Summary
Nous présentons un protocole pour déterminer le solvant optimal d'extraction pour mesurer le cortisol de la fourrure de koala. Les solvants utilisés dans ce protocole sont le méthanol, l'éthanol et l'isopropanol. La détermination d'un solvant d'extraction optimal aidera à mesurer de façon fiable la fourrure afin de déterminer l'impact du stress chronique sur les koalas.
Abstract
Les méthodes optimales d'extraction hormonale utilisées pour mesurer le stress chez les animaux de tous les types d'échantillons ne sont pas toujours les mêmes. L'espèce marsupiale emblématique de l'Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), fait face à une exposition prolongée aux facteurs de stress d'origine anthropique et l'évaluation du stress chronique dans les populations sauvages est urgentement justifiée. Une des façons les plus efficaces de mesurer le stress chronique est en analysant l'hormone glucocorticoïde cortisol dans les cheveux ou la fourrure, car il soutient les réponses physiologiques et comportementales. Cette étude de validation en laboratoire vise à tester les techniques actuelles pour valider une méthode optimale d'extraction hormonale à utiliser comme mesure non invasive du cortisol dans la fourrure de koala. Il est reconnu que l'utilisation de techniques non invasives pour mesurer les hormones de stress est préférée aux techniques traditionnelles et invasives en raison de leurs points de vue pratiques et éthiques idéaux. En outre, il est relativement plus facile d'acquérir de la fourrure à partir de koalas que d'acquérir des échantillons de leur sang. Cette étude a utilisé des échantillons de fourrure de koala acquis auprès de l'Hôpital Adélaïde Koala et de la faune pour exécuter un certain nombre de techniques d'extraction hormonale dans une tentative de valider une méthode optimale d'extraction de cortisol. Les résultats ont montré que le méthanol à 100 % fournissait l'extraction de solvants la plus optimale par rapport à 100 % d'éthanol ou 100 % d'isopropanol basé sur les résultats du parallélisme. En conclusion, cette méthode d'extraction de cortisol de la fourrure de koala a fourni un test non invasif fiable qui pourrait être employé pour étudier le stress chronique dans les koalas.
Introduction
Les écosystèmes australiens soutiennent la vie humaine grâce à la fourniture de services, y compris la nourriture et la fibre parmi de nombreuses autres interactions dynamiques1. Ironiquement, c'est l'activité humaine qui est le principal moteur de la perturbation de l'écosystème par le changement de biodiversité2. La fragmentation de l'habitat, connue sous le nom de processus de division de grands habitats continus en petites parcelles de terre, isolées les unes des autres, est le changement anthropique majeur de la biodiversité qui menace les écosystèmes australiens2. La fragmentation de l'habitat modifie la structure et la diversité de la composition des espèces dans une zone donnée, réduisant ainsi la superficie d'habitat nécessaire à ces espèces pour maintenir des populations viables2. Le résultat de ceci est concurrence accrue entre les espècespour les ressources comprenant la nourriture, le carburant, la fibre, et l'eau 3. La destruction des écosystèmes australiens par le changement de la biodiversité a des conséquences catastrophiques sur de nombreuses espèces indigènes australiennes1.
