Summary
为了能够可靠地预测在体内环境中植入神经的聚合物底物的软化情况, 重要的是要有一个可靠的体外方法。本文介绍了动态力学分析在常温条件下磷酸盐缓冲盐水的应用。
Abstract
当使用动态软化基板的神经植入物, 重要的是要有一个可靠的体外方法来表征这些材料的软化行为。过去, 在模仿身体环境的条件下, 如果不付出巨大的努力, 就不可能令人满意地测量薄膜的软化程度。该出版物提出了一种新的简单方法, 允许在相关温度下对溶液中的聚合物进行动态力学分析 (dma), 例如磷酸盐缓冲盐水 (pbs)。环境 dma 的使用可以测量聚合物在各种介质和温度下由于塑化而产生的软化效果, 从而能够预测材料在体内条件下的行为。
Introduction
用于神经植入物基板的新一代材料包括软化形状记忆聚合物1、2、3、4、5、6、7 ,8,9。这些材料在植入过程中足够坚硬, 可以克服临界屈曲力, 但在身体环境中植入后, 它们会变得柔软三个数量级。据预测, 与钨或硅等神经植入物中使用的传统材料相比, 这些材料在模量中的不匹配减少, 从而显示出更好的设备-组织相互作用。传统的僵硬设备在植入后表现出炎症反应, 其次是组织包封和星形胶质细胞疤痕, 往往导致设备衰竭10,11。这是一个常见的假设, 不那么硬的设备最大限度地减少异物反应 12,13,14。设备的刚度取决于其横截面面积和模量。因此, 减少这两个因素以提高设备的合规性, 并最终改善设备组织相互作用, 这一点很重要。
软化聚合物的工作灵感来自 nguyen 等人15 的工作, 他们证明了机械合规的腔内植入物可以减少神经炎症反应。他们以前使用机械自适应聚醋酸酯/优化纤维素纳米晶 (tcnc) 纳米复合材料 (nc), 在植入后变得符合。
另一方面, voit 实验室使用的是硫醇烯和硫醇-烯-丙烯酸酯聚合物的高度可调谐系统。这些材料是有利的, 因为暴露在体内条件后的软化程度可以很容易地通过聚合物设计进行调整。通过选择合适的聚合物组成和交联密度, 可以修正聚合物的玻璃过渡温度和杨氏模量 2、4、5、6、8。软化的潜在效果是聚合物在水环境中的塑化。通过使玻璃转变温度 (tg) 高于体温 (植入过程中的状态) 的聚合物, 但在浸入水或 pbs 后低于体温, 由此产生的聚合物硬化模量可以从玻璃 (硬) 时干燥时转移到橡胶 (软) 时植入 16。
然而, 由于塑化和tg 从干燥状态向潮湿状态的转移而导致的软化的精确和可靠的测量在过去是无法测量的。传统的动态力学分析是在空气或惰性气体中进行的, 不允许测量溶液中聚合物的热力学特性。在以前的研究中, 聚合物在 pbs 中浸泡了不同的时间。然后用肿胀的样品进行动态力学分析 (dma)6,7,8。但是, 由于该过程涉及温度坡道, 样品在测量过程中开始干燥, 不会产生具有代表性的数据。如果样本量变小, 则尤其如此。为了预测神经探针的软化, 有必要对5至50μm 薄膜进行测试, 这在传统的 dma 中是不可能的, 因为在测量过程中对样品进行了上述干燥。
hess 等人 17设计了一台定制的微拉伸试验机, 使用环境控制的方法评估机械自适应材料的机械性能。他们以前在测量过程中使用喷枪系统在样品上喷水, 以防止它们干燥。
然而, 环境 dma (图 1) 的使用允许在不同温度下测量水和 pbs 等溶液中的聚合物薄膜。这不仅可以测量聚合物在肥皂软化状态下的热力学特性, 还可以测量其软化动力学。即使是拉伸试验和膨胀测量是可能的, 在这台机器的浸入浴内。这使得对塑化引起的聚合物基板软化的精确研究能够在体内预测行为。
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Protocol
1. 用于测试的聚合物样品的制备
- 根据以前的协议, 在烟罩内合成软化的硫醇烯聚合物。1,2,4 个,18简单地说, 将硫醇的定量量与烯烃单体混合, 总剂量为 0.1 wt% 的光引发剂。
