Summary
Vi presenterar ett protokoll för att bestämma den optimala extraktionsmedel för att mäta kortisol från Koala päls. De lösningsmedel som används i detta protokoll är metanol, etanol och isopropanol. Bestämning av en optimal extraktion lösningsmedel kommer att hjälpa till att tillförlitligt mäta päls för att avgöra effekterna av kronisk stress på Koalas.
Abstract
Optimala metoder för hormon utvinning används för att mäta stress hos djur över provtyper är inte alltid desamma. Australiens ikoniska pungdjur arter, Koala (Phascolarctos cinereus), ansikten långvarig exponering för antropogena-inducerad stressorer och bedömning av kronisk stress i vilda populationer är brådskande motiverad. Ett av de mest effektiva sätten att mäta kronisk stress är genom att analysera glukokortikoidhormonet kortisol i hår eller päls, eftersom det stöder fysiologiska och beteendemässiga svar. Detta laboratorium validering studie syftar till att testa nuvarande tekniker för att validera en optimal hormon utvinning metod som ska användas som en icke-invasiv åtgärd av kortisol i Koala päls. Det är erkänt att använda icke-invasiva tekniker för att mäta stresshormoner är att föredra framför traditionella, invasiva tekniker på grund av deras ideala praktiska och etiska ståndpunkter. Dessutom är det jämförelsevis lättare att förvärva päls från Koalas än det är att förvärva prover av deras blod. Denna studie används prover av Koala päls förvärvas från Adelaide Koala och Wildlife Hospital för att köra ett antal tekniker hormon utvinning i ett försök att validera en optimal kortisol extraktionsmetod. Resultaten visade att 100% metanol gav den mest optimala vätskeextraktion jämfört med 100% etanol eller 100% isopropanol baserat på parallellitet resultat. Sammanfattningsvis, denna metod för kortisol utvinning från Koala päls som en pålitlig icke-invasiv analys som kan användas för att studera kronisk stress i Koalas.
Introduction
Australiska ekosystem upprätthålla mänskligt liv genom tillhandahållande av tjänster, inklusive mat och fiber bland många andra dynamiska interaktioner1. Ironiskt nog är det mänsklig verksamhet som fungerar som den dominerande föraren av ekosystem störningar genom biologisk mångfald förändring2. Habitat fragmentering, känd som processen att dela upp stora sammanhängande livsmiljöer i små fläckar av mark, isolerade från varandra, är den stora antropogena biologiska mångfalden förändring hotar australiska ekosystem2. Fragmentering av livsmiljöer förändrar strukturen och mångfalden av artsammansättningen i ett visst område, vilket minskar det område av livsmiljö som behövs för dessa arter för att bibehålla livskraftiga populationer2. Resultatet av detta är ökad konkurrens mellan arter för resurser, inklusive mat, bränsle, fiber och vatten3. Förstörelsen av australiska ekosystem genom förändring av den biologiska mångfalden har katastrofala följder för många australiska inhemska arter1.
Australiens mest ikoniska pungdjur arter, Koala (Phascolarctos cinereus), beror på australiska ekosystem förbli friska för sin överlevnad4. Införandet av den europeiska bosättningen orsakade en snabb nedgång i australiska populationer av koalaer, eftersom de slaktades för sina skinn i jakten på vinst i en stor export handel5. Detta övar förbjöds i 1980talet, och befolkningar av Koalas var därefter kompetent att stabilisera5. Emellertid, exponentiell tillväxt av den mänskliga befolkningen har resulterat i denna art konkurrerar om mycket av sin livsmiljö, och deras överlevnad är återigen under hot6. Enligt internationella naturvårdsunionen (IUCN) är alla populationer av australiska Koalas listade som sårbara för utrotning med en minskande befolknings trend7. Denna förteckning tillskrivs osäkerheten kring relevanta populations parametrar och markant variation i befolkningsutvecklingen för denna art7. Som den mest ikoniska och endemiska djur, Koalas gynnar till stor del den australiska ekonomin genom turism (NSW Office of Environment och Heritage 2018). En uppskattning tyder på att Koala relaterad turism har genererat cirka 9 000 arbetstillfällen och bidrar mellan $1,1 och $2 500 000 000 till ekonomin (NSW Office of Environment och Heritage 2018). Avlägsnandet av en art har potential att vara katastrofal, och kan ses i stadig nedgång av infödda australiska djurliv6. Dessutom kommer Australiens ekonomi känna förgreningar om populationer av australiska Koalas fortsätter att sjunka i den takt de är6.
Det föreslås att prevalensen av död och sjukdom som svar på Habitat fragmentering är resultatet av kronisk stress8. Redan, tjugofyra pungdjur arter har förklarats utrotade i Australien på grund av habitat fragmentering, med Koalas efter en liknande trend8. Komplexiteten i Habitat fragmentering och biologiska system är synergistisk men kan packas upp genom analys av stress Response6. I allmänhet, alla störningar i ett djur naturliga omgivningar aktiverar en komplex kaskad av neurohormonella händelser, känd som en "kamp eller flykt" svar9,10. Detta svar på stress är en process som börjar i hjärnan där hypotalamus-hypofys-binjure (HPA) axeln aktiveras11. En del av hjärnan som kallas hypotalamus frigör kortikotropinfrisättande hormon (CRH), som sedan signalerar den främre hypofysen att frigöra adrenokortikotrofiska hormon (ACTH)11. Detta i sin tur stimulerar glukokortikoid sekretion från adrenal medulla. Kroppen cirkulerar glukokortikoider genom blodet, som avskiljer lagring av glukos från glykogen och mobiliserar glukos från lagrad glykogen11. Denna kaskad av neurohormonella händelser är det svar som används av djuret för att hantera oförutsägbara stimuli11. Men när glukokortikoider släpps och förblir förhöjda under en längre tid, djuret anses ha drabbats av kronisk stress12,13. Denna process innebär att avstyra energi från andra kroppslig kroppsfunktioner, eftersom det behövs för pågående glukokortikoidproduktion13. Som ett resultat, kronisk stress kan förbjuda tillväxt, reproduktion och immunitet, alla är viktiga Fitness egenskaper som krävs för överlevnad14.
Att mäta ett djurs glukokortikoidproduktion är en vanlig indikator som används för att avgöra om djuret upplever fysiologisk stress15. För att göra detta kan glukokortikoider mätas i blodplasma, serum, saliv, urin eller avföring16. Emellertid, bevis tyder på att hår är en mycket mer effektiv indikator på kronisk stress, i motsats till de ovan nämnda16. Detta beror på att hår tros införliva blodburna hormoner under sin tillväxtfas; Det är relativt stabilt; och alla kortisol upptäcks i håret återspeglar fysiologiska stress upplevt under perioden av hårväxt, som kan vara veckor fram till månader16. Dessutom bör varje samling av kortisol vara icke-invasiv för att minimera stressen i samband med avskiljning och hantering16. Emellertid, någon stress upplevde under denna händelse skulle inte påverka glukokortikoid nivåer i hår16. Det har varit många studier som utforskar kompetensen att använda hår för att mäta långsiktig stress i ett antal djur, och inkluderar studier på renar, grizzlybjörnar, rhesusapor, muskoxen och brunbjörnar17,18, 19 , 20 , 21. hår kortisol extraheras vanligtvis genom att först tvätta provet för att säkerställa svett och talg-härledda kortisol deponeras på ytan av håret inte samextraheras med kortisol och sedan pulverisera provet i en pärla-beater22. Efter tvättning måste provet torkas för att säkerställa fullständig avdunstning22. Slutligen, med hjälp av ett lösningsmedel, provet kan extraheras och beredas för att underlätta analysen av kortisol22. Det vanligaste lösningsmedlet som används för att utvinna kortisol från päls är metanol21,23; emellertid, det finns vissa studier som använder etanol och isopropanol i deras kortisol utvinning tekniker. Till exempel, en studie som används etanol var framgångsrik för att utvinna kortisol från Human fostervatten24. Dessutom, en studie som används isopropanol var framgångsrik för att utvinna kortisol från människohår och naglar25,26. Av denna anledning, denna studie testade alla tre lösningsmedel (metanol, etanol, och isopropanol) för att avgöra vilken var den mest framgångsrika för utvinning av kortisol från prover av Koala päls.
Det primära syftet med denna studie var att använda nuvarande tekniker för att validera en optimal hormon utvinning teknik som ska användas som en icke-invasiv åtgärd av kortisol från Koala päls. Detta uppnåddes genom att testa tre extraktionsmedel (metanol, etanol och isopropanol). Vi hypotes om att metanol kommer att vara den optimala lösningsmedel som används för att utvinna kortisol från Koala päls eftersom det är den rekommenderade lösningsmedlet för utvinning av Arbor assay kortisol Kits27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta projekt utfördes under strikta riktlinjer för djur-och Human vården. Animal etik beviljades av Western Sydney University (A12373). Dessutom, en Lab riskbedömning och biosäkerhet och strålning form lämnades in och accepteras av Western Sydney University för att säkert genomföra denna forskning (B12366).
Obs: Koala päls prover för detta projekt erhölls från Adelaide Koala och Wildlife Hospital, som ligger på 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Päls togs från en Koala som hade blivit antagen till sjukhuset och euthanized på grund av deras svåra skador. Den avlidne Koala hade lagrats i en frys i en kropps påse strax efter döden. Efter att ha avlägsnat den avlidne Koala från kroppen påsen, 1,2 g päls rakades från nacken med vanliga djur Clippers. Pälsen rakades så nära huden som möjligt, för att säkerställa att huden inte klipptes. En gång rakade, den avlidne Koala sattes tillbaka i kroppen påsen och placeras i frysen. Pälsen placerades sedan i en påse gjord av aluminiumfolie och lagrades under-20 ° c. I transit, pälsen hölls i omgivningstemperatur, och vid ankomsten till laboratoriet, lagrades pälsen vid-80 ° c.
1. Koala päls kortisol utvinning
- Ta bort pälsen från förvaring vid-80 ° c och ge tid att Tina.
- Väga pälsen på ett laboratorium analytisk precisions balans.
- Placera 60 mg av pälsen i ett förvägt och märkt 1,5 mL centrifugrör och upprepa tills 18 rör fylls.
Anmärkning: 18 delprov av päls användes för denna valideringsstudie. - Tillsätt 1 mL 100% högeffektiv vätskekromatografi (HPLC) av isopropanol till varje tub med hjälp av en pipett.
- Vortex prover för 30 s.
- Sila varje prov med en mikroprecisionssil på 0,5 mm för att uppnå separation av vätska och päls.
- Kassera vätskan i en avfallsbehållare.
- Placera varje päls prov i en märkt plast vägning båt, sedan placera i en vakuumexsickator, låt pälsen torka i 3 dagar.
- När den är helt torr, placera varje prov i ett märkt 1,5 mL microcentrifugerör.
- Placera varje prov i en pärlkvarn med 3 kromade stål pärlor (3,2 mm) och pulverisera i 2 min vid 30 skakningar per sekund.
- Pipettera över 1,5 mL av den första extraktionstekniken (100% etanol av analytisk kvalitet) till 6 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller päls provet.
- Utför samma för 100% analytisk kvalitet metanol och 100% analytisk grad isopropanol tills arton 1,5 mL microcentrifug rör fylls.
- Cap varje 1,5 mL microcentrifug rör och inkubera i rumstemperatur (RT) med konstant pulserande med hjälp av en shaker för 3 h.
- Ta bort och sila prover med en 0,5 mm Micro precision SIL.
- Överför vätskan till ett nytt, märkt 1,5 mL microcentrifugetub med pipett och se till att pälsen kasseras på lämpligt sätt.
- Helt torrt lösningsmedelsextrakt under en ström av N2 ånga under ett dragskåp.
- Bered det torkade provextraktet med hjälp av 400 μL analysbuffert (sammansättningen i det kommersiella kortisolkitet, se tabell över material) och 100 μL med 100% etanol av analytisk kvalitet.
Anmärkning: provextrakt kan förvaras vid-80.
2. interna kontroller
- För att göra kontroller, göra en pool av extraherade prover med höga hormonnivåer. För att göra denna pool, Välj prover från djur med känd exponering för stressfaktor. Till exempel, Välj prover från Koalas som har räddats från miljö trauma som de i allmänhet kommer att Visa höga kortisol hormonnivåer6.
- För att göra extraktopoolen, ta 20 μL extrakt från varje prov (n = 10) tills en total volym på 200 μL erhålls. Extraktet poolen kan förvaras vid-80 C tills analyser. Kör poolen i varje analys som låg eller hög interna kontroller (se steg 2,2).
- För analysen, Använd poolen för att göra lager för låga och höga kontroller som binder till 70% (C1) och 30% (C2), respektive. Hämta utspädningsfaktorn för bindnings punkterna 30% och 70% från parallellitet grafen för extraktet mot kortisol-standarden (figur 1). Använd analysbufferten för spädning av exempelpoolen. Använd till exempel 60 μL av poolextraktet och 60 μL analysbuffert för 1:2 spädning.
Anmärkning: för metanol extraktet var 30% bindnings punkt på snyggt medan 70% bindnings punkt var ungefär 1:2 enligt figur 1. Dessa tillhandahöll därför utspädningsfaktorn för de interna kontrollerna (C1 respektive C2) för att köras inom analysen.
3. kortisol analys i Koala päls extrakt
- Använd en kommersiell kortisol Kit (tabell över material) och inrätta 96 väl Strip plattan inklusive proverna, kontroller, kortisol standarder, icke-specifika bindande brunnar, och högsta bindande brunnar enligt leverantörens instruktioner. Använd plattlayoutarket som finns i kit-häftet för att lista positionerna för prover, kontroller och standarder på plattkartan.
Observera: det rekommenderas att alla prover, kontroller och standarder körs i två exemplar för att ge korrekta resultat. - Förbered proverna. Följ päls hormon utvinning (avsnitt 1) för att få 100% metanol extraherade Koala päls.
- Förbered reagenser. Följ proceduren som beskrivs i den kommersiella kortisol kit för att förbereda reagenser inklusive (1) analysbuffert, (2) tvättbuffert, och (3) standarder (kompositioner som tillhandahålls i kortisol kit, tabell över material).
- Enligt instruktionerna i kortisol kit, Pipettera 50 μL av prover eller standarder i brunnar i plattan. Pipet 75 μL och 50 μL analysbuffert i de icke-specifika bindningarna (NSB) och den maximala bindningen (B0 eller noll standard) brunnar.
- Tillsätt 25 μL av kortisol konjugaten till varje brunn med hjälp av en repeater pipet. Därefter Pipettera 25 μL av kortisol-antikroppen i varje brunn, utom NSB-brunnarna. Knacka försiktigt på sidorna av plattan för att säkerställa att reagensen är väl blandade.
- Täck plattan med plattan sealer och skaka i rumstemperatur för 1 h (vid låg hastighet) med hjälp av en orbital shaker.
- Ta bort plattan sealer och aspirera brunnen plattan genom att tvätta varje brunn med 300 μL av tvättbuffert 4 gånger.
- Torka plattan genom att knacka på plattan på rena absorberande handdukar.
- Pipettera 100 μL av tetramethylbenzadine (TMB) substrat (sammansättning som tillhandahålls i kortisol kit, tabell över material) till varje brunn.
- Placera plattan sealer på brunnen plattan och inkubera vid RT i 30 min.
- Pipettera över 50 μL stopplösning till varje brunn.
- Placera brunnen plattan i en Plattläsare som kan läsa 450 nm.
- För att beräkna den slutliga hormon koncentrationen, härleda den slutliga päls kortisol koncentrationen i ng/mg av provet genom att multiplicera PG/mL hormon koncentrationen med den slutliga extrakt volymen (0,5 mL) och dividera med päls provmassan (60 mg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assay detektion av hormon metaboliter av intresse bestäms med hjälp av parallellitet. Med hjälp av en parallellism-kurva bestämmer bindnings punkten på 50% också prov utspädningsfaktorn på standardkurvan (figur 1). Som framgår av parallellitet grafen (figur 1), den 100% etanol och 100% isopropanol extrakt gav inte parallellförskjutning mot kortisol-standarden. Dock gav 100% metanol extraktet parallellförskjutning mot kortisol-standarden. Torkade extrakt kördes snyggt genom utspädning i analysbuffert (100 μL av 100% etanol och 400 μL analysbuffert).
Intra-(within) och Inter-(mellan) analyskoefficienter för variation (CV) bestämdes från hög-(cirka 70%) och låg-(cirka 30%) bindande provextrakt körs i alla analyser. Baserat på parallellitet grafen (figur 1), den 30% (låg) bindande interna kontroller var snyggt Koala extrahera pool medan 70% (hög) bindande interna kontroller var 1:2 utspädd Koala extrahera pool. CV% för intern hög och låg intern kontroll var < 15%.
Felmarginalen inom analysen kan bestämmas med hjälp av kvalitetskontroll, inklusive koefficienterna för intra-och Inter-analyskoefficienter, som bör vara < 15%. Analysens känslighet beräknades som värdet 2 standardavvikelser från medelvärdet av de tomma (nollbindande) proverna och uttrycks som 81,26 PG/well.
Figur 1: parallellitet av poolade Koala päls extraheras med 3 olika lösningsmedel (100% etanol, 100% isopropanol eller 100% metanol) mot kortisol standardkurva under en kortisol enzym-immunoassay. B/TB är den procentuella bindningen över den totala bindningen. Den seriella utspädningsfaktorn (t. ex. 1:2X genomsnittlig utspädningsfaktor 2) har tillhandahållits tillsammans med koncentrationen av varje standard. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
För det andra bestämdes sambandet mellan varje lösningsmedelsextrakt och kortisolstandard med hjälp av en Regressions plan (figur 2). Som visas i figur 2, den 100% metanol extrakt som den bästa regressionslinjen med det högsta R2 -värdet jämfört med 100% etanol och 100% isopropanol extrakt.
Figur 2: Regressions diagram för procentuell bindning av kortisol-standarden mot var och en av de 3 lösningsmedel (etanol, metanol och isopropanol) som används för att extrahera Koala päls. R2 -värdet erhölls från raden för bästa passning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vidare, underuppsättning av Koala päls extraheras med var och en av de tre lösningsmedel var analyseras och resultaten finns i tabell 1 nedan. Som framgår av tabell 1, den observerade koncentrationen av kortisol standard var inom intervallet 2879.61-125.70 PG/well. Varken etanol eller isopropanol extraktionsmetod kan uppnå konsekvens i resultatet som päls extrakt koncentrationer som erhållits med någon av metoderna resulterade i mycket hög min-max intervall av hormon koncentrationer (se tabell 1 nummer markerade i rött), som var bortom detektionsgränsen för kortisolanalysen. Emellertid, metanol extrakt resulterade i kortisolkoncentrationer inom intervallet av kortisol-standarden (som visas i fet svart siffror i tabell 1). Dessutom var koncentrationerna av päls kortisol som upptäcktes med hjälp av metoden för extraktion med metanol mycket konsekventa jämfört med de resultat som erhållits med hjälp av de andra två metoderna (se tabell 1). Således accepterar vi nollhypotesen att metanol är den lämpligaste spädningsvätskan för Koala päls hormon utvinning jämfört med etanol och isopropanol.
Tabell 1: kortisol koncentrationen (ng/mg) för Koala Fur (n = 18) extraheras med 3 olika lösningsmedel (etanol, isopropanol eller metanol) och kör mot kortisol standardkurva under en kortisol enzym-immunoassay. Djärva röda siffror visar inkonsekventa koncentrationer för etanol och isopropanol-extrakt som ligger utanför analysområdet (PG/well). Fet svart siffror visar koncentrationerna för päls kortisol extraheras med metanol som föll inom intervallet av kortisol standarder (PG/well). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ett antal studier som använder en rad olika tekniker för att detektera kortisol i päls av däggdjur. Denna studie presenterar resultat för detektion av kortisol i päls som samlats in från en vild Koala utsätts för nuvarande antropogena stress. Denna banbrytande studie används päls för att testa vilken av de tre vanliga lösningsmedel är bäst på att utvinna kortisol, ett mått på kronisk stress, från Koala päls. Resultaten visade att 100% metanol var den rekommenderade spädningsvätskan för kortisolextraktion i denna typ av däggdjurs päls.
Etanol, metanol och isopropanol är alla primära alkoholer som är bundna av vätemolekyler och används ofta som lösningsmedel i hormon utvinning experiment28. I allmänhet löser polära ämnen bäst i andra polära ämnen, medan icke-polära substanser upplöses bäst i andra icke-polära substanser. Alkohol gruppen som innehåller metanol är mycket polär, medan alkohol gruppen som innehåller isopropanol är mycket icke-polär. På grund av sin molekylära build, alkohol grupp som innehåller etanol har fördelen av att vara både en Polar och icke-polära lösningsmedel. Steroidhormoner som kortisol anses icke-polära, vilket innebär att kortisol bör ha en stark bindning Association med Polar lösningsmedel.
För en mer omfattande analys av extraktionsmedel som används för att bedöma fysiologisk stress i Koala päls, bör framtida forskningsprojekt försöka identiska metoder i den ordningen som beskrivs i figur 3. Liknande studier har historiskt utfört tvätt innan slipning22, för att säkerställa att det inte finns någon oavsiktlig svett och/eller talg härledda kortisol deponeras i päls provet. Dessutom är det viktigt att mäta kortisol ensamt inte kan garantera en fullständig indikation på kronisk stress. Hår kortisol avläsningar är ett värdefullt verktyg när man försöker förstå fysiologiska stress upplevs av ett djur, men förhöjd HPA aktivitet kan inträffa under en mängd olika förhållanden inklusive fysisk träning, metabola avvikelser och närvaron av infektionssjukdom22. Andra viktiga faktorer som bör beaktas för den huvudsakliga integriteten av hormon data inkluderar följande. (1) godtagbar nivå av slumpmässigt fel-koefficienterna för variation som erhålls från den interna kontrollen (CV1 och CV2) bör i genomsnitt uppgå till < 15% för alla analyser. (2) slumpmässigt fel inom provanalys-dubbletter prover som körs på varje platta bör ha en CV% av < 15%; annars kommer provet att behöva köras på nytt. (3) assay Detection gräns-koncentration av hormon som kvantifierats inom varje analys bör vara inom analysen detektionsgränsen (mellan avläsningar för högsta utspädning och snygg standard); i annat fall kan prover kräva ytterligare spädning (om halter som upptäcks för prover är större än koncentrationen av snygg standard) eller inte kan analyseras inom analysen (om halter som upptäcks för prover är lägre än koncentrationen av den högsta utspädda standard). (4) analysens känslighet-detta kan påverkas av bakgrunds läsning (icke-specifik bindning), därför är det viktigt att bibehålla den högsta nivån av kvalitetssäkring för analysen (t. ex. utrustning som plattbricka och Plattläsare måste underhållas regelbundet). (5) provextrakt torkning-detta steg kan resultera i potentiell korskontaminering eller förlust av prover. Det rekommenderas att proverna torkas under ånga av N2 -gas individuellt och för att ersätta den Pasteur-pipett som används för extraktion mellan varje prov.
Figur 3: konceptuella flödesdiagram som visar de viktigaste stegen som ingår i Koala Fur kortisol enzym-immunoassay (EIA). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det förfarande som beskrivs i denna studie (figur 3) är en som lätt kan replikeras eftersom det är relativt lätt att utföra, steg-för-steg-metoder som innehåller lätt tillgängliga kemikalier, reagenser och tillbehör med utrustning som sannolikt kommer att vara finns i ett standardiserat analytiskt laboratorium. Tillämpningen av denna studie möjliggör en icke-invasiv teknik som skall användas för att bedöma fysiologiska stress i både vilda och fångenskap koalaer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes genom start-up forskningsanslag för Edward Narayan genom Western Sydney University, School of Science and Health. Författarna tackar Jack Nakhoul för hjälp med provbehandling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
References
- Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
- Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
- Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
- MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
- Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
- Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
- Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
- Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
- Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
- Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
- Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
- McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
- Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
- Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
- Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
- Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
- Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
- Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
- Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
- Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
- Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
- Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
- Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
- Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
- Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
- Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
- Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).
