Summary
我们提出了一个协议，以确定最佳提取溶剂，以测量皮质醇从考拉毛皮。该协议中使用的溶剂是甲醇、乙醇和异丙醇。确定最佳萃取溶剂将有助于可靠地测量毛皮，以确定慢性应力对考拉的影响。
Abstract
用于测量不同样本类型动物压力的激素提取的最佳方法并不总是相同的。澳大利亚标志性的猎物物种，考拉（Phascolarctoscinereus），面临长期暴露在人为引起的压力和评估长期压力在野生种群是迫切需要的。测量慢性压力的最有效方法之一是通过分析头发或毛皮中的糖皮质激素皮质醇，因为它支持生理和行为反应。该实验室验证研究旨在测试当前技术，以验证最佳激素提取方法，作为考拉毛皮中皮质醇的非侵入性测量。人们认识到，使用非侵入性技术测量压力激素是首选，而不是传统的侵入性技术，由于其理想的实用和道德立场。此外，从考拉获得毛皮比获取考拉血液样本要容易得多。这项研究使用从阿德莱德考拉和野生动物医院获得的考拉毛皮样本，运行一些激素提取技术，试图验证最佳皮质醇提取方法。结果表明，100%甲醇提供的最佳溶剂萃取，而100%乙醇或100%异丙醇基于平行结果。总之，这种从考拉毛皮中提取皮质醇的方法提供了一种可靠的非侵入性检测，可用于研究考拉的慢性压力。
Introduction
澳大利亚的生态系统通过提供包括食物和纤维在内的许多其他动态相互作用的服务来维持人类生命1。具有讽刺意味的是，人类活动是生态系统通过生物多样性变化破坏的主要驱动力。生境破碎，即将大型连续生境分割成小块土地的过程，彼此隔绝，是威胁澳大利亚生态系统的主要人为生物多样性变化2。生境破碎改变了任何特定地区物种构成的结构和多样性，从而减少了这些物种维持生存种群所需的栖息地面积2。其结果是物种之间对食物、燃料、纤维和水等资源的竞争加剧。生物多样性变化对澳大利亚生态系统的破坏正在对许多澳大利亚本土物种1造成灾难性后果。
澳大利亚最具代表性的猎物物种，考拉（Phascolarctoscinereus），取决于澳大利亚的生态系统保持健康，以生存4。欧洲定居的引入导致澳大利亚考拉的数量迅速减少，因为考拉在大型出口贸易中为了追求利润而被宰杀。这种做法在20世纪80年代被禁止，考拉的数量随后得以稳定。然而，人类的指数级增长导致这个物种争夺大部分栖息地，它们的生存再次受到威胁。根据国际自然保护联盟（IUCN）的数据，澳大利亚考拉的所有种群都被列为易灭绝种群，种群数量呈下降趋势。这个清单归因于相关种群参数的不确定性和该物种7种群趋势的明显变化。作为最具代表性和地方性的动物，考拉主要通过旅游业为澳大利亚经济带来益处（新南威尔士州环境与遗产办公室，2018年）。据估计，与考拉有关的旅游业创造了约9，000个就业机会，为经济贡献了11亿至25亿美元（新南威尔士州环境与遗产办公室，2018年）。任何一个物种的灭绝都有可能是灾难性的，这可以从澳大利亚本土野生动物的稳步减少中看。此外，如果澳大利亚考拉的数量继续以6.的速度下降，澳大利亚经济将感受到影响。
有人认为，由于栖息地破碎，死亡和疾病的流行是慢性压力8的结果。在澳大利亚，已有24种猎物因栖息地破碎而宣布灭绝，其中考拉也呈类似趋势。生境破碎和生物系统的复杂性是协同的，但可以通过分析应力响应6来解压缩。一般来说，动物自然环境中的任何干扰都会激活一系列复杂的神经激素事件，称为"战斗或逃跑"反应9，10。这种对压力的反应是一个过程，开始在大脑中下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴被激活11。大脑中一种叫做下丘脑的成分释放皮质素释放激素（CRH），然后发出信号前脑垂体释放腺皮质激素（ACTH）11。这反过来又刺激从肾上腺髓质分泌物。身体通过血液循环糖皮质激素，这转移了糖原的葡萄糖储存，并从储存的糖原11中调动葡萄糖。这种神经激素事件级联是动物用来处理不可预测的刺激11的反应。然而，当糖皮质激素被释放，并保持长期升高，动物被认为是经历慢性压力12，13。这个过程涉及转移能量从其他身体机能，因为它是需要正在进行的糖皮质激素生产13。因此，慢性压力会阻碍生长、繁殖和免疫，所有这些都是生存所需的关键健身特征。