- 准备一个20毫升的玻璃小瓶进行聚合物混合。将小瓶盖在铝箔中, 以防止入射光接触单体溶液, 并保持在室温 (rt)。使用收到的所有化学物质, 无需进一步纯化。
- 对于完全软化聚合物, 加入 50 mol% 1, 3, 5-三烯丙基-1, 3, 5-三嗪-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮 (tatto), 45 mol% 三甲基丙烷 tris(3-丙酸) (tmtmp), 和5摩尔% Tris[2-(3-丙基丙基) 乙基] 异氰尿酸 (tmicn) 到用一次性塑料移液器覆盖小瓶。
- 在聚合物溶液中加入 0.1 wt% 的光异丙基酮 2, 2-二甲氧基苯乙酮 (dmpa)。
- 通过行星速度混合将小瓶内的内容物彻底混合, 而不会将溶液暴露在光线下。
注: 聚合物溶液对光敏感, 即使用铝箔覆盖, 也会在45至60分钟后开始聚合。因此, 混合后尽快使用聚合物溶液。
- 根据自旋曲线, 将第1.1 节制备的聚合物溶液涂覆为厚度在5至50μm 之间的薄膜, 作为载体基板 (图 2)。对于30μm 薄膜厚度, 以600转/分旋转30秒。
注: 使用不同的 smp 配方时, 自旋速度和时间可能因聚合物溶液的粘度而异。 - 纺丝后, 立即将聚合物薄膜转移到载体基板上。在120°c 的真空烘箱中, 将薄膜聚合60分钟至365纳米紫外线灯泡下 60分钟, 并在真空中固化 24小时, 以进一步完成转换。
- 将固化后的聚合物薄膜切割成矩形样品, 宽度为 4.5 mm, 长度为 50 mm, 用于 dma 测试。厚度可能从5到50μm 不等。使用两种不同的方法 (选择步骤1.4.1 或 1.4.2), 可以将样品引入测量几何。
- 使用 co2 激光将固化后的聚合物薄膜切割成矩形。将 co2激光微加工参数设置为5.0% 功率 (2.0 w) 和10.0 速度 (0.254 m\ s) (图 3a)。
- 在10000类洁净室设施中使用光刻技术定义 dma 样品 (图 3b)。使用玻璃或晶圆基板作为洁净室中的起始基板。
- 将低温氮化硅沉积在一起, 作为以下等离子蚀刻过程的硬膜。使用标准光刻技术对设备的外线形状进行图案设计。使用 sf6 和 o2 等离子体的等离子蚀刻器分别去除硬掩模和 smp 层.
- smp 层被等离子蚀刻到玻璃滑片上后, 用稀释的 10:1 hf 浸渍将剩余的氮化硅硬膜蚀刻掉。
- 最后一步, 通过在去离子水中浸泡, 从玻璃滑片中删除测试装置。
2. 机器设置
- 使用带浸入系统的动态机械分析仪 (dma)。在张力模式下为机器配备浸入式夹具 (图 1)。将液氮连接到机器上, 使 ln2/空气成为熔炉的气源。
- 用机器软件编写干测量方法, 包括以下三个步骤: 调理、振荡温度坡道和调理端的测试, 然后设置参数, 如下所示:
- 设置以下参数的调节选项: 模式 = 活动, 选择 "张力", 轴向力 = 0.05 n, 设置初始值为 "开", 灵敏度 = 0.0 n, 比例力模式 = 力跟踪, 补偿模量 = 上, 选择 "轴向力", 然后设置动态力达到 25.0, 最小轴向力 = 0.05 n, 编程延长线低于 0.0 pa, 启用模式, 应变调整 = 0.05%, 最小应变 = 0.1%, 最大应变 = 0.5%, 最小力 = 0.05 n, 最大力 = 0.2 n。
- 设置以下参数的振荡温度坡道: 启动温度 = 10°c, 继承设定点 = 关, 浸泡时间 = 0.0 s, 等待温度 =, 坡度速率 = 2.0°cp min, 结束温度 = 100°c, 浸泡后的时间 = 0.0 s, 采样率 = 1 pts\ s, strain% = 0.275%, 单点, 频率 = 1 hz。
- 为测试的调理端设置以下参数: 环境控制 = 关闭, 轴向力调整 = 打开, 模式禁用, 传感器/电机 = 关闭。
- 用机器软件编写浸入式测试的方法, 包括以下四个步骤: 调理、振荡时间、振荡温度坡道和测试的条件结束, 然后按如下方式设置参数:
- 设置以下参数的调节选项: 模式 = 活动, 选择 "张力", 轴向力 = 0.05 n, 设置初始值为 "开", 灵敏度 = 0.0 n, 比例力模式 = 力跟踪, 补偿模量 = 上, 选择 "轴向力" 和设置动态力达到 25.0, 最小轴向力 = 0.05 n, 编程延长线低于 0.0 pa, 启用模式, 应变调整 = 0.05%, 最小应变 = 0.1%, 最大应变 = 0.5%, 最小力 = 0.05 n, 最大力 = 0.2 n。
- 为振荡时间设置以下参数: 温度 = 39.5°c, 继承设定点 = 关, 浸泡时间 = 0.0 s, 等待温度 = 关闭, 持续时间 = 3600.0 s, 采样率 = 1 pts\, 应变% = 0.275%, 单点, 频率 = 1 hz。
- 为振荡温度坡道设置以下参数: 启动温度 = 10°c, 继承设定点 = 关, 浸泡时间 = 300.0 s, 等待温度 = 关, 坡度速率 = 2.0°c/min, 结束温度 = 85°c, 坡道后浸泡时间 = 300.0 s, 采样率 = 1 pts/s s, s火车% = 0.275%, 单点, 频率 = 1 hz。
- 为测试的调理端设置以下参数: 环境控制 = 关闭, 轴向力调整 = 打开, 模式禁用, 传感器/电机 = 关闭。
3.用于干式测量的样品装载和卸载
- 使用精度为 0.001 mm 的卡尺测量聚合物试样的实际厚度, 以便进行干燥 (空气中) 测试。
- 在软件中输入示例名称、说明和示例几何。
- 将加载间隙设置为15毫米, 然后加载样品。请确保在夹具拧紧夹紧之前将试样居中和对齐, 或使用扭矩扳手, 并使用 0.1 n (图 3c)。
- 关闭熔炉, 并使用第2.2 节所述的方法开始测量。
- 等待, 直到测量结束。打开熔炉, 从机器中取出聚合物样品。
4. 用于浸入式测试的样品装卸
- 测量聚合物试样的实际厚度, 以便使用 0.001 mm 精度的卡尺在 pbs 中进行浸没试验。
- 在软件中输入示例名称、说明和示例几何。
- 准备设置与浸入式烧杯固定与夹具在上部抓地力 (图 4a, b)。
- 将加载间隙设置为 15 mm 并加载样品 (图 4c)。在夹具拧紧夹紧之前, 请确保将试样居中和对齐 (图 5), 或使用 0.1 n 的扭矩扳手。
- 将浸入式浴缸放在底部夹具上, 拧紧 (图 4d)。用 rt pbs 填充浴缸 (图 4e), 将盖子放在顶部 (图 4E), 关闭炉 (图 4E), 然后立即使用第2.3 节所述的方法开始测量。确保排水沟已关闭 (图 4h)。
- 等待, 直到测量结束。使用排水沟将 pbs 从浸入式浴池中取出。打开炉内, 从烧杯上取下盖子, 拧下浸入式烧杯, 提起, 然后从机器中取出聚合物样品。
- 用脱铁水清洁夹子和浸没烧杯, 从 pbs 中去除任何剩余的盐。
5. 测量
- 在没有浸入式烧杯的情况下测量空气中的聚合物。按照第3节所述的样品装载和卸载说明进行操作。重复此测量至少 3倍, 以收集具有统计相关性的结果。
- 按照第4节所述步骤测量浸入式浴池内的聚合物。重复测量至少 3倍, 以收集具有统计相关性的结果。
6. 数据解释
- 打开机器软件中的结果选项卡, 在该选项卡中, 原始数据可以以表格格式查看或绘制为图形。
- 绘制第一部分的浸入测量, 振荡时间测量, 作为存储模量随着时间的推移来评估软化动力学。该曲线显示了聚合物的模量在浸入 pbs 时随着时间的推移而降低的速度。
- 记下模数水平的时间。这代表了在生理条件下软化的时间。
- 如果聚合物在设定浸泡时间为1小时后未完全软化, 请在增加浸渍时间的情况下重复测量。
- 将空气和 pbs 测量值的振荡-温度坡道显示为左轴上的存储模量, 在右轴上的晒黑三角洲在温度上显示聚合物在 (干燥) 和之后 (在 pbs 中) 塑化的热力学特性.
- 将干燥 (空气) 和 pbs 测量的数据绘制在一起, 以更好地显示由于塑化而导致的热机械性能变化。
- 请注意干燥材料在25°c 时的储存模量和在37°c 时浸渍的样品的储存模量, 因为这些是评估聚合物在植入过程中软化程度的相关数字。
- 注意干样品和浸渍样品之间的晒黑三角洲峰的变化。
- 将数据导出为. txt 或. csv 文件, 以便进一步解释数据并与其他软件进行绘图。
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Representative Results
通过使用环境 dma, 可以分析聚合物的软化动力学和整体软化能力。通过使用协议的温度时间测量模式, 可以比较不同聚合物配方的软化分布 (图 6)。这种方法也可用于量化聚合物的软化和膨胀速率。图4可以看出, 不同的聚合物配方在浸入 37°c pbs 时可能会经历不同程度的软化。非软化版本仍在 gpa 范围内, 而半软化聚合物软化从 1700 mpa 到 370 mpa, 完全软化聚合物到 40 mpa。所有三种聚合物配方的软化时间均在10至15分钟内。
通过在 pbs 中使用干 dma 测量和测量相结合, 可以评估不同聚合物配方的水引起的塑化, 这表现在tg 的凹陷和模量的整体下降曲线 (图 7)。当干聚合物的tg 高于体温, 但低于潮湿状态下的温度时, 聚合物的软化效果最为有效。因此, 聚合物的模量在生理条件下浸泡时从玻璃模量下降到橡胶模量 (图 7a)。当聚合物的干态和湿态的t g 都远远高于体温时, 聚合物在生理条件下不会变软 (图 7b)。
图 1: 带浸入式系统的环境 dma.(a) 更详细地查看干燥 (b) 和湿 (c) 测量条件下的夹具。(b) 和 (c) 以前由 ecker 等人2出版.请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 完全软化硫醇-烯聚合物的自旋曲线.用于完全软化硫醇-烯聚合物的自旋曲线, 显示自旋速度和时间与由此产生的薄膜厚度之间的关系。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在微观玻璃滑梯上制备 dma 测试条纹.利用光刻技术在微观玻璃幻灯片 (a) 或硅片 (b) 上制备 dma 测试条纹。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 浸入式浴缸测量用样品加载.a () dma 配备浸入夹具, (b) 浸入式烧杯在上夹具周围临时固定, (c) 在夹紧距离为15毫米的情况下加载聚合物样品, (d) 将浸入式烧杯降低到下部夹具,用螺钉固定, (e) 用 pbs 填充浸入式烧杯, (f) 关闭盖子, (g) 关闭炉, (h) 确保排水口关闭。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 样品的对齐.(a) 样品必须是直的, 并在顶部和底部夹具之间居中。样品不应该是对角线 (b), 过高或过低 (c), 或对边缘 (d) 太多。样品也不应该扣 (e), 但应该是直的 (f), 以确保可靠的测量。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 三种不同硫醇烯聚合物的软化动力学.在37°c 的 pbs 内, 用振荡时间协议在13°c 下测量三种不同的硫醇烯聚合物的软化动力学, 时间为1小时. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 7: 显示两种不同 smp 配方的 dma 测量值.显示两种不同 smp 配方在 pbs 中浸泡前 (橙色) 和 (蓝色) 后的 dma 测量值。(a) smp 的完全软化 (fs) 版本和 (b) 略显软化版本 (ss)。这一数字已从 ecker 等人2中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
通过使用环境 dma, 可以研究在溶液中用作神经植入19或其他生物医学设备的底物的各种聚合物的行为, 并在体内模拟条件。这包括但不限于聚酰亚胺、乙烯基-c、pdms 和 su-8。利用该方法还可以研究氢凝胶和细胞外基质 (ecm) 材料。聚合物整体软化的差异及其软化动力学可以很容易地比较不同溶液之间的差异, 包括水、重水和 pbs。也可以测试不同的浸入温度或不同聚合物厚度和成分所产生的差异的影响。
