Summary
हम कोआला फर से कोर्टिसोल को मापने के लिए इष्टतम निष्कर्षण विलायक निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सॉल्वैंट्स मेथनॉल, इथेनॉल और आइसोप्रोपेनोल हैं। एक इष्टतम निष्कर्षण विलायक का निर्धारण मज़बूती से कोआला पर पुराने तनाव के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए फर को मापने में सहायता करेगा।
Abstract
नमूना प्रकार भर में जानवरों में तनाव को मापने के लिए इस्तेमाल हार्मोन निष्कर्षण के इष्टतम तरीके हमेशा एक ही नहीं हैं. ऑस्ट्रेलिया के प्रतिष्ठित मार्सूपियल प्रजाति, कोआला(फास्कोलार्क्टोस सिनेरियस),मानवजनित-प्रेरित तनावों के लंबे समय तक संपर्क का सामना कर रही है और जंगली आबादी में पुराने तनाव का आकलन तत्काल किया जाता है। पुरानी तनाव को मापने के लिए सबसे प्रभावी तरीकों में से एक बालों या फर में glucocorticoid हार्मोन कोर्टिसोल का विश्लेषण के माध्यम से है, क्योंकि यह शारीरिक और व्यवहार प्रतिक्रियाओं का समर्थन करता है. इस प्रयोगशाला सत्यापन अध्ययन कोआला फर में कोर्टिसोल के एक गैर इनवेसिव उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक इष्टतम हार्मोन निष्कर्षण विधि को मान्य करने के लिए वर्तमान तकनीकों का परीक्षण करना है. यह मान्यता प्राप्त है कि तनाव हार्मोन को मापने के लिए गैर इनवेसिव तकनीकों का उपयोग कर उनके आदर्श व्यावहारिक और नैतिक दृष्टिकोण के कारण पारंपरिक, आक्रामक तकनीकों पर पसंद किया जाता है. इसके अतिरिक्त, यह अपेक्षाकृत आसान है koalas से फर प्राप्त करने के लिए की तुलना में यह उनके रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए है. इस अध्ययन में एक इष्टतम कोर्टिसोल निष्कर्षण विधि को मान्य करने के प्रयास में हार्मोन निष्कर्षण तकनीक के एक नंबर चलाने के लिए एडिलेड कोआला और वन्यजीव अस्पताल से प्राप्त कोआला फर के नमूने का इस्तेमाल किया। परिणाम से पता चला कि 100% मेथनॉल की तुलना में सबसे इष्टतम विलायक निष्कर्षण प्रदान की 100% इथेनॉल या 100% समानता परिणामों के आधार पर आइसोप्रोपेनोल. अंत में, कोआला फर से कोर्टिसोल निष्कर्षण की इस विधि एक विश्वसनीय गैर इनवेसिव परख है कि koalas में पुराने तनाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान की.
Introduction
ऑस्ट्रेलियाई पारिस्थितिकी तंत्र कई अन्य गतिशील बातचीत1के बीच भोजन और फाइबर सहित सेवाओं के प्रावधान के माध्यम से मानव जीवन को बनाए रखने . विडंबना यह है कि यह मानव गतिविधि है कि जैव विविधता परिवर्तन2के माध्यम से पारिस्थितिकी तंत्र व्यवधान के प्रमुख चालक के रूप में संचालित है. आवास विखंडन, बड़े निरंतर निवास भूमि के छोटे पैच में विभाजित करने की प्रक्रिया के रूप में जाना जाता है, एक दूसरे से अलग, प्रमुख मानवजनित जैव विविधता परिवर्तन ऑस्ट्रेलियाई पारिस्थितिकी प्रणालियों2की धमकी दे रहा है. आवास विखंडन किसी भी क्षेत्र में प्रजातियों के संघटन की संरचना और विविधता को संशोधित करता है, इस प्रकार इन प्रजातियों के लिए आवश्यक आवास के क्षेत्र को कम करने के लिए व्यवहार्य आबादी2बनाए रखने के लिए . इस का परिणाम भोजन, ईंधन, फाइबर, और पानी3सहित संसाधनों के लिए प्रजातियों के बीच प्रतिस्पर्धा में वृद्धि हुई है. जैव विविधता परिवर्तन के माध्यम से ऑस्ट्रेलियाई पारिस्थितिकी प्रणालियों के विनाश कई ऑस्ट्रेलियाई देशी प्रजातियों1पर भयावह परिणाम हो रहा है .