测量动物的糖皮质激素生产是一个常见的指标，用来确定动物是否正在经历生理压力15。为此，糖皮质激素可以在血浆、血清、唾液、尿液或粪便中测量16。然而，有证据表明，与上述16相反，头发是慢性压力的更有效指标。这是因为头发被认为在生长阶段含有血液传播的激素;相对稳定;在头发中检测到的任何皮质醇都会反映头发生长期间经历的生理压力，这种压力可能是数周到16个月。此外，任何皮质醇的集合应该是非侵入性的，以尽量减少与捕获和处理16相关的压力。然而，在这次事件期间经历的任何压力不会影响头发16的糖皮质激素水平。有许多研究探索使用头发测量一些动物的长期压力的能力，包括研究驯鹿，灰熊，河河猴，木牛和棕熊17，18，19,20,21.头发皮质醇通常通过先洗样品来提取，以确保沉积在头发表面的汗液和皮脂衍生皮质醇不与皮质醇共同提取，然后用珠状物22粉碎样品。洗涤后，样品需要干燥，以确保完全蒸发22。最后，使用溶剂，可以提取和重组样品，以利于皮质醇22的测定。用于从毛皮中提取皮质醇的最常见溶剂是甲醇21，23;然而，有一些研究使用乙醇和异丙醇在他们的皮质醇提取技术。例如，一项使用乙醇的研究成功地从人类羊水中提取皮质醇24。此外，一项使用异丙醇的研究成功地从人类头发和指甲中提取皮质醇25，26。因此，本研究测试了所有三种溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇），以确定哪种溶剂是从考拉毛皮样本中提取皮质醇最成功的。
本研究的主要目的是使用当前技术来验证最佳激素提取技术，作为考拉毛皮皮质醇的非侵入性测量。这是通过测试三种萃取溶剂（甲醇、乙醇和异丙醇）实现的。我们假设甲醇将是从考拉毛皮中提取皮质醇的最佳溶剂，因为它是Arbor测定皮质醇试剂盒27推荐的萃取溶剂。
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Protocol
这个项目是在严格的动物和人类护理准则下进行的。动物伦理由西悉尼大学（A12373）授予。此外，西悉尼大学提交并接受了实验室风险评估和生物安全和辐射表格，以安全地开展此项研究 （B12366）。
注：该项目的考拉毛皮样本来自阿德莱德考拉和野生动物医院，位于南澳大利亚普林普顿安扎克公路282号。毛皮是从一只考拉那里取出的，由于伤势严重，它被送进了医院并安乐死。死者考拉在死亡后不久被存放在一个尸体袋内的冰柜里。将死去的考拉从尸体袋中取出后，用标准动物剪子从颈部的尿布上切下1.2克的毛皮。毛皮被切得尽可能靠近皮肤，以确保皮肤不被割伤。一旦被包了，死去的考拉被放回尸体袋，放在冰箱里。然后，毛皮被放置在一个铝箔制成的袋中，并储存在-20°C以下。在运输过程中，毛皮被保存在环境温度，到达实验室后，毛皮被储存在-80°C。
1. 考拉毛皮皮质醇提取
- 在-80°C下从储存中去除毛皮，并留出解冻时间。
- 在实验室分析精度平衡上称量毛皮。
- 将 60 毫克的毛皮放入预称重并贴上 1.5 mL 标签的离心管中，并重复，直到 18 管充满。
注：18个毛皮子样本用于此验证研究。 - 使用移液器将 1 mL 的 100% 高性能液相色谱 （HPLC） 级异丙醇添加到每个管中。
- 涡流样本为30s。
- 使用 0.5 mm 微精密筛对每个样品进行应变，以实现液体和毛皮的分离。
- 将液体丢弃到废物容器中。
- 将每个毛皮样品放入贴有标签的塑料称重船中，然后放入真空干燥器中，让毛皮干燥 3 天。
- 完全干燥后，将每个样品放入标有 1.5 mL 的微离心管中。
- 将每个样品放入带有 3 个镀铬钢珠（3.2 mm）的珠子磨机中，以每秒 30 次摇动的速度粉碎 2 分钟。
- 移液器1.5 mL的第一次萃取技术（100%分析级乙醇）放入6个含有毛皮样品的1.5 mL微离心管中。
- 对100%分析级甲醇和100%分析级异丙醇执行相同的工作，直到18个1.5 mL微离心管被填充。
- 将每个 1.5 mL 微离心管盖上，在室温 （RT） 下孵育，使用摇床进行恒定的脉动 3 小时。
- 使用 0.5 mm 微精密筛去除和应变样品。
- 将液体转移到新的，标有1.5 mL的微离心管与移液器，同时确保毛皮被适当丢弃。
- 完全干燥的溶剂提取物下N2蒸气流下烟气柜。
- 使用400μL的测定缓冲液（商业皮质醇试剂盒中的成分;见材料表）和100μL100%分析级乙醇重组干样品提取物。
注：样品提取物可存储在-80 。
2. 内部控制