L'espèce marsupiale la plus emblématique d'Australie, le koala (Phascolarctos cinereus), dépend du fait que les écosystèmes australiens restent en bonne santé pour leur survie4. L'introduction de l'établissement européen a provoqué un déclin rapide des populations australiennes de koalas, car ils ont été abattus pour leurs peaux dans la poursuite du profit dans un grand commerce d'exportation5. Cette pratique a été interdite dans les années 1980 et les populations de koalas ont ensuite pu stabiliser5. Cependant, la croissance exponentielle de la population humaine a entraîné cette espèce en concurrence pour une grande partie de leur habitat, et leur survie est de nouveau menacée6. Selon l'Union internationale pour la conservation de la nature (UICN), toutes les populations de koalas australiens sont classées comme vulnérables à l'extinction avec une tendance démographique en baisse7. Cette inscription est attribuée à l'incertitude entourant les paramètres de population pertinents et à la variation marquée des tendances démographiques pour cette espèce7. En tant qu'animaux les plus emblématiques et endémiques, les koalas profitent largement à l'économie australienne grâce au tourisme (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Une estimation suggère que le tourisme lié au koala a généré environ 9 000 emplois et contribue entre 1,1 et 2,5 milliards de dollars à l'économie (NSW Office of Environment and Heritage 2018). L'élimination d'une espèce a le potentiel d'être catastrophique, et peut être vu dans le déclin constant de la faune indigène australienne6. En outre, l'économie australienne ressentira les ramifications si les populations de koalas australiens continuent de diminuer au rythme où elles sontde 6.
Il est suggéré que la prévalence de la mort et de la maladie en réponse à la fragmentation de l'habitat est le résultat du stress chronique8. Déjà, vingt-quatre espèces marsupiales ont été déclarées éteintes en Australie en raison de la fragmentation de l'habitat, avec des koalas suivant une tendance similaire8. La complexité de la fragmentation de l'habitat et des systèmes biologiques est synergique, mais peut être déballée grâce à l'analyse de la réponse au stress6. En général, toute perturbation dans un environnement naturel animal active une cascade complexe d'événements neurohormonaux, connu sous le nom de «combat ou de fuite» réponse9,10. Cette réponse au stress est un processus qui commence dans le cerveau où l'axe hypothalamique-pituitaire-surrénalien (HPA) est activé11. Un composant du cerveau appelé l'hypothalamus libère l'hormone de libération de corticotrophine (CRH), qui signale alors l'hypotuitaire antérieur pour libérer l'hormone adrénocorticotrophic (ACTH)11. Ceci stimule à son tour la sécrétion glucocorticoïde de la médulle surrénale. Le corps circule glucocorticoïdes à travers le sang, ce qui détourne le stockage du glucose du glycogène et mobilise le glucose à partir de glycogène stocké11. Cette cascade d'événements neurohormonaux est la réponse utilisée par l'animal pour faire face à des stimuli imprévisibles11. Cependant, lorsque les glucocorticoïdes sont libérés et restent élevés pendant une période prolongée, l'animal est considéré comme éprouvant un stress chronique12,13. Ce processus consiste à détourner l'énergie d'autres fonctions corporelles corporelles, car il est nécessaire pour la production continue de glucocorticoïdes13. En conséquence, le stress chronique peut interdire la croissance, la reproduction et l'immunité, tous étant des traits de forme physique clés requis pour la survie14.
La mesure de la production de glucocorticoïdes d'un animal est un indicateur courant utilisé pour déterminer si l'animal subit ou non un stress physiologique15. Pour ce faire, les glucocorticoïdes peuvent être mesurés dans le plasma sanguin, le sérum, la salive, l'urine ou les fèces16. Cependant, les preuves suggèrent que les cheveux sont un indicateur beaucoup plus efficace du stress chronique, par opposition aux16susmentionnés. C'est parce que les cheveux sont pensés pour incorporer des hormones transmissibles par le sang pendant sa phase de croissance; il est relativement stable; et tout cortisol détecté dans les cheveux reflète le stress physiologique ressenti au cours de la période de croissance des cheveux, qui peut être semaines à16mois . En outre, toute collection de cortisol doit être non invasive afin de minimiser le stress associé à la capture et la manipulation16. Cependant, tout stress ressenti au cours de cet événement n'aurait pas d'impact sur les niveaux de glucocorticoïdes dans les cheveux16. Il y a eu beaucoup d'études qui explorent la compétence d'utiliser des cheveux pour mesurer le stress à long terme dans un certain nombre d'animaux, et incluent des études sur des rennes, des ours grizzlis, des singes rhésus, des bœufs musqués, et des ours bruns17,18,, 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 21. Le cortisol capillaire est habituellement extrait en lavant d'abord l'échantillon pour s'assurer que la sueur et le cortisol dérivé du sébum déposés à la surface des cheveux ne sont pas co-extraits avec du cortisol, puis pulvérisent l'échantillon dans un perle-batteur22. Après le lavage, l'échantillon doit être séché pour assurer l'évaporation complète22. Enfin, à l'aide d'un solvant, l'échantillon peut être extrait et reconstitué pour faciliter l'analyse du cortisol22. Le solvant le plus commun utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure est le méthanol21,23; cependant, il y a quelques études qui emploient l'éthanol et l'isopropanol dans leurs techniques d'extraction de cortisol. Par exemple, une étude qui a utilisé l'éthanol a réussi à extraire le cortisol du liquide amniotique humain24. En outre, une étude qui a utilisé l'isopropanol a été couronnée de succès pour extraire le cortisol des cheveux humains et les ongles25,26. Pour cette raison, cette étude a testé les trois solvants (méthanol, éthanol et isopropanol) pour déterminer lequel était le plus réussi pour l'extraction du cortisol à partir d'échantillons de fourrure de koala.
L'objectif principal de cette étude était d'utiliser les techniques actuelles pour valider une technique optimale d'extraction d'hormones à utiliser comme mesure non invasive du cortisol de la fourrure de koala. Ceci a été réalisé en testant trois solvants d'extraction (méthanol, éthanol, et isopropanol). Nous avons émis l'hypothèse que le méthanol sera le solvant optimal utilisé pour extraire le cortisol de la fourrure de koala parce que c'est le solvant recommandé de l'extraction par arbor estocurant kits de cortisol27.
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Protocol
Ce projet a été réalisé selon des directives strictes en matière de soins aux animaux et aux humains. L'éthique animale a été accordée par l'Université Western Sydney (A12373). De plus, une évaluation des risques en laboratoire et une forme de biosécurité et de rayonnement ont été soumises et acceptées par l'Université Western Sydney pour entreprendre cette recherche en toute sécurité (B12366).
REMARQUE : Des échantillons de fourrure de koala pour ce projet ont été obtenus à l'Hôpital Adelaide Koala and Wildlife, situé au 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. La fourrure a été prise d'un koala qui avait été admis à l'hôpital et euthanasié en raison de leurs blessures graves. Le koala décédé avait été entreposé dans un congélateur dans un sac mortuaire peu après sa mort. Après avoir retiré le koala décédé du sac mortuaire, 1,2 g de fourrure a été rasé de la nuque à l'aide de tondeuses pour animaux standard. La fourrure a été rasée aussi près que possible de la peau, afin de s'assurer que la peau n'a pas été coupée. Une fois rasé, le koala décédé a été remis dans le sac mortuaire et placé dans le congélateur. La fourrure a ensuite été placée dans une poche en papier d'aluminium et stockée en dessous de -20 oC. En transit, la fourrure était gardée à température ambiante, et à l'arrivée au laboratoire, la fourrure était entreposée à -80 oC.
1. Extraction de cortisol de fourrure de Koala
- Retirer la fourrure de l'entreposage à -80 oC et laisser le temps de décongeler.
- Peser la fourrure sur un équilibre de précision analytique de laboratoire.
- Placer 60 mg de la fourrure dans un tube de centrifugeuse pré-pesé et étiqueté de 1,5 mL et répéter jusqu'à ce que 18 tubes soient remplis.
REMARQUE : 18 sous-échantillons de fourrure ont été utilisés pour cette étude de validation. - Ajouter 1 ml d'isopropanol de qualité 100% de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à chaque tube à l'aide d'une pipette.
- Échantillons de Vortex pour 30 s.
- Filtrer chaque échantillon à l'aide d'un tamis de précision micro de 0,5 mm afin d'obtenir la séparation du liquide et de la fourrure.
- Jeter le liquide dans un contenant à déchets.
- Placer chaque échantillon de fourrure dans un bateau de pesage en plastique étiqueté, puis placer dans un dessiccateur sous vide, laisser la fourrure sécher pendant 3 jours.
- Une fois complètement sec, placer chaque échantillon dans un tube de microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté.
- Placer chaque échantillon dans un moulin à perles avec 3 perles d'acier chromé (3,2 mm) et pulvériser pendant 2 min à 30 secousses par seconde.
- Pipette 1,5 mL de la première technique d'extraction (éthanol de qualité analytique à 100 %) en 6 tubes microcentrifuges de 1,5 ml contenant l'échantillon de fourrure.
- Effectuez la même chose pour le méthanol de qualité analytique 100% et l'isopropanol de qualité analytique 100% jusqu'à ce que dix-huit tubes microcentrifugeurs de 1,5 ml soient remplis.
- Capuchon de chaque tube microcentrifuge de 1,5 ml et incuber à température ambiante (RT) avec une pulsation constante à l'aide d'un shaker pendant 3 h.
- Enlever et filtrer les échantillons à l'aide d'un tamis de précision micro de 0,5 mm.
- Transférer le liquide dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 ml étiqueté à l''eau-d'œuvre tout en veillant à ce que la fourrure soit jetée de façon appropriée.
- Extrait de solvant complètement sec sous un jet de vapeur N2 sous un panneau de fumée.
- Reconstituer l'extrait d'échantillon séché à l'aide de 400 l de tampon d'analyse (composition fournie dans le kit de cortisol commercial; voir Tableau des matériaux) et 100 L d'éthanol de qualité analytique à 100 %.
REMARQUE: Les extraits d'échantillons peuvent être stockés à -80 .
2. Contrôles internes
- Pour effectuer des contrôles, faire un pool d'échantillons extraits avec des niveaux élevés d'hormones. Pour faire ce pool, sélectionnez des échantillons d'animaux ayant une exposition connue au facteur de stress. Par exemple, sélectionnez des échantillons de koalas qui ont été sauvés d'un traumatisme environnemental car ils afficheront généralement des niveaux élevés d'hormones cortisol6.
- Pour faire le pool d'extraits, prendre 20 l'extrait de chaque échantillon (n ' 10) jusqu'à ce qu'un volume total de 200 L soit obtenu. Le pool d'extraitpeut peut être stocké à -80 C jusqu'à ce que les essais. Exécutez la piscine dans chaque essai en tant que contrôles internes bas ou élevés (voir l'étape 2.2).
- Pour l'assidu, utilisez le pool pour faire des stocks pour des contrôles faibles et élevés qui se lient à 70% (C1) et 30% (C2), respectivement. Obtenir le facteur de dilution pour les points de liaison de 30 % et 70 % à partir du graphique du parallélisme pour l'extrait par rapport à la norme cortisol (figure 1). Utilisez le tampon d'assay pour la dilution du pool d'échantillons. Par exemple, utilisez 60 ll de l'extrait de piscine et 60 l de tampon d'extrait pour 1:2 dilution.
REMARQUE : Pour l'extrait de méthanol, le point de liaison de 30 % était propre tandis que le point de liaison de 70 % était d'environ 1:2 selon la figure 1. Ainsi, ceux-ci ont fourni le facteur de dilution pour les contrôles internes (C1 et C2 respectivement) pour l'exécution dans l'analyse.
3. Analyse de cortisol dans des extraits de fourrure de koala
- Utilisez un kit commercial de cortisol (tableaudes matériaux)et configurez la plaque de bande de puits 96 comprenant les échantillons, les commandes, les normes de cortisol, les puits de liaison non spécifiques et les puits de liaison maximum suivant les instructions du fournisseur. Utilisez la feuille de mise en page des plaques fournie dans le livret du kit pour énumérer les positions des échantillons, des commandes et des normes sur la carte des plaques.
REMARQUE : Il est recommandé que tous les échantillons, contrôles et normes soient exécutés en double pour permettre l'exactitude des résultats. - Préparer des échantillons. Suivez l'extraction de l'hormone de fourrure (section 1) pour obtenir 100% de méthanol extrait de la fourrure de koala.
- Préparer les réactifs. Suivez la procédure décrite dans le kit de cortisol commercial pour préparer les réactifs, y compris (1) tampon d'analyse, (2) tampon de lavage, et (3) les normes (compositions fournies dans le kit de cortisol, Tableau des matériaux).
- Conformément aux instructions fournies dans le kit de cortisol, pipet 50 'L d'échantillons ou de normes dans les puits dans la plaque. Pipet 75 l et 50 l de tampon d'assay dans les puits de liaison non spécifiques (NSB) et les puits de liaison maximale (B0 ou zéro standard), respectivement.
- Ajouter 25 ll du cortisol conjugué à chaque puits à l'aide d'un tuyau de répéteur. Ensuite, pipet 25 L de l'anticorps de cortisol dans chaque puits, à l'exception des puits NSB. Appuyez doucement sur les côtés de la plaque pour s'assurer que les réactifs sont bien mélangés.
- Couvrir la plaque avec l'étanchéité et secouer à température ambiante pendant 1 h (à vitesse lente) à l'aide d'un shaker orbital.
- Retirer le scellant de plaque et aspirer la plaque de puits en lavant chaque puits avec 300 ll de tampon de lavage 4 fois.
- Séchez la plaque en tapant sur des serviettes absorbantes propres.
- Pipette 100 l de substrat de téramethylbenzadine (TMB) (composition fournie dans le kit de cortisol, Table of Materials) à chaque puits.
- Placer le scellant de plaque sur la plaque de puits et couver à RT pendant 30 min.
- Pipette 50 l de solution d'arrêt à chaque puits.
- Placez la plaque de puits dans un lecteur de plaque capable de lire 450 nm.
- Pour calculer la concentration finale d'hormones, dériver la concentration finale de cortisol de fourrure en ng/mg de l'échantillon en multipliant la concentration d'hormone de pg/mL avec le volume final d'extrait (0.5 mL) et en divisant par la masse d'échantillon de fourrure (60 mg).
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Representative Results
La détection d'analyse des métabolites d'hormone d'intérêt est déterminée utilisant le parallélisme. À l'aide d'une courbe de parallélisme, le point de liaison de 50 % détermine également le facteur de dilution de l'échantillon sur la courbe standard (Figure 1). Comme le montre le graphique du parallélisme (Figure 1), les extraits d'éthanol à 100 % et d'Isopropanol à 100 % n'ont pas fourni de déplacement parallèle par rapport à la norme du cortisol. Cependant, l'extrait de méthanol de 100% a fourni le déplacement parallèle contre la norme de cortisol. Les extraits séchés ont été exécutés proprement par la dilution dans le tampon d'essai (100 l de 100% d'éthanol et 400 'L de tampon d'essai).
Les coefficients d'analyse intra- (à l'intérieur) et inter-(entre) ont été déterminés à partir de et faible (environ 30 %) extraits d'échantillons de liaison exécutés dans tous les essais. D'après le graphique du parallélisme (figure 1), les contrôles internes de 30 % (faibles) de liaison étaient un pool d'extrait de koala soigné, tandis que les contrôles internes de liaison de 70 % (élevés) étaient 1:2 diluasiants. CV% pour les contrôles internes élevés et bas internes étaient de 15%.
La marge d'erreur dans le cadre de l'analyse peut être déterminée à l'aide du contrôle de la qualité, y compris les coefficients de variation intra et inter-analyse, qui devraient être de 15 %. La sensibilité à l'analyse a été calculée comme la valeur 2 des écarts types par rapport à la réponse moyenne des échantillons vierges (zéro liaison) et exprimée comme 81,26 pg/puits.