ऑस्ट्रेलिया के सबसे प्रतिष्ठित मार्सूपियल प्रजाति, कोआला (Phascolarctos cinereus), ऑस्ट्रेलियाई पारिस्थितिकी प्रणालियों पर निर्भर करता है उनकेअस्तित्वके लिए स्वस्थ 4 . यूरोपीय निपटान की शुरूआत के कारण कोआला की ऑस्ट्रेलियाई आबादी में तेजी से गिरावट आई , क्योंकि उन्हें एक बड़े निर्यातव्यापार5 में लाभ की खोज में उनके पथराव के लिए मार डाला गया था . इस प्रथा पर 1980 के दशक में प्रतिबंध लगा दिया गया था और कोआला की आबादी तब5को स्थिर करने में सक्षम थी . तथापि, मानव जनसंख्या की घातीय वृद्धि के परिणामस्वरूप यह प्रजाति अपने अधिकांश निवास स्थान के लिए प्रतिस्पर्धा कर रही है, और उनका अस्तित्व फिर से खतरे में है6. इंटरनेशनल यूनियन फॉर द कंजर्वेशन ऑफ नेचर (आईयूसीएन) के अनुसार, ऑस्ट्रेलियाई कोआला की सभी आबादी जनसंख्या की घटती प्रवृत्तिकेसाथ विलुप्त होने की चपेट में आ गई है। इस सूची को प्रासंगिक जनसंख्या मानकों के आसपास अनिश्चितता के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है और इस प्रजाति7के लिए जनसंख्या प्रवृत्तियों में उल्लेखनीय भिन्नता है . सबसे प्रतिष्ठित और स्थानिक जानवरों के रूप में, koalas काफी हद तक पर्यटन के माध्यम से ऑस्ट्रेलियाई अर्थव्यवस्था को लाभ (पर्यावरण और विरासत के एनएसडब्ल्यू कार्यालय 2018). एक अनुमान से पता चलता है कि कोआला संबंधित पर्यटन ने लगभग 9,000 नौकरियां उत्पन्न की हैं और अर्थव्यवस्था के लिए $1.1 और $2.5 बिलियन (एनएसडब्ल्यू कार्यालय ऑफ एनयूएस ऑफिस ऑफ एनवायरनमेंट एंड हेरिटेज 2018) के बीच योगदान देता है। किसी भी एक प्रजाति को हटाने के लिए भयावह होने की क्षमता है, और देशी ऑस्ट्रेलियाई वन्य जीवन6की लगातार गिरावट में देखा जा सकता है. इसके अतिरिक्त, ऑस्ट्रेलिया की अर्थव्यवस्था असर महसूस होगा अगर ऑस्ट्रेलियाई koalas की आबादी की दर वे6रहे हैं पर गिरावट जारी है.
यह सुझाव दिया जाता है कि आवास विखंडन के प्रत्युत्तर में मृत्यु और रोग की व्याप्तता पुराने तनाव8का परिणाम है . पहले से ही, ऑस्ट्रेलिया में चौबीस मार्सूपियल प्रजातियों को आवास विखंडन के कारण विलुप्त घोषित किया गया है, जिसमें कोआला इसी तरह की प्रवृत्ति8के बाद है। आवास विखंडन और जैविक प्रणालियों की जटिलता synergistic है लेकिन तनाव प्रतिक्रिया6के विश्लेषण के माध्यम से unpacked किया जा सकता है . आम तौर पर, एक जानवर प्राकृतिक परिवेश में किसी भी अशांति neurohormonal घटनाओं का एक जटिल झरना सक्रिय, एक 'लड़ाई या उड़ान' प्रतिक्रिया9,10के रूप में जाना जाता है. तनाव के लिए यह प्रतिक्रिया एक प्रक्रिया है कि मस्तिष्क में शुरू होता है जहां hypothalamic-पिट्यूटरी-एड्रेनल (HPA) अक्ष सक्रियहै 11. मस्तिष्क का एक घटक जिसे हाइपोथैलेमस कहा जाता है, कॉर्टिकोट्रोफिन जारी हार्मोन (सीआरएच) जारी करता है, जो तब एड्रेनोकॉर्टिकोट्रॉफिक हार्मोन (एसीटीएच)11को जारी करने के लिए पूर्वकाल पिट्यूटरी का संकेत देता है। यह बदले में अधिवृक्क मेडुला से glucocorticoid स्राव को उत्तेजित करता है. शरीर रक्त के माध्यम से ग्लूकोकोर्टिकोइड्स को प्रसारित करता है, जो ग्लाइकोजन से ग्लूकोज के भंडारण को डायवर्ट करता है और संग्रहित ग्लाइकोजन11से ग्लूकोज को एकत्रित करता है। न्यूरोहॉर्मोनल घटनाओं का यह झरना अप्रत्याशित उत्तेजनाओंसेनिपटने के लिए जानवर द्वारा उपयोग की जाने वाली प्रतिक्रिया है . तथापि, जब glucocorticoids जारी किया जा रहा है और समय की एक लंबी अवधि के लिए ऊंचा रहना, जानवर पुराने तनाव का अनुभव माना जाता है12,13. इस प्रक्रिया में ऊर्जा को अन्य शारीरिक शारीरिक कार्यों से दूर हटाना शामिल है, क्योंकि यह चल रहे ग्लूकोकोर्टिकोइड उत्पादन13के लिए आवश्यक है। एक परिणाम के रूप में, पुराने तनाव विकास, प्रजनन और प्रतिरक्षा, सभी प्रमुख फिटनेस लक्षण अस्तित्व के लिए आवश्यक होने पर रोक लगा सकते हैं14.
एक जानवर के glucocorticoid उत्पादन को मापने एक आम सूचक निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है या नहीं जानवर शारीरिक तनाव का सामना कर रहा है15. ऐसा करने के लिए, glucocorticoids रक्त प्लाज्मा, सीरम, लार, मूत्र या मल16में मापा जा सकता है। हालांकि, सबूत से पता चलता है कि बाल पुराने तनाव का एक और अधिक प्रभावी संकेत है, जैसा कि ऊपर उल्लिखित16के विपरीत है. इसका कारण यह है कि बाल अपने विकास चरण के दौरान रक्त जनित हार्मोन को शामिल करने के लिए सोचा है; यह अपेक्षाकृत स्थिर है; और बालों में पाए जाने वाले किसी भी कोर्टिसोल बालों के विकास की अवधि में अनुभव किए गए शारीरिक तनाव को दर्शाता है, जो सप्ताह से16महीने तक हो सकता है। इसके अलावा, कोर्टिसोल के किसी भी संग्रह कब्जा और16से निपटने के साथ जुड़े तनाव को कम करने के क्रम में गैर इनवेसिव होना चाहिए। हालांकि, किसी भी तनाव इस घटना के दौरान अनुभव बालों में glucocorticoid के स्तर को प्रभावित नहीं करेगा16. वहाँ कई अध्ययनों है कि जानवरों की एक संख्या में लंबी अवधि के तनाव को मापने के लिए बालों का उपयोग करने की प्रवीणता का पता लगाने गया है, और हिरन, ग्रिजली भालू, rhesus बंदरों, muskoxen, और भूरे भालू पर अध्ययन शामिल17,18, 19 , 20 , 21. बालों की सतह पर जमा पसीने और sebum व्युत्पन्न कोर्टिसोल सुनिश्चित करने के लिए पहले नमूने को धोने से बाल कोर्टिसोल को पहले निकाला जाता है , कोर्टिसोल के साथ सह-निकाला नहीं जाता है और फिर एक मनका-बीटर22में नमूने को चूर्णित करता है . धोने के बाद, नमूना पूरा वाष्पीकरण22सुनिश्चित करने के लिए सूखे की जरूरत है। अंत में, एक विलायक का उपयोग कर, नमूना निकाला जा सकता है और कोर्टिसोल22की परख की सुविधा के लिए पुनर्गठन. फर से कोर्टिसोल निकालने के लिए सबसे आम विलायक मेथनॉल21,23है ; हालांकि, वहाँ कुछ अध्ययन है कि उनके कोर्टिसोल निष्कर्षण तकनीक में इथेनॉल और आइसोप्रोपेनोल का उपयोग कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन है कि इथेनॉल का इस्तेमाल मानव amniotic तरल पदार्थ24से कोर्टिसोल निकालने के लिए सफल रहा था. इसके अतिरिक्त, एक अध्ययन है कि isopropanol इस्तेमाल मानव बाल और नाखून25,26से कोर्टिसोल निकालने के लिए सफल रहा था . इस कारण से, इस अध्ययन ने यह निर्धारित करने के लिए सभी तीन सॉल्वैंट्स (मेथेनॉल, इथेनॉल, और आइसोप्रोपेनोल) का परीक्षण किया जो कोआला फर के नमूनों से कोर्टिसोल की निकासी के लिए सबसे सफल था।
इस अध्ययन का प्राथमिक उद्देश्य कोआला फर से कोर्टिसोल के एक गैर इनवेसिव उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक इष्टतम हार्मोन निष्कर्षण तकनीक को मान्य करने के लिए वर्तमान तकनीकों का उपयोग करने के लिए किया गया था। यह तीन निष्कर्षण सॉल्वैंट्स (मेथेनॉल, इथेनॉल, और आइसोप्रोपेनोल) का परीक्षण करके हासिल किया गया था। हम hypothesized कि मेथनॉल इष्टतम विलायक कोआला फर से कोर्टिसोल निकालने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा क्योंकि यह आर्बर परख कोर्टिसोल किट27द्वारा निष्कर्षण की सिफारिश की विलायक है .
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Protocol
इस परियोजना को सख्त पशु और मानव देखभाल दिशा निर्देशों के तहत प्रदर्शन किया गया था. पशु नैतिकता पश्चिमी सिडनी विश्वविद्यालय (A12373) द्वारा दी गई थी. इसके अतिरिक्त, एक प्रयोगशाला जोखिम मूल्यांकन और biosafety और विकिरण फार्म प्रस्तुत किया और पश्चिमी सिडनी विश्वविद्यालय द्वारा स्वीकार किए जाते हैं सुरक्षित रूप से इस अनुसंधान (B12366) शुरू करने के लिए.
नोट: इस परियोजना के लिए कोआला फर नमूने एडिलेड कोआला और वन्यजीव अस्पताल, 282 Anzac राजमार्ग, Plympton दक्षिण ऑस्ट्रेलिया में स्थित से प्राप्त किए गए थे. फर को एक कोआला से लिया गया था जिसे अस्पताल में भर्ती कराया गया था और गंभीर चोटों के कारण उन्हें इच्छामृत्यु दी गई थी। मृतक कोआला को मौत के तुरंत बाद एक शरीर के बैग के भीतर एक फ्रीजर में रखा गया था। शरीर बैग से मृतक कोआला को हटाने के बाद, 1.2 ग्राम फर मानक पशु क्लिपर का उपयोग कर गर्दन की झपकी से मुंडा गया था। फर त्वचा के लिए संभव के रूप में बंद के रूप में मुंडा था, ताकि त्वचा को कम नहीं किया गया था सुनिश्चित करने के लिए. एक बार मुंडा, मृतक कोआला शरीर बैग में वापस डाल दिया और फ्रीजर में रखा गया था. फर तो एल्यूमीनियम पन्नी से बना एक थैली में रखा गया था और -20 डिग्री सेल्सियस नीचे संग्रहीत. पारगमन में, फर परिवेश के तापमान पर रखा गया था, और प्रयोगशाला के आगमन पर, फर -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
1. कोआला फर कोर्टिसोल निष्कर्षण
- -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से फर निकालें और thaw करने के लिए समय की अनुमति देते हैं।
- एक प्रयोगशाला विश्लेषणात्मक परिशुद्धता संतुलन पर फर वजन.
- फर की 60 मिलीग्राम को पूर्व वजनी और लेबल 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और 18 ट्यूबों से भर जाने तक दोहराएं।
नोट: 18 फर उप नमूने इस सत्यापन अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया. - एक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब के लिए 100% उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) ग्रेड आइसोप्रोपेनॉल के 1 एमएल जोड़ें।
- भंवर 30 एस के लिए नमूने.
- तरल और फर की जुदाई को प्राप्त करने के लिए इतनी के रूप में एक 0.5 मिमी माइक्रो परिशुद्धता छलनी का उपयोग कर प्रत्येक नमूना तनाव।
- अपशिष्ट पात्र में तरल को छोड़ दें।
- एक लेबल प्लास्टिक वजन नाव में प्रत्येक फर नमूना प्लेस, तो एक वैक्यूम desiccator में जगह है, फर 3 दिनों के लिए शुष्क करने के लिए छोड़ दें.
- एक बार पूरी तरह से सूखा, एक लेबल 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक नमूने जगह है.
- 3 क्रोम स्टील मोती (3.2 मिमी) के साथ एक मनका मिल में प्रत्येक नमूना प्लेस और प्रति सेकंड 30 हिलाता पर 2 मिनट के लिए pulverize.
- पिपेट 1.5 एमएल पहली निष्कर्षण तकनीक (100% विश्लेषणात्मक ग्रेड इथेनॉल) में 6 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब फर नमूना युक्त।
- 100% विश्लेषणात्मक ग्रेड मेथनॉल और 100% विश्लेषणात्मक ग्रेड आइसोप्रोपेनोल के लिए एक ही प्रदर्शन जब तक अठारह 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों भर रहे हैं।
- कैप प्रत्येक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट (आरटी) लगातार 3 एच के लिए एक शेकर का उपयोग कर स्पंदन के साथ।
- निकालें और एक 0.5 मिमी माइक्रो सटीक छलनी का उपयोग कर नमूने तनाव.
- तरल को एक नए में स्थानांतरित करें, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब को एक पिपेट के साथ लेबल करें, जबकि यह सुनिश्चित करते हुए कि फर को उचित रूप से खारिज कर दिया जाता है।
- एक धूआं-कपबोर्ड के नीचे एन2 वाष्प की एक धारा के तहत पूरी तरह से सूखी विलायक निकालने।
- परख बफर के 400 $L का उपयोग कर सूखे नमूना निकालने का पुनर्गठन (वाणिज्यिक कोर्टिसोल किट में प्रदान की संरचना; सामग्री की तालिकादेखें) और 100% विश्लेषणात्मक ग्रेड इथेनॉल के 100 $L।
नोट: नमूना अर्क -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है।
2. आंतरिक नियंत्रण
- नियंत्रण करने के लिए, उच्च हार्मोन के स्तर के साथ निकाले गए नमूनों का एक पूल बनाते हैं. इस पूल बनाने के लिए, तनाव के लिए ज्ञात जोखिम के साथ जानवरों से नमूने का चयन करें. उदाहरण के लिए, koalas है कि पर्यावरण आघात से बचाया गया है के नमूने का चयन के रूप में वे आम तौर पर उच्च कोर्टिसोल हार्मोन का स्तर प्रदर्शित करेगा6.
- निकालने के पूल बनाने के लिए, प्रत्येक नमूने से निकालने के 20 डिग्री एल ले (एन $ 10) जब तक की कुल मात्रा 200 $L प्राप्त किया जाता है। निकालने पूल पर रखा जा सकता है -80 सी जब तक assays. कम या उच्च आंतरिक नियंत्रण के रूप में प्रत्येक परख में पूल चलाएँ (चरण 2.2 देखें)।
- परख के लिए, पूल का उपयोग करने के लिए कम और उच्च नियंत्रण है कि 70% (C1) और 30% (C2) पर बाँध के लिए शेयर बनाने के लिए क्रमशः. कोर्टिसोल मानक के विरुद्ध निकालने के लिए समानांतरता ग्राफ से 30% और 70% बाध्यकारी बिंदुओं के लिए कमजोर पड़ने का कारक प्राप्त करें (चित्र 1) . नमूना पूल के कमजोर पड़ने के लिए परख बफर का प्रयोग करें. उदाहरण के लिए, पूल निकालने के 60 डिग्री सेल्सियस और 1:2 कमजोर पड़ने के लिए परख बफर के 60 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें।
नोट: मेथनॉल निकालने के लिए, 30% बाध्यकारी बिंदु साफ पर था, जबकि 70% बाध्यकारी बिंदु चित्र 1के अनुसार लगभग 1:2 था। इस प्रकार, इन परख के भीतर चलाने के लिए आंतरिक नियंत्रण (C1 और C2 क्रमशः) के लिए कमजोर पड़ने कारक प्रदान की.
3. कोआला फर अर्क में Cortisol विश्लेषण
- एक वाणिज्यिक कोर्टिसोल किट का प्रयोग करें (सामग्री की तालिका) और नमूने सहित 96 अच्छी तरह से पट्टी प्लेट की स्थापना, नियंत्रण, कोर्टिसोल मानकों, गैर विशिष्ट बाध्यकारी कुओं, और आपूर्तिकर्ता के निर्देशों का पालन अधिकतम बाध्यकारी कुओं. प्लेट मानचित्र पर नमूने, नियंत्रण, और मानकों की स्थिति की सूची के लिए किट पुस्तिका में प्रदान की प्लेट लेआउट शीट का उपयोग करें।
नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि सभी नमूने, नियंत्रण, और मानक डुप्लिकेट में परिणामों की शुद्धता की अनुमति दें करने के लिए चलाए जाते हैं। - नमूने तैयार करें. फर हार्मोन निष्कर्षण का पालन करें (अनुभाग 1) प्राप्त करने के लिए 100% मेथनॉल निकाले कोआला फर.
- अभिकर्मकों को तैयार करें. (1) परख बफर, (2) धोने बफर, और (3) मानकों (कोर्टिसोल किट, सामग्री कीतालिका) में प्रदान की रचनाओं सहित अभिकर्मकों को तैयार करने के लिए वाणिज्यिक कोर्टिसोल किट में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें।
- कोर्टिसोल किट में दिए गए निर्देशों के अनुसार, प्लेट में कुओं में 50 डिग्री सेल्सियस नमूने या मानकों का उपयोग किया जाता है। पिप्पल 75 डिग्री सेल्सियस और 50 डिग्री सेल्सियस गैर-विशिष्ट बाइंडिंग (एनएसबी) कुओं और अधिकतम बाइंडिंग (बी0 या शून्य मानक) कुओं में बफर परख।
- प्रत्येक अच्छी तरह से एक अपराधी पाइप्ट का उपयोग करने के लिए कोर्टिसोल संयुग्मी के 25 डिग्री एल जोड़ें। इसके बाद एनएसबी कुओं को छोड़कर प्रत्येक कुएं में कोर्टिसोल एंटीबॉडी का 25 डिग्री सेल्सियस पाइप। धीरे से अभिकर्मकों अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए थाली के पक्षों नल.
- प्लेट सीलर के साथ प्लेट को कवर करें और कक्ष के तापमान पर 1 h (धीमी गति से) कक्षीय शेकर का उपयोग करके हिलाएं।
- प्लेट सीलर निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से धोने बफर के 300 डिग्री एल के साथ अच्छी तरह से धोने के द्वारा अच्छी तरह से थाली aspirate 4 बार.
- साफ शोषक तौलिए पर प्लेट टैप करके प्लेट को सुखाएं।
- पिपेट 100 डिग्री सेल्सियस टेट्रामेथिलबेन्जाडीन (टीएमबी) सब्सट्रेट (कोर्टिसोल किट में प्रदान की गई संरचना, सामग्री कीतालिका) प्रत्येक को अच्छी तरह से।
- अच्छी तरह से प्लेट पर प्लेट सीलर रखें और 30 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
- प्रत्येक अच्छी तरह से बंद समाधान के Pipette 50 डिग्री एल.
- 450 एनएम पढ़ने में सक्षम एक प्लेट रीडर में अच्छी तरह से प्लेट रखें।
- अंतिम हार्मोन एकाग्रता की गणना करने के लिए, अंतिम निकालने की मात्रा के साथ pg/mL हार्मोन एकाग्रता गुणा द्वारा एनजी/मिलीग्राम में अंतिम फर कोर्टिसोल एकाग्रता प्राप्त (0.5 एमएल) और फर नमूना द्रव्यमान द्वारा विभाजित (60 मिलीग्राम).
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Representative Results
ब्याज की हार्मोन चयापचयों की परख का पता लगाने समानता का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है. एक समानता वक्र का उपयोग करते हुए, 50% बाइंडिंग बिंदु मानक वक्र पर नमूना कमजोर पड़ने के कारक को भी निर्धारित करता है (चित्र1)। जैसा कि समानताग्राफ में दिखाया गया है (चित्र 1), 100% इथेनॉल और 100% Isopropanol अर्क कोर्टिसोल मानक के खिलाफ समानांतर विस्थापन प्रदान नहीं किया. हालांकि, 100% मेथनॉल निकालने कोर्टिसोल मानक के खिलाफ समानांतर विस्थापन प्रदान की। सूखे अर्क परख बफर में कमजोर पड़ने के माध्यम से साफ चला रहे थे (100 $ 100% इथेनॉल और परख बफर के 400 $L के$L).
अंतर- (अंदर) और अंतर (बीच) भिन्नता के परख गुणांक (सीवी) उच्च से निर्धारित किए गए थे - (लगभग 70%) और कम- (लगभग 30%) बंधन नमूना अर्क सभी assays में चलारहे हैं. समानताग्राफ के आधार पर (चित्र1), 30% (कम) बाध्यकारी आंतरिक नियंत्रण स्वच्छ कोआला निकालने पूल थे, जबकि 70% (उच्च) बाध्यकारी आंतरिक नियंत्रण 1:2 पतला कोआला निकालने पूल थे। आंतरिक उच्च और कम आंतरिक नियंत्रण के लिए CV% थे और 15%.
परख के भीतर त्रुटि मार्जिन भिन्नता के अंतर और अंतर परख गुणांक, जो होना चाहिए सहित गुणवत्ता नियंत्रण का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है और $lt;15%. परख संवेदनशीलता रिक्त (शून्य बाइंडिंग) नमूने के माध्य प्रतिक्रिया से मान 2 मानक विचलन के रूप में गणना की गई थी, और 81.26 pg/well के रूप में व्यक्त की गई थी।
चित्रा 1: पूल्ड कोआला फर की समानता 3 अलग-अलग सॉल्वैंट्स (100% इथेनॉल, 100% आइसोप्रोपेनोल या 100% मेथनॉल) एक कोर्टिसोल एंजाइम-इम्युनोसेके के तहत कोर्टिसोल मानक वक्र के खिलाफ निकाली गई। B/TB कुल बाइंडिंग से अधिक बाइंडिंग का प्रतिशत है। सीरियल कमजोर पड़ने कारक (उदा., 1:2X मतलब कमजोर पड़ने कारक 2) प्रत्येक मानक की एकाग्रता के साथ एक साथ प्रदान की गई है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
दूसरे, प्रत्येक विलायक निकालने और कोर्टिसोल मानक के बीच संबंध एक प्रतिगमन साजिश का उपयोग कर निर्धारित किया गया था (चित्र 2). चित्रा 2में दिखाया गया है के रूप में , 100% मेथनॉल निकालने 100% इथेनॉल और 100% आइसोप्रोपेनॉल अर्क की तुलना में उच्चतम आर2 मूल्य के साथ प्रतिगमन का सबसे अच्छा लाइन प्रदान की।
चित्रा 2: 3 सॉल्वैंट्स (इथेनॉल, मेथनॉल, और आइसोप्रोपेनोल) में से प्रत्येक के खिलाफ कोर्टिसोल मानक के प्रतिशत बंधन के लिए प्रतिगमन भूखंडों कोकोला फर निकालने के लिए इस्तेमाल किया। R2 मान सबसे अच्छा फिट की लाइन से प्राप्त किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इसके अलावा, तीन सॉल्वैंट्स में से प्रत्येक का उपयोग करके निकाले गए कोआला फर के उप-सेट परपरख गए थे और परिणाम नीचे तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं। जैसा कि तालिका 1में दर्शाया गया है, कोर्टिसोल मानक की प्रेक्षित सांद्रता 2879.61-125.70 pg/ न तो इथेनॉल या आइसोप्रोपेनोल निष्कर्षण विधि परिणाम में स्थिरता प्राप्त कर सकता है क्योंकि फर निकालने सांद्रता या तो तरीकों का उपयोग करके प्राप्त की गई हार्मोन सांद्रता की बहुत उच्च न्यूनतम-अधिकतम रेंज में हुई (तालिका 1 संख्या चिह्नित देखें लाल रंग में), जो कोर्टिसोल परख का पता लगाने की सीमा से परे थे. हालांकि, मेथनॉल के अर्क कोर्टिसोल मानक की सीमा के भीतर कोर्टिसोल सांद्रता के परिणामस्वरूप (जैसा कि तालिका 1में बोल्ड काले रंग की संख्या में दिखाया गया है)। इसके अलावा, मेथनॉल निष्कर्षण विधि का उपयोग करपता फर कोर्टिसोल की सांद्रता अन्य दो विधियों का उपयोग करके प्राप्त परिणामों की तुलना में अत्यधिक सुसंगत थी (तालिका 1देखें)। इस प्रकार, हम शून्य परिकल्पना स्वीकार करते हैं कि मेथनॉल इथेनॉल और आइसोप्रोपेनोल की तुलना में कोआला फर हार्मोन निष्कर्षण के लिए सबसे उपयुक्त विलायक है।
तालिका 1: कोआला फर के लिए कोर्टिसोल एकाग्रता (एनजी/एमजी) (एन जेड 18) 3 अलग-अलग सॉल्वैंट्स (एथेनोल, आइसोप्रोपेनोल या मेथनॉल) का उपयोग करके निकाला जाता है और कोर्टिसोल एंजाइम-प्रतिरक्षा के तहत कोर्टिसोल मानक वक्र के खिलाफ चलाता है। बोल्ड लाल संख्या इथेनॉल और आइसोप्रोपेनोल अर्क जो परख रेंज से परे थे के लिए असंगत सांद्रता दिखाने (पीजी / बोल्ड काले नंबर फर कोर्टिसोल के लिए सांद्रता मेथनॉल का उपयोग कर निकाले जो कोर्टिसोल मानकों की सीमा के भीतर गिर गया दिखाने के (पीजी / कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
स्तनधारी फर में कोर्टिसोल का पता लगाने के लिए कई तकनीकों का उपयोग करने वाले कई अध्ययन हैं। इस अध्ययन वर्तमान मानवजनित तनाव के संपर्क में एक जंगली कोआला से एकत्र फर में कोर्टिसोल का पता लगाने के लिए परिणाम प्रस्तुत करता है। इस जमीन को तोड़ने के अध्ययन फर का परीक्षण करने के लिए जो तीन आमतौर पर इस्तेमाल सॉल्वैंट्स कोर्टिसोल निकालने में सबसे अच्छा कर रहे हैं इस्तेमाल किया, पुराने तनाव का एक उपाय, कोआला फर से. परिणाम से पता चला कि 100% मेथनॉल स्तनधारी फर के इस प्रकार में कोर्टिसोल निष्कर्षण के लिए सिफारिश की विलायक था.
इथेनॉल, मेथनॉल और आइसोप्रोपेनोल सभी प्राथमिक अल्कोहल हैं जो हाइड्रोजन अणुओं द्वारा आबंधित होते हैं और आमतौर पर हार्मोन निष्कर्षण प्रयोगोंमेंसॉल्वैंट्स के रूप में उपयोग किए जाते हैं। सामान्यतया ध्रुवीय पदार्थ अन्य ध्रुवीय पदार्थों में श्रेष्ठ भंग करते हैं, जबकि गैर ध्रुवीय पदार्थ अन्य गैर ध्रुवीय पदार्थों में श्रेष्ठ भंग करते हैं। मेथनॉल युक्त अल्कोहल समूह बहुत ध्रुवीय होता है, जबकि आइसोप्रोपेनोल युक्त अल्कोहल समूह बहुत गैर-ध्रुवीय होता है। अपनी आणविक निर्माण के कारण, इथेनॉल युक्त शराब समूह दोनों एक ध्रुवीय और गैर ध्रुवीय विलायक होने का लाभ है. कोर्टिसोल जैसे स्टेरॉयड हार्मोन गैर ध्रुवीय माना जाता है, जिसका अर्थ है कि कोर्टिसोल ध्रुवीय सॉल्वैंट्स के साथ एक मजबूत बंधन संबंध होना चाहिए.
कोआला फर में शारीरिक तनाव का आकलन करने के लिए प्रयुक्त निष्कर्षण सॉल्वैंट्स के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए, भावी अनुसंधान परियोजनाओं को चित्र 3में वर्णित उसी क्रम में समान विधियों का प्रयास करना चाहिए। इसी तरह के अध्ययनों ऐतिहासिक22पीसने से पहले धोने प्रदर्शन किया है, ताकि यह सुनिश्चित करने के लिए कोई अनपेक्षित पसीना और / इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि कोर्टिसोल को मापने अकेले पुराने तनाव का एक पूरा संकेत की गारंटी नहीं दे सकते. बाल कोर्टिसोल रीडिंग एक मूल्यवान उपकरण है जब शारीरिक एक जानवर द्वारा अनुभवी तनाव को समझने का प्रयास कर रहे हैं, लेकिन ऊंचा एचपीए गतिविधि शारीरिक व्यायाम सहित शर्तों की एक किस्म के तहत हो सकता है, चयापचय असामान्यताएं और की उपस्थिति संक्रामक रोग22| अन्य महत्वपूर्ण कारक है कि ध्यान में हार्मोन डेटा की मुख्य अखंडता के लिए लिया जाना चाहिए निम्नलिखित शामिल हैं. (1) यादृच्छिक त्रुटि के स्वीकार्य स्तर - आंतरिक नियंत्रण से प्राप्त भिन्नता के गुणांक (CV1 और CV2) करने के लिए औसत किया जाना चाहिए और सभी assays के लिए 15%. (2) नमूना परख के भीतर यादृच्छिक त्रुटि-डुप्लिकेट नमूने प्रत्येक प्लेट पर चलाने के लिए एक CV% होना चाहिए [lt;15%; अन्यथा नमूना फिर से चलाने की आवश्यकता होगी. (3) परख का पता लगाने की सीमा - प्रत्येक परख के भीतर मात्रा निर्धारित हार्मोन की एकाग्रता परख का पता लगाने की सीमा के भीतर होना चाहिए (उच्चतम कमजोर पड़ने और साफ मानक के लिए रीडिंग के बीच); अन्यथा नमूने आगे कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है (यदि नमूनों के लिए पता लगाया स्तर साफ मानक की एकाग्रता से अधिक कर रहे हैं) या परख के भीतर विश्लेषण नहीं किया जा सकता है (यदि नमूने के लिए पता लगाया स्तर उच्चतम पतला की एकाग्रता से कम कर रहे हैं मानक). (4) परख संवेदनशीलता - यह पृष्ठभूमि पढ़ने (गैर विशिष्ट बाइंडिंग) से प्रभावित किया जा सकता है, इसलिए यह परख के लिए गुणवत्ता आश्वासन के उच्चतम स्तर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है (उदाहरण के लिए, प्लेट वॉशर और प्लेट रीडर जैसे उपकरण नियमित रूप से सेवा की जानी चाहिए)। (5) नमूना निकालने सुखाने - इस कदम संभावित पार संदूषण या नमूनों की हानि में परिणाम सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि नमूने व्यक्तिगत रूप से एन2 गैस की भाप के तहत सूखे और प्रत्येक नमूने के बीच निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया पास्चर पिपेट को बदलने के लिए।
चित्रा 3: संकल्पनात्मक प्रवाह आरेख कोआला फर कोर्टिसोल एंजाइम-इम्युनोसे (ईआईए) में शामिल प्रमुख चरणों को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
इस अध्ययन में उल्लिखित प्रक्रिया (चित्र 3) एक है जिसे आसानी से दोहराया जा सकता है क्योंकि यह अपेक्षाकृत आसान है, कदम-दर-कदम पद्धति जिसमें आसानी से उपलब्ध रसायनों, अभिकर्मकों, और उपकरणों के साथ आपूर्ति शामिल होती है जो होने की संभावना है एक मानक विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में पाया. इस अध्ययन के आवेदन दोनों जंगली और बंदी koalas में शारीरिक तनाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक गैर इनवेसिव तकनीक सक्षम बनाता है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम पश्चिमी सिडनी विश्वविद्यालय, विज्ञान और स्वास्थ्य के स्कूल के माध्यम से एडवर्ड नारायण के लिए शुरू अनुसंधान धन के माध्यम से समर्थित किया गया था. लेखक नमूना प्रसंस्करण के साथ सहायता के लिए जैक Nakhoul धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A.
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J.
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
