Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הקורטיזול מדידה קואלה (פאיסקולארקטוס cinereus) פרווה

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59216
Automatic Translation
1, 1
1School of Science and Health, Western Sydney University

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע את ממיס החילוץ אופטימלית כדי למדוד קורטיזול מפרווה קואלה. הממיסים המשמשים בפרוטוקול זה הם מתנול, אתנול ו איזופנול. קביעת הממס החילוץ אופטימלית יסייע מדידה מהימנה הפרווה כדי לקבוע את ההשפעה של לחץ כרוני על koalas.

Abstract

שיטות אופטימליות של חילוץ הורמון המשמש למדידת הלחץ בבעלי חיים על פני סוגים לדוגמה אינם תמיד אותו הדבר. מינים של חיות כיס איקוני של אוסטרליה, הקואלה (Phascolarctos cinereus), פנים חשיפה ממושכת לתוך אנתרופוגניים המושרה מתחים והערכה של מתח כרוני באוכלוסיות בר מוצדקת בדחיפות. אחת הדרכים היעילות ביותר למדוד לחץ כרוני היא באמצעות ניתוח קורטיזול הורמון glucocorticoid בשיער או פרווה, כפי שהוא תומך בתגובות פיסיולוגיים והתנהגותיים. מחקר זה אימות מעבדה שואפת לבדוק את הטכניקות הנוכחיות כדי לאמת את שיטת חילוץ הורמון אופטימלי לשמש כמדד לא פולשני של הקורטיזול פרווה קואלה. הוא מוכר כי באמצעות טכניקות שאינן פולשני כדי למדוד הורמונים לחץ הוא המועדף על טכניקות מסורתיות, פולשנית בשל האידיאל שלהם מעשיים ואתית נקודות. בנוסף, קל יחסית לרכוש פרווה מ koalas מאשר להשיג דגימות של הדם שלהם. מחקר זה השתמשו בדגימות של פרווה קואלה רכשה מ קואלה אדלייד וחיות הבר בבית החולים כדי להפעיל מספר טכניקות חילוץ הורמונים בניסיון לאמת שיטה אופטימלית החילוץ קורטיזול. תוצאות הראו כי 100% מתנול סיפק את החילוץ האופטימלי ביותר הממס בהשוואה 100% אתנול או 100% איזופנול מבוסס על תוצאות ההקבלה. לסיכום, שיטה זו של מיצוי הקורטיזול מפרווה קואלה סיפק הספק אמין לא פולשני שניתן להשתמש כדי ללמוד לחץ כרוני koalas.

Introduction

מערכות האקולוגיות האוסטרליות מפעילות את חיי האדם באמצעות אספקת שירותים כולל מזון וסיבים בקרב אינטראקציות דינמיות רבות אחרות1. באופן אירוני, זוהי פעילות אנושית הפועלת כנהג דומיננטי של שיבוש המערכת האקולוגית באמצעות שינוי מגוון המינים2. פיצול הביטאט, הידוע כתהליך חלוקת בתי גידול גדולים לתוך כתמי קרקע קטנים, מבודדים זה מזה, הוא שינוי המגוון הביולוגי העיקרי של המינים האוסטרלי מאיים על הסביבה האוסטרלית2. פיצול הביטאט משנה את המבנה והגיוון של הרכב המינים בכל אזור נתון, ובכך מקטין את שטח הגידול הדרוש למינים אלה כדי לשמור על אוכלוסיות קיימא2. התוצאה של התחרות מוגברת בין מינים למשאבים, כולל מזון, דלק, סיבים ומים3. הרס האקולוגית האוסטרלי באמצעות שינוי במגוון המינים הוא בעל השלכות קטסטרופיות על מינים רבים של הילידים האוסטרליים1.

מינים חיות הכיס האיקוני ביותר של אוסטרליה, קואלה (Phascolarctos cinereus), תלוי האקולוגית האוסטרלי הנותרים בריאים עבור ההישרדות שלהם4. הכנסת ההתנחלות האירופאית גרמה לירידה מהירה באוכלוסיית הקואלאס האוסטרלית, כפי שנשחטו בגלל העורות שלהם במרדף אחר רווח בסחר יצוא גדול5. פרקטיקה זו נאסרה בשנת 1980 ובאוכלוסיות של קואלאס הצליחו לייצב את5. עם זאת, הצמיחה האקספוננציאלית של האוכלוסייה האנושית הביאה למין הזה מתחרה על הרבה מסביבתם, וההישרדות שלהם שוב תחת איום6. על-פי האיחוד הבינלאומי לשימור הטבע (IUCN), כל האוכלוסיות של הקואלאס האוסטרלי מפורטות כחשופות להכחדה במגמה להפחתת האוכלוסיה7. רישום זה מיוחס לחוסר הוודאות סביב הפרמטרים הרלוונטיים של האוכלוסיה והווריאציה המסומנת במגמות האוכלוסייה עבור זן זה7. כבעלי החיים האיקוניים והאנדמיים ביותר, קואלאס מרוויח במידה רבה את הכלכלה האוסטרלית דרך התיירות (משרד הסביבה והמורשת 2018). הערכה מרמזת כי התיירות הקשורות קואלה יצרה כ 9,000 משרות ותורם בין $1.1 ו $2,500,000,000 לכלכלה (משרד הסביבה והמורשת של המשרד 2018). הסרת כל מין אחד יש את הפוטנציאל להיות קטסטרופלