bevegelse og oppførsel28,29,30. Tidligere analysen undersøke søvn i enkelt fisk kan utvides for å gi analyse av gruppen plassert fisk. Et viktig aspekt når feilsøking eller designing analyser er det forundrer sosial atferd kan ha på søvnen til et individ. For eksempel aggresjon er vanlig i Astyanax, og aggresjon forskjellig mellom overflate fisk og cavefish31. Optimalisere antall fisk, størrelsen på arena, og sex ratio, vil for å minimere aggresjon tillate reproduserbar målinger av søvn.

En begrensning av teknikken, er som beskrevet, mangel på pålitelighet etter fisk hele analysen. Automatisert dyr sporing veksle ofte dyr når de kommer i nærkontakt. Dette kan løses ved forsiktig optimalisering av terskler, eller ved å manuelt rette eventuelle brytere. I tillegg systemet beskrevet er ikke en flyt gjennom systemet, og derfor vannkvalitet kan bli et problem etter opptak varer mer enn noen få dager. Andre gjennomstrømmingssystem er beskrevet i sebrafisk13 og dette lett kan brukes på svinesti av meksikanske cavefish.

Metodikk beskrevet er betydelig fordi brukbarheten bred å måle atferd i ulike fiskeslag. Søvn ennå å være preget i nesten alle marine eller ferskvann fisk inkludert Sticklebacks, Cichlids og swordtails32,33,34. Allsidigheten til dette systemet for å måle søvn i A. mexicanus og andre fisk modeller kan ta ulike spørsmål om utvikling og genetisk grunnlaget søvn. Maskinvaren forbundet med dette systemet er svært kostnadseffektiv, noe som gjør det svært tilgjengelig og gir potensial for høy gjennomstrømning analyse av farmakologiske og ecotoxilogical analyse av søvn og locomotor aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIGMS prisen GM127872 ACK, NINDS prisen 105072 ERD og ACK og NSF prisen 1656574 til bekreftelse

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 V power adaptor Environmental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Acrylic dividers (adults) TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Adult infrared light power source Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply
Battery pack CyberPower CP850PFCLCD
Camera lens (adult) Navitar Zoom 7000 Zoom 7000
Camera lens (larval) Fujian 35mm f/1.7 B01CHX7668 Purchase on Amazon
Camera lens adapter d 1524219
Camera mount CowboyStudio Super Clamp B002LV7X1K Purchase on Amazon
Fish tank Deep Blue Professional ADB11006
Heat sink (adult) M-D Building products SKU: 61085 Cut to fit
Heat sink (larval) M-D Building products SKU: 57000 Cut to fit
Infrared lights (adults) Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip irrf850-5050-60-reel Cut to fit
Infrared lights (larval) LED World B00MO9H7H4 Purchase on Amazon
IR-diffusing acrylic TAP Plastic Order sheets in sizes as needed
Laptop/computer N/A N/A Any laptop will work.
LED light Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) B06XKTRSP7 Use with Chanzon 25 pcs 1 W, 3 W, 5 W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel
light timer Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded
Plastic wall mount for IR Everbilt Plastic pegboard Model # 17961
Power cable BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire B01K4RPE0Y
Power source Rapid LED MOONLIGHT DRIVER (350MA)
Tissue culture plates Fisherbrand 12-well (FB012928) 24-well (FB012929)
Tripod Ball head Demon DB-44 B00TQ54CZO Purchase on Amazon
USB Hardrive Seagate 3TB backup STDT3000100
USB Webcam Microsoft LifeCam Q2F-00014 Purchase on Amazon
Wall mount for camera LDR Industries 1/2" Steel pipe 307 12X36 Mounted on wall with Flange and 90° pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
  2. Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
  3. Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
  4. Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
  5. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
  6. Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
  7. Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
  8. Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
  9. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  10. Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
  11. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  12. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
  13. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
  14. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
  15. Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
  16. Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  17. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
  18. Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
  19. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  20. Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
  21. Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
  22. Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
  23. Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
  24. Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
  25. Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
  26. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti,, Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  27. Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
  28. Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
  29. Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
  30. Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
  31. Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
  32. Bell, M. A., Foster, S. A. The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, Oxford University Press. Available from: http://books.google.com/books?hl=de&lr=&id=uxC0lN-Z3FIC&pgis=1 (1994).
  33. Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
  34. Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).

Tags

Atferd problemet 145 cavefish sporing søvn sosial atferd locomotor aktivitet konvergent evolusjon
Automatisert målinger av søvn og Locomotor aktivitet i meksikansk Cavefish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto,… More

Jaggard, J. B., Lloyd, E., Lopatto, A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Automated Measurements of Sleep and Locomotor Activity in Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (145), e59198, doi:10.3791/59198 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter