Summary
コアラ毛からコルチゾールを測定する最適な抽出溶媒を決定するプロトコルを提示する.このプロトコルで使用される溶媒は、メタノール、エタノールおよびイソプロパノールである。最適な抽出溶媒を決定することは、コアラに対する慢性ストレスの影響を決定するために毛皮を確実に測定するのに役立ちます。
Abstract
サンプルタイプ全体の動物のストレスを測定するために使用されるホルモン抽出の最適な方法は、常に同じではありません。オーストラリアの象徴的なマルシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、人為的に誘発されたストレスに長時間さらされ、野生集団における慢性ストレスの評価が緊急に保証されている。慢性ストレスを測定する最も効果的な方法の一つは、生理的および行動的応答をサポートするように、髪や毛皮のグルココルチコイドホルモンコルチゾールを分析することです。本研究室の検証研究は、コアラ毛皮におけるコルチゾールの非侵襲的尺度として使用される最適なホルモン抽出方法を検証するための現在の技術をテストすることを目的としています。ストレスホルモンを測定するために非侵襲的な技術を使用することは、彼らの理想的な実用的かつ倫理的な観点による伝統的な侵襲的な技術よりも好ましいことが認識されています。さらに、コアラから毛皮を採取する方が、血液のサンプルを採取するよりも比較的簡単です。本研究では、アデレードコアラと野生動物病院から取得したコアラ毛皮のサンプルを用いて、最適なコルチゾール抽出法を検証するために、多くのホルモン抽出技術を実行した。結果は、100%メタノールが並列性結果に基づいて100%エタノールまたは100%イソプロパノールと比較して最も最適な溶媒抽出を提供することを示した。結論として、コアラファーからのコルチゾール抽出のこの方法は、コアラの慢性ストレスを研究するために使用することができる信頼性の高い非侵襲的アッセイを提供しました。
Introduction
オーストラリアの生態系は、他の多くの動的相互作用の中で食物や繊維を含むサービスの提供を通じて人間の生活を維持します 1.皮肉なことに、生物多様性の変化を通じた生態系破壊の主な原動力として機能しているのは人間の活動です2。生息地の断片化は、大きな連続的な生息地を互いに隔離された小さな土地のパッチに分割するプロセスとして知られており、オーストラリアの生態系を脅かす大きな人為的生物多様性変化2である。生息地の断片化は、任意の領域における種組成の構造と多様性を変更し、したがって、これらの種が生存可能な集団を維持するために必要な生息地の面積を減少させる2.この結果、食料、燃料、繊維、水3を含む資源の種間の競争が激化しています。生物多様性の変化によるオーストラリアの生態系の破壊は、多くのオーストラリアの在来種1に壊滅的な影響を及ぼしている。
オーストラリアで最も象徴的なマーシャル種であるコアラ(ファスコラルコトス・シネレウス)は、オーストラリアの生態系が生存のために健全なままにしている4に依存している。ヨーロッパの入植地の導入は、彼らが大規模な輸出貿易5で利益を追求するために彼らの毛皮のために虐殺されたので、コアラのオーストラリアの人口の急速な減少を引き起こしました。この慣行は1980年代に禁止され、コアラの集団はその後5を安定させることができました.しかし、人間の人口の指数関数的な成長は、この種が彼らの生息地の多くを競い合う結果となり、その生存は再び脅威6の下にあります。国際自然保護連合(IUCN)によると、オーストラリアのコアラのすべての集団は、人口減少傾向7で絶滅の危機に瀕していると記載されています。このリストは、関連する集団パラメータに関する不確実性と、この種7の人口動向の顕著な変動に起因する。最も象徴的で風土的な動物として、コアラは観光を通じてオーストラリア経済に大きな利益を与えます(NSW環境遺産局2018)。推定によると、コアラ関連の観光業は約9,000人の雇用を生み出し、1.1~25億ドルの経済に貢献している(NSW環境遺産局2018)。任意の1種の除去は壊滅的になる可能性があり、オーストラリア原産の野生生物6の着実な減少に見ることができます。さらに、オーストラリアのコアラの人口が6歳のペースで減少し続けると、オーストラリア経済は影響を感じるだろう。
生息地の断片化に対する死亡および疾患の有病率は、慢性ストレス8の結果であることが示唆される。すでに、オーストラリアでは生息地の断片化により24種が絶滅したと宣言されており、コアラも同様の傾向に従っている8。生息地の断片化と生物学的システムの複雑さは相乗的であるが、応力応答6の分析を通じて解凍することができる。一般的に、動物の自然環境におけるあらゆる妨害は、「戦いまたは飛行」応答9、10として知られている神経ホルモン事象の複雑なカスケードを活性化する。ストレスに対するこの応答は、視床下部下垂体副腎(HPA)軸が活性化される脳で始まるプロセスである 11.視床下部と呼ばれる脳の成分は、コルチコトロフィン放出ホルモン(CRH)を放出し、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)11を放出するために前下垂体に信号を送る。これは順番に副腎髄質からのグルココルチコイド分泌を刺激する。体は血液を通してグルココルチコイドを循環し、これはグリコーゲンからグルコースの貯蔵をそらし、貯蔵されたグリコーゲン11からグルコースを動員する。神経ホルモンイベントのこのカスケードは、予測不可能な刺激11に対処するために動物によって使用される応答である。しかし、グルココルチコイドが放出され、長期間上昇したままである場合、動物は慢性的なストレス12、13を経験していると考えられる。このプロセスは、進行中のグルココルチコイド生産13に必要とされる他の体の機能からエネルギーをそらすことを含む。その結果、慢性的なストレスは、成長、生殖および免疫を禁止することができ、すべてが生存14に必要な主要なフィットネス特性である。
動物のグルココルチコイド産生を測定することは、動物が生理的ストレスを経験しているかどうかを決定するために使用される一般的な指標である15。そうするために、グルココルチコイドは、血漿、血清、唾液、尿または気管16で測定することができる。しかし、証拠は、前述の16とは対照的に、髪が慢性ストレスのはるかに効果的な指標であることを示唆している。これは、髪は、その成長段階の間に血液媒介ホルモンを組み込むと考えられているためです。それは比較的安定しています。そして、髪の中で検出されたコルチゾールは、髪の成長の期間にわたって経験した生理的ストレスを反映し、それは16ヶ月まで数週間することができます。さらに、コルチゾールの任意のコレクションは、捕捉および取り扱いに関連するストレスを最小限に抑えるために非侵襲的であるべきである16.しかし、このイベント中に経験したストレスは、毛髪16のグルココルチコイドレベルに影響を与えないだろう。多くの動物の長期的なストレスを測定するために髪を使用する能力を探求し、トナカイ、グリズリークマ、カゲザル、マスキセン、およびヒグマ17、18、ヒグマに関する研究を含む多くの研究があります。19歳,20歳,21.毛髪コルチゾールは、通常、毛髪の表面に付着した汗および皮脂由来のコルチゾールがコルチゾールと共抽出されず、ビーズビーター22でサンプルを粉砕することを確実にするために試料を最初に洗浄することによって抽出される。洗浄後、サンプルは完全な蒸発22を確実にするために乾燥する必要があります。最後に、溶媒を用いて、試料を抽出し、コルチゾール22のアッセイを容易にするために再構成することができる。毛皮からコルチゾールを抽出するために使用される最も一般的な溶媒は、メタノール21、23です。しかし, 彼らのコルチゾール抽出技術でエタノールとイソプロパノールを使用するいくつかの研究があります。.例えば、エタノールを用いたした研究は、ヒト羊水24からコルチゾールを抽出することに成功した。さらに、イソプロパノールを用いたした研究は、ヒトの毛髪および爪からコルチゾールを抽出することに成功した25,26.このため、本研究では、コアラファーのサンプルからコルチゾールを抽出するのに最も成功した3つの溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール)をすべて試験した。
本研究の主な目的は、コアラの毛皮からのコルチゾールの非侵襲的尺度として使用される最適なホルモン抽出技術を検証するために現在の技術を使用することでした。これは、3つの抽出溶媒(メタノール、エタノール、イソプロパノール)を試験することによって達成された。我々は、メタノールがコアラファーからコルチゾールを抽出するのに使用される最適な溶媒であると仮定した。
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Protocol
このプロジェクトは、厳格な動物と人間のケアガイドラインの下で行われました。動物倫理は、西シドニー大学(A12373)によって付与されました。さらに、この研究を安全に行うために、ウェスタンシドニー大学によってラボリスク評価とバイオセーフティおよび放射線フォームが提出され、受け入れられました(B12366)。
注:このプロジェクトのコアラ毛皮サンプルは、282アンザックハイウェイ、リンプトン南オーストラリアに位置するアデレードコアラと野生動物病院から得られました。毛皮は病院に入院したコアラから採取され、重傷のため安楽死させた。死亡したコアラは死後まもなく遺体袋の中の冷凍庫に保管されていた。死体袋から死んだコアラを取り除いた後、標準的な動物バリカンを使用して首のうなじから1.2gの毛皮を剃りました。毛皮は、皮膚が切断されていないことを確認するために、皮膚にできるだけ近くに剃りました。一度剃ると、死んだコアラはボディバッグに戻され、冷凍庫に入れられました。その後、毛皮をアルミ箔製のパウチに入れ、-20°C以下に保存した。輸送中、毛皮は周囲温度に保たれ、実験室に到着すると、毛皮は-80°Cで貯蔵された。
1. コアラファーコルチゾール抽出
- -80 °Cで貯蔵から毛皮を取り除き、解凍する時間を確保してください。
- 実験室の分析精密バランスの毛皮の重量を量る。
- 毛皮の60mgを予め計量し、ラベル付けされた1.5 mL遠心管に入れ、18本のチューブが充填されるまで繰り返します。
注:この検証スタディには18個の毛皮サブサンプルが使用されました。 - ピペットを使用して各チューブに100%高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)グレードのイソプロパノールを1mL加えます。
- 30sの渦サンプル。
- 液体と毛皮の分離を達成するように0.5ミリメートルマイクロ精密ふるいを使用して各サンプルをひずみます。
- 液体を廃棄物容器に捨てます。
- 各毛皮サンプルをラベル付きプラスチック計量ボートに入れ、真空デシケータに入れ、毛皮を3日間乾燥させます。
- 完全に乾燥したら、ラベル付きの1.5 mLマイクロ遠心管に各サンプルを入れます。
- 各サンプルを3つのクロムスチールビーズ(3.2 mm)でビーズミルに入れ、毎秒30シェイクで2分間粉砕します。
- 最初の抽出技術のピペット1.5mL(100%分析グレードエタノール)を毛皮試料を含む6つの1.5mLマイクロ遠心管に。
- 100%分析グレードメタノールと100%分析グレードのイソプロパノールに対して同じ操作を行い、1.5mLのマイクロ遠心管が充填されるまで行います。
- 各1.5 mLマイクロ遠心分離管をキャップし、3時間シェーカーを使用して一定の脈動で室温(RT)でインキュベートします。
- 0.5 mm マイクロ精密ふるいを使用してサンプルを取り外し、ひずみます。
- 毛皮が適切に廃棄されることを保証しながら、ピペットで新しいラベルの付いた1.5 mLマイクロ遠心チューブに液体を移します。
- ヒューム食器棚の下のN2蒸気の流れの下で完全に乾燥した溶媒抽出物。
- 400μLのアッセイバッファー(市販のコルチゾールキットに設けられている組成物、材料の表を参照)と100%分析グレードのエタノールの100μLを用いて乾燥サンプル抽出物を再構成する。
注: サンプル抽出は -80 で保存できます。
2. 内部統制
- コントロールを作るために、高いホルモンレベルで抽出されたサンプルのプールを作ります。このプールを作るために、ストレッサーへの既知の暴露を持つ動物からサンプルを選択します。例えば、彼らは一般的に高いコルチゾールホルモンレベル6を表示するように、環境外傷から救出されたコアラからサンプルを選択します。
- 抽出プールを作るために、200 μLの総体積が得られるまで、各サンプルから20 μLの抽出物(n = 10)を取ります。抽出プールはアッセイまで-80 Cで貯えることができる。各アッセイで内部統制の低いまたは高い方法でプールを実行します (手順 2.2 を参照)。
- アッセイでは、プールを使用して、それぞれ 70% (C1) と 30% (C2) でバインドする低および高コントロールの在庫を作成します。コルチゾール標準に対する抽出物の並列性グラフから30%および70%の結合点の希釈係数を得る(図1)。サンプルプールの希釈にはアッセイバッファを使用します。たとえば、プール抽出物の 60 μL と 1:2 希釈に対してアッセイ バッファーの 60 μL を使用します。
注:メタノール抽出物の場合、30%結合点はきちんとし、70%の結合点は図1に次のように約1:2であった。したがって、これらはアッセイ内で実行するための内部制御(C1およびC2)の希釈因子を提供した。
3. コアラ毛皮抽出物におけるコルチゾール分析
- 市販のコルチゾールキット(材料の表)を使用し、サンプル、コントロール、コルチゾール規格、非特異的結合ウェル、およびサプライヤーの指示に従って最大結合ウェルを含む96ウェルストリッププレートを設定します。キットブックレットに記載されているプレートレイアウトシートを使用して、プレートマップ上のサンプル、コントロール、および標準の位置を一覧表示します。
注: 結果の精度を高めるために、すべてのサンプル、コントロール、および標準を重複して実行することをお勧めします。 - サンプルを準備します。毛皮ホルモン抽出(セクション1)に従って、100%メタノール抽出コアラファーを得る。
- 試薬を準備します。市販のコルチゾールキットに記載されている手順に従って、(1)アッセイバッファー、(2)洗浄バッファー、および(3)規格(コルチゾールキットに提供される組成物、材料の表)を含む試薬を調用する。
- コルチゾールキットに記載されている指示に従って、ピペ状の50 μLのサンプルまたは標準をプレート内の井戸に入れます。ピペット75 μLおよび50 μLのアッセイバッファーを非特異的結合(NSB)ウェルおよび最大結合(B0またはゼロ標準)ウェルにそれぞれ入れ込みます。
- リピータピペを使用して各ウェルにコルチゾールコンジュゲートの25 μLを追加します。次に、コルチゾール抗体のピペット25μLを各ウェルに、NSBウェルを除く。プレートの側面を軽くタップして、試薬がよく混ざっていることを確認します。
- プレートシーラーでプレートを覆い、軌道シェーカーを使用して室温で1時間(遅速)で振ります。
- プレートシーラーを取り外し、300μLの洗浄バッファーを4回ずつ洗って井戸を吸引します。
- 清潔な吸収性タオルでプレートをタップしてプレートを乾燥させます。
- ピペット100μLのテトラメチルベンザジン(TMB)基板(コルチゾールキットに設けられている組成物、材料の表)を各ウェルに。
- プレートシーラーをウェルプレートに置き、RTで30分間インキュベートします。
- 各井戸に停止溶液のピペット50 μL。
- 450 nmを読み取ることができるプレートリーダーに井戸プレートを置きます。
- 最終的なホルモン濃度を計算するには、pg/mLホルモン濃度に最終抽出量(0.5 mL)を掛け、毛皮サンプル量(60mg)で除算することにより、サンプルのng/mgで最終毛皮コルチゾール濃度を導出します。
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Representative Results
目的のホルモン代謝産物のアッセイ検出は並列処理を用いて決定される。並列化曲線を使用して、50% 結合点は、標準曲線上のサンプル希釈係数も決定します (図1)。並列化グラフ(図1)に示すように、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物は、コルチゾール標準に対する並列変位を提供しなかった。しかしながら、100%メタノール抽出物は、コルチゾール標準に対して並列変位を提供した。乾燥抽出物は、アッセイバッファー(100%エタノールの100μLおよびアッセイバッファーの400μL)で希釈を通してきちんと実行した。
変動のイントラ(内)および間(間)アッセイ係数(CV)は、高(約70%)から決定された低い(約30%)結合サンプル抽出物は、すべてのアッセイで実行されます。並列性グラフ(図1)に基づき、30%(低)結合内部制御はきちんとしたコアラ抽出プールであり、70%(高)結合内部制御は1:2希釈コアラ抽出プールであった。内部の高低の内部統制のCV%は<15%であった。
アッセイ内の誤差幅は、変動のイントラおよびインターアッセイ係数を含む品質管理を使用して決定できます(<15%)。アッセイ感度は、ブランク(ゼロ結合)サンプルの平均応答からの値2標準偏差として計算され、81.26 pg/ウェルとして表された。
図1:コルチゾール酵素免疫アッセイ下のコルチゾール標準曲線に対して3種類の溶媒(100%エタノール、100%イソプロパノールまたは100%メタノール)を用いて抽出したプールコアラ毛皮の並列処理。B/TB は、合計バインディングに対するバインディングのパーセンテージです。シリアル希釈係数(例えば、1:2X平均希釈係数2)は、各規格の濃度と共に設けられている。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
第二に、各溶媒抽出物とコルチゾール標準との関連を回帰プロットを用いて決定した(図2)。図2に示すように、100%メタノール抽出物は、100%エタノールおよび100%イソプロパノール抽出物と比較して最高のR2値で回帰の最良のラインを提供した。
図2:コアラ毛皮を抽出するために使用される3つの溶媒(エタノール、メタノール、イソプロパノール)のそれぞれに対するコルチゾール標準のパーセンテージ結合のための回帰プロット。R2値は、最適適合の行から得られた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
さらに、3つの溶媒のそれぞれを用いて抽出したコアラ毛皮のサブセットをアッセイし、その結果を以下の表1に示す。表1に示すように、コルチゾール標準の観察濃度は2879.61-125.70 pg/ウェルの範囲内であった。エタノールまたはイソプロパノール抽出法はいずれも、いずれかの方法を用いて得られた毛皮抽出濃度がホルモン濃度の非常に高い最小範囲をもたらしたので、結果の一貫性を達成することができなかった(表1の数字を参照)赤色)、コルチゾールアッセイの検出限界を超えていた。しかし、メタノール抽出物は、コルチゾール標準の範囲内でコルチゾール濃度をもたらした(表1の太字の黒い数字に示すように)。さらに、メタノール抽出法を用いて検出された毛皮コルチゾールの濃度は、他の2つの方法を用いて得られた結果と比較して非常に一貫性があった(表1参照)。したがって、我々は、メタノールがエタノールおよびイソプロパノールと比較してコアラ毛皮ホルモン抽出に最も適した溶媒であるという帰無仮説を受け入れる。
表1:コアラファー(n=18)のコルチゾール濃度(ng/mg)を3種類の溶媒(エタノール、イソプロパノールまたはメタノール)を用いて抽出し、コルチゾール酵素免疫アッセイ下でコルチゾール標準曲線に対して実行する。太字の赤色の数字は、アッセイ範囲を超えたエタノールおよびイソプロパノール抽出物に対する一貫性のない濃度を示す(pg/well)。太字の黒い数字は、コルチゾール基準(pg/ウェル)の範囲内に収まったメタノールを使用して抽出された毛皮コルチゾールの濃度を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
哺乳類の毛皮でコルチゾールを検出する技術の範囲を使用する研究の数があります。.本研究は、現在の人為的ストレスにさらされた野生のコアラから採取した毛皮中のコルチゾールの検出に関する結果を提示する。この画期的な研究では、一般的に使用される3つの溶媒のうち、コアラの毛皮から慢性ストレスの尺度であるコルチゾールを抽出するのに最適な方法をテストするために毛皮を使用しました。結果は、100%メタノールがこのタイプの哺乳類毛皮におけるコルチゾール抽出の推奨溶媒であることを示した。
エタノール、メタノールおよびイソプロパノールは、水素分子によって結合され、ホルモン抽出実験28で溶媒として一般的に使用されるすべての一次アルコールである。一般に、極性物質は他の極性物質で最もよく溶解しますが、非極性物質は他の非極性物質で最もよく溶解します。メタノールを含むアルコール群は非常に極性であり、イソプロパノールを含むアルコール群は非常に非極性である。その分子構築のために、エタノールを含むアルコール基は、極性および非極性溶媒の両方であるという利点を有する。コルチゾールなどのステロイドホルモンは非極性と見なされ、コルチゾールは極性溶媒との強い結合関連を持つべきであることを意味する。
コアラ毛皮の生理的ストレスを評価するために使用される抽出溶媒のより包括的な分析のために、将来の研究プロジェクトは、図3に記載されているように、その順序で同じ方法を試みる必要があります。同様の研究は、歴史的に22を粉砕する前に洗浄を行い、意図しない汗および/または皮脂由来のコルチゾールが毛皮サンプルに堆積していないことを確認するために行われている。さらに、コルチゾールを測定するだけでは、慢性ストレスの完全な徴候を保証できないことが重要です。毛髪コルチゾールの測定値は、動物が経験する生理的ストレスを理解しようとする際に貴重なツールですが、HPA活性の上昇は、身体運動、代謝異常および存在を含む様々な条件下で発生する可能性があります。感染症22.ホルモンデータの主な完全性を考慮に入れるべき他の重要な要因は、次のとおりです。(1)許容可能なランダム誤差のレベル - 内部制御(CV1およびCV2)から得られた変動係数は、すべてのアッセイについて<15%に平均する必要があります。(2) サンプルアッセイ内のランダム誤差-各プレートで実行される重複サンプルは、CV%の<15%を持つ必要があります。それ以外の場合は、サンプルを再実行する必要があります。(3)アッセイ検出限界 - 各アッセイ内で定量されたホルモンの濃度は、アッセイ検出限界内にあるべきである(最高希釈ときちんとした標準のための読み取り値の間)。それ以外の場合、サンプルはさらなる希釈を必要とする場合(サンプルに対して検出されたレベルがきちんとした標準の濃度よりも大きい場合)、またはアッセイ内で分析されない場合(サンプルで検出されたレベルが最も希釈された濃度よりも小さい場合)。標準)。(4)アッセイ感度- これはバックグラウンド読み取り(非特異的結合)の影響を受ける可能性があるため、アッセイに対する最高レベルの品質保証を維持することが重要です(例えば、プレートワッシャーやプレートリーダーなどの機器は定期的に整備する必要があります)。(5)サンプル抽出物乾燥 - このステップは、潜在的なクロスコンタミネーションやサンプルの損失につながる可能性があります。サンプルは、N2ガスの蒸気の下で個別に乾燥し、各サンプル間の抽出に使用されるパスツールピペットを交換することをお勧めします。
図3:コアラ毛皮コルチゾール酵素免疫アッセイ(EIA)に関与する主要なステップを示す概念的な流れ図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
本研究(図3)で概説した手順は、比較的簡単に実行できるため、容易に入手可能な化学薬品、試薬、および供給を容易に取り入れたステップバイステップの方法論で簡単に複製できるもので、可能な機器を備えています。標準的な分析実験室で見つけられる。本研究の応用により、野生コアラと捕虜コアラの両方で生理的ストレスを評価するために非侵襲的な技術を用いることを可能にする。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、西シドニー大学、科学衛生学部を通じてエドワード・ナラヤンのスタートアップ研究資金を通じて支援されました。著者は、サンプル処理の支援のためにジャック・ナクールに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
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