Figure 1 : Parallélisme de la fourrure de koala en commun extraite à l'aide de 3 solvants différents (100 % d'éthanol, 100 % d'isopropanol ou 100 % de méthanol) contre la courbe standard du cortisol sous une enzyme-immuno-immunossay cortisol. B/TB est le pourcentage de liaison sur la liaison totale. Le facteur de dilution en série (p. ex., 1:2X facteur moyen de dilution de 2) a été fourni en même temps que la concentration de chaque norme. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Deuxièmement, l'association entre chaque extrait de solvant et la norme de cortisol a été déterminée à l'aide d'une parcelle de régression (figure 2). Comme le montre la figure 2, l'extrait de méthanol à 100 % a fourni la meilleure ligne de régression avec la valeur R2 la plus élevée par rapport aux extraits d'éthanol à 100 % et à 100 %.
Figure 2 : Parcelles de régression pour la liaison en pourcentage de la norme de cortisol contre chacun des 3 solvants (éthanol, méthanol et isopropanol) utilisés pour extraire la fourrure de koala. La valeur R2 a été obtenue à partir de la ligne de meilleur ajustement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
De plus, un sous-ensemble de fourrure de koala extrait e à l'aide de chacun des trois solvants a été évalué et les résultats sont fournis dans le tableau 1 ci-dessous. Comme le montre le tableau 1, la concentration observée de cortisol standard se situe dans la fourchette de 2879,61-125,70 pg/puits. Ni la méthode d'extraction d'éthanol ou d'isopropanol n'a pu obtenir la cohérence dans le résultat car les concentrations d'extrait de fourrure obtenues en utilisant l'une ou l'autre des méthodes ont eu comme conséquence la gamme min-max très élevée des concentrations d'hormone (voir le tableau 1 des nombres marqués en rouge), qui étaient au-delà de la limite de détection de l'analyse du cortisol. Cependant, les extraits de méthanol ont entraîné des concentrations de cortisol dans la plage de la norme de cortisol (comme indiqué dans les nombres noirs gras dans le tableau 1). De plus, les concentrations de cortisol de fourrure détectées à l'aide de la méthode d'extraction du méthanol étaient très constantes par rapport aux résultats obtenus à l'aide des deux autres méthodes (voir le tableau 1). Ainsi, nous acceptons l'hypothèse nulle que le méthanol est le solvant le plus approprié pour l'extraction d'hormone de fourrure de koala comparée à l'éthanol et à l'isopropanol.
Tableau 1 : La concentration de cortisol (ng/mg) pour la fourrure de koala (n - 18) extraite à l'aide de 3 solvants différents (éthanol, isopropanol ou méthanol) et s'exécute ntable contre la courbe standard du cortisol sous une enzyme-immuno-immunossay cortisol. Les nombres rouges gras montrent des concentrations incohérentes pour l'éthanol et les extraits d'isopropanol qui étaient au-delà de la plage d'analyse (pg/well). Des nombres noirs audacieux montrent les concentrations de cortisol de fourrure extraite à l'aide de méthanol qui se situe dans la fourchette des normes de cortisol (pg/well). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Il existe un certain nombre d'études qui utilisent une gamme de techniques pour détecter le cortisol dans la fourrure de mammifères. Cette étude présente des résultats pour la détection du cortisol dans la fourrure recueillie à partir d'un koala sauvage exposé au stress anthropique actuel. Cette étude révolutionnaire a utilisé la fourrure pour tester lequel des trois solvants couramment utilisés sont les meilleurs pour extraire le cortisol, une mesure du stress chronique, de la fourrure de koala. Les résultats ont montré que le méthanol à 100 % était le solvant recommandé pour l'extraction du cortisol dans ce type de fourrure de mammifères.
L'éthanol, le méthanol et l'isopropanol sont tous des alcools primaires qui sont liés par des molécules d'hydrogène et sont couramment utilisés comme solvants dans les expériences d'extraction d'hormones28. En général, les substances polaires se dissolvent le mieux dans d'autres substances polaires, tandis que les substances non polaires se dissolvent le mieux dans d'autres substances non polaires. Le groupe d'alcool contenant du méthanol est très polaire, tandis que le groupe d'alcool contenant de l'isopropanol est très non polaire. En raison de sa construction moléculaire, le groupe d'alcool contenant de l'éthanol a l'avantage d'être à la fois un solvant polaire et non polaire. Les hormones stéroïdes telles que le cortisol sont considérés comme non polaires, ce qui signifie que le cortisol devrait avoir une forte association contraignante avec les solvants polaires.
Pour une analyse plus complète des solvants d'extraction utilisés pour évaluer le stress physiologique dans la fourrure de koala, les futurs projets de recherche devraient tenter des méthodes identiques dans cet ordre comme décrit à la figure 3. Des études similaires ont historiquement effectué le lavage avant le broyage22, afin de s'assurer qu'il n'y a pas de sueur involontaire et / ou de cortisol dérivé du sébum déposé dans l'échantillon de fourrure. En outre, il est important que la mesure du cortisol seul ne peut pas garantir une indication complète du stress chronique. Les lectures de cortisol de cheveux sont un outil valable en essayant de comprendre le stress physiologique éprouvé par un animal, mais l'activité élevée de HPA peut se produire dans une série de conditions comprenant l'exercice physique, les anomalies métaboliques et la présence de maladieinfectieuse22. D'autres facteurs importants qui devraient être pris en considération à l'intégrité principale des données d'hormone incluent ce qui suit. (1) Niveau acceptable d'erreur aléatoire - les coefficients de variation obtenus à partir des contrôles internes (CV1 et CV2) devraient être en moyenne à 15% pour tous les tests. (2) L'erreur aléatoire dans l'analyse de l'échantillon , les échantillons en double exécutés sur chaque plaque devrait avoir un pourcentage de CV % de l'ilt;15 %; sinon l'échantillon devra être réexécuté. (3) Limite de détection des tests - la concentration d'hormones quantifiées à l'intérieur de chaque analyse devrait être dans la limite de détection d'analyse (entre les lectures pour la dilution la plus élevée et la norme soignée); autrement, les échantillons peuvent nécessiter une dilution plus poussée (si les niveaux détectés pour les échantillons sont supérieurs à la concentration de la norme soignée) ou ne peuvent pas être analysés dans le cadre de l'analyse (si les niveaux détectés pour les échantillons sont inférieurs à la concentration de la norme diluée la plus élevée. standard). (4) Sensibilité à l'analyse - cela peut être affecté par la lecture de fond (liaison non spécifique), il est donc important de maintenir le plus haut niveau d'assurance de la qualité pour l'analyse (par exemple, l'équipement tel que la veinet et lecteur de plaque doit être entretenu régulièrement). (5) Séchage de l'extrait d'échantillon - cette étape pourrait entraîner une contamination croisée potentielle ou la perte d'échantillons. Il est recommandé de sécher individuellement les échantillons sous la vapeur de gaz N2 et de remplacer la pipette Pasteur utilisée pour l'extraction entre chaque échantillon.
Figure 3 : Diagramme conceptuel de flux montrant les étapes principales impliquées dans l'enzyme-immuno-immunoassay de cortisol de fourrure de koala (EIA). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La procédure décrite dans la présente étude (figure 3) est une procédure qui peut être facilement reproduite car elle est relativement facile à exécuter, méthodologie étape par étape qui intègre des produits chimiques facilement disponibles, des réactifs et des fournitures avec de l'équipement qui est susceptible d'être dans un laboratoire d'analyse standard. L'application de cette étude permet d'utiliser une technique non invasive pour évaluer le stress physiologique chez les koalas sauvages et captifs.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le financement de la recherche de démarrage pour Edward Narayan par l'Université western Sydney, School of Science and Health. Les auteurs remercient Jack Nakhoul pour son aide dans le traitement des échantillons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
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