- 要进行控制，制作一个提取的具有高激素水平的样本池。要制作此池，请从已知暴露于压力器的动物中选择样本。例如，从从环境创伤中获救的考拉选择样本，因为它们通常显示高皮质醇激素水平6。
- 要制作提取物池，请从每个样品（n = 10）中提取 20 μL 的提取物，直到获得 200 μL 的总体积。提取池可以储存在-80C，直到测定。在每个测定中将池运行为低或高内部控制（请参阅步骤 2.2）。
- 对于测定，使用池使股票的低和高控制，分别绑定在70%（C1）和30%（C2）。从提取物的平行图中获取与皮质醇标准相比的30%和70%结合点的稀释系数（图1）。使用测定缓冲液稀释样品池。例如，使用 60 μL 的池提取物和 60 μL 的测定缓冲液进行 1：2 稀释。
注：对于甲醇提取物，30%的装订点是整齐的，而70%的绑定点大约是1：2，如图1所示。因此，这些为内部控制（分别C1和C2）提供了在测定中运行的稀释系数。
3. 考拉毛皮提取物中的皮质醇分析
- 使用商业皮质醇套件（材料表），按照供应商的指示设置 96 孔带板，包括样品、控制、皮质醇标准、非特定结合孔和最大装订孔。使用套件手册中提供的板布局图列出板图上的样品、控件和标准的位置。
注： 建议所有样本、控件和标准重复运行，以允许结果的准确性。 - 准备样品。按照毛皮激素提取（第1节）获得100%甲醇提取考拉毛皮。
- 制备试剂。按照商业皮质醇试剂盒中描述的步骤制备试剂，包括（1）测定缓冲液，（2）洗涤缓冲液和（3）标准（皮质醇试剂盒中提供的成分，材料表）。
- 根据皮质醇试剂盒中提供的说明，将 50 μL 样品或标准移入板中的孔中。移液75μL和50μL的测定缓冲液分别进入非特异性结合（NSB）井和最大结合（B0或零标准）井。
- 使用中继器移液器将 25 μL 的皮质醇结合添加到每个孔中。然后将皮质醇抗体的25μL移液到每个井中，但NSB井除外。轻轻敲击板的两侧，确保试剂混合良好。
- 用板封住器盖住板，在室温下使用轨道摇床摇动 1 小时（低速）。
- 取出板式印瓶器，用300μL的洗涤缓冲液清洗每个孔，吸气孔板4次。
- 在干净的吸水毛巾上敲击盘子，擦干盘子。
- 移液器 100 μL 的四甲基苯甲酸 （TMB） 基质（在皮质醇试剂盒中提供的成分，材料表）到每个井。
- 将板式印在井板上，在 RT 下孵育 30 分钟。
- 移液器 50 μL 的停止溶液到每个井。
- 将孔板放入能够读取 450 nm 的板式读卡器中。
- 要计算最终激素浓度，通过将 pg/mL 激素浓度与最终萃取量 （0.5 mL） 相乘，除以毛皮样本质量 （60 mg）， 得出样品的纳克/mg 的最终毛皮皮质醇浓度。
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Representative Results
使用平行性测定感兴趣的激素代谢物的检测。使用平行曲线，50% 结合点还确定标准曲线上的样品稀释系数（图 1）。如平行图（图1所示），100%乙醇和100%异丙醇提取物没有提供与皮质醇标准的平行位移。然而，100%甲醇提取物提供与皮质醇标准的平行位移。干提取物在测定缓冲液（100%乙醇100μL和400μL测定缓冲液）中通过稀释进行整齐地运行。
内（内）和之间（之间）变异测定系数（CV）由高（约70%）确定和低（约30%）绑定样本提取物在所有测定中运行。根据并行图（图1），30%（低）结合内部控制是整洁的考拉提取物池，而70%（高）绑定内部控制是1：2稀释考拉提取物池。内部高低内部控制的 CV% 为 <15%。
测定中的误差幅度可以使用质量控制来确定，包括变异的内测定系数和误差系数，应为 <15%。Assay 灵敏度计算为与空白（零绑定）样本的平均响应值 2 标准差，并表示为 81.26 pg/well。
图1：使用3种不同溶剂（100%乙醇、100%异丙醇或100%甲醇）在皮质醇酶免疫测定下对皮质醇标准曲线提取的池考拉毛皮的平行性。B/TB 是绑定在总绑定量中的百分比。串行稀释系数（例如，1：2倍均度稀释系数为2）与每个标准的浓度一起提供。请点击此处查看此图的较大版本。
其次，使用回归图确定每种溶剂提取物与皮质醇标准之间的关联（图2）。如图2所示，100%甲醇提取物提供了与100%乙醇和100%异丙醇提取物相比，具有最高R2值的回归线。
图2：皮质醇标准与用于提取考拉毛皮的3种溶剂（乙醇、甲醇和异丙醇）各结合百分比的回归图。R2值是从最佳拟合线获得的。请点击此处查看此图的较大版本。
此外，对使用三种溶剂中每一种提取的考拉毛皮子集进行了测定，结果如下表1所示。如表1所示，观察到的皮质醇标准浓度在2879.61-125.70皮克/井范围内。乙醇或异丙醇提取方法都不能在结果中达到一致，因为使用这两种方法获得的毛皮提取物浓度导致非常高的最小-最大激素浓度范围（参见表1标记的数字）红色），超出皮质醇检测的检测限制。然而，甲醇提取物导致皮质醇浓度在皮质醇标准范围内（如表1中的黑体黑数所示）。此外，使用甲醇提取方法检测的皮质醇浓度与其他两种方法获得的结果高度一致（见表1）。因此，我们接受一个零假设，即甲醇是最适合提取考拉毛皮激素的溶剂，而乙醇和异丙醇则适用。
表1：使用3种不同溶剂（乙醇、异丙醇或甲醇）提取的考拉毛皮皮质醇浓度（ng/mg），在皮质醇酶免疫测定下与皮质醇标准曲线运行。粗体红色数字显示乙醇和异丙醇提取物的浓度不一致，超出测定范围（pg/well）。粗体黑色数字显示使用甲醇提取的皮质醇的浓度，该浓度在皮质醇标准（pg/well）范围内。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
有许多研究使用一系列技术来检测哺乳动物毛皮中的皮质醇。这项研究提供了检测皮质醇在毛皮收集的结果，从野生考拉暴露于当前人为应力。这项开创性的研究使用毛皮来测试三种常用溶剂中哪一种最适合从考拉毛皮中提取皮质醇（一种慢性压力的测量指标）。结果表明，100%甲醇是此类哺乳动物毛皮中皮质醇提取的推荐溶剂。
乙醇、甲醇和异丙醇都是氢分子结合的原发性醇，在激素提取实验中常用作溶剂28。一般来说，极性物质在其他极性物质中溶解最好，而非极性物质在其他非极性物质中溶解最好。含有甲醇的酒精组非常极性，而含有异丙醇的酒精组是非常非极性的。由于其分子构造，含乙醇的醇组具有极性和非极性溶剂的优点。类固醇激素，如皮质醇被认为是非极性，这意味着皮质醇应具有与极性溶剂的强烈结合。
为了更全面地分析用于评估考拉毛皮生理压力的萃取溶剂，未来的研究项目应尝试如图3所述的相同方法。类似的研究历来在磨削22之前进行洗涤，以确保没有意外的汗水和/或皮脂衍生的皮质醇沉积到毛皮样品中。此外，仅测量皮质醇并不能保证慢性压力的完整指示，这一点很重要。头发皮质醇读数是一个有价值的工具，当试图了解动物经历的生理压力，但HPA活动升高可能发生在各种条件下，包括体育锻炼，代谢异常和存在传染病22。激素数据的主要完整性应考虑的其他重要因素包括以下内容。（1） 可接受的随机误差水平 - 从内部控制（CV1 和 CV2）获得的变异系数应平均为 <15%（2） 样本测定中的随机误差 – 在每个板上运行的重复样本应具有 <15% 的 CV%;否则，需要重新运行示例。（3） 测定检测限值 - 每个测定中定量的激素浓度应在测定检测限值内（最高稀释读数和整洁标准读数之间）;否则样品可能需要进一步稀释（如果检测到的样品浓度大于整洁标准的浓度），或者可能无法在检测中进行分析（如果检测到样品的浓度低于最高稀释浓度的浓度）标准）。（4） 检测灵敏度 - 这可能受背景读数（非特定绑定）的影响，因此，对于检测保持最高级别的质量保证非常重要（例如，必须定期维修板式洗盘器和板式读卡器等设备）。（5） 样品提取物干燥 - 此步骤可能导致样品潜在的交叉污染或丢失。建议在N2气体的蒸汽下单独干燥样品，并更换用于在每个样品之间提取的巴斯德移液器。
图3：概念流程图，显示考拉毛皮皮质醇酶-免疫测定（EIA）中涉及的关键步骤。请点击此处查看此图的较大版本。
本研究（图3）中概述的程序是一个易于复制的过程，因为它相对容易执行，分步方法，包括现成的化学品、试剂和耗材，设备可能在标准分析实验室找到。这项研究的应用使得非侵入性技术能够用于评估野生和圈养考拉的生理压力。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作通过西悉尼大学科学与健康学院的启动研究资金为爱德华·纳拉扬提供支持。作者感谢杰克·纳胡尔在样品处理方面给予的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
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