这种方法还可以研究各种处理对聚合物和水凝胶软化行为的影响。处理方法包括应用各种灭菌方法、在各种介质中加速老化和表面改性。这种体外方法将帮助研究人员了解这些材料的行为和耐久性, 获得可靠的体外测量, 并避免不必要的动物实验。然而, 在 pbs 中进行测量只是模拟生物环境的一种方法。体内条件在许多方面可能有所不同, 如离子浓度和生物媒体组织内抗体、蛋白质和其他物种的可用性。根据目标区域的不同, 实验者还可以考虑使用不同的介质进行环境测量, 如三缓冲盐水 (tbs)、tbs-t (tbs 与聚山梨酸盐 20)、牛血清白蛋白 (bsa)、脑脊液 (csf) 和其他身体。流体。
此外,在体内研究完成后, 在对动物进行解释后, 还可以对探针的机械性能进行表征。这将允许研究在身体环境中软化后的探针行为, 并与体外数据进行比较。
需要注意的是, 溶液浴的温度设置与实际温度之间存在偏移。这是因为正在使用两个不同的温度控制器: 一个用于温度控制 (浸入式浴缸外), 另一个用于测量温度 (浸入式浴缸内)。我们发现, 当外部温度设定为39.5°c 时, 浴池内的温度稳定在37°c。
溶液内部测量的温度范围自然受到其结晶和沸腾温度的限制。建议在这些温度以上和以下分别保持至少 10 k。
研究了用于浸泡软化测量的浸渍溶液的起始温度是室温还是预热至体温, 以最好地模拟探头植入过程中的条件。rt pbs 的使用考虑到了这样一个事实, 即探头在植入前被保留在 rt 上, 并且通常在与植入侧对齐时保持在靠近的位置。在这个阶段, 由于潮湿的环境, 探头可能已经开始软化。从37°c 开始, pbs 将更好地模仿猎枪插入方法。
在张力模式下对聚合物薄膜进行了测量;然而, 在使用相应的夹具时, 环境 dma 也能够测量压缩和剪切。因此, 这也允许测量其他样品几何形状。需要注意的是, 浸入式烧杯内的可用空间是有限的, 因此用于测量的样品在这个烧杯内受到其大小的限制。
这种方法的另一个局限性是称重传感器, 它用于检测样品在测量过程中产生的力 (在干燥和潮湿条件下)。称重传感器只能测量高达 35 n 的力, 因此限制了样本大小几何。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者要感谢泰勒·瓦雷博士允许我们使用他的环境 dma。
这项工作得到了主管卫生事务助理部长办公室通过同行评审医学研究方案 [W81XWH-007] 提供的支持。意见、解释、结论和建议是作者的意见、解释、结论和建议, 不一定得到国防部的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,3,5-Triallyl-1,3,5-triazine-2,4,6(1H,3H,5H)-trione (TATATO) | Sigma-Aldrich | 114235-100G | |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA) | Sigma-Aldrich | 196118-50G | |
| CO2 laser Gravograph LS100 | Gravotech, Inc. | ||
| Corning Large Glass Microscope Slides, 75 x 50mm | Ted Pella | 26005 | |
| Environmental DMA: RSA-G2 Solids Analyzer | TA Instruments | ||
| ESD Safe Plastic Tweezer, Tips; Flat, Duckbill, 11.5 cm | Cole Palmer | EW-07387-17 | |
| Laurell WS-650-8B spin coater | Laurell Technologies Corporation | ||
| liquid nitrogen | Air gas | ||
| PBS, 1X Solution, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP243820 | |
| SHEL LAB vacuum oven | VWR International | 89409-484 | |
| Silicon wafer | University Wafer | Mechanical grade | |
| The RSA-G2 Immersion System | TA Instruments | ||
| Trimethylolpropane tris(3-mercaptopropionate) (TMTMP) | Sigma-Aldrich | 381489-100ML | |
| UVP CL-1000 crosslinking chamber with 365 nm bulbs | VWR International | 21474-598 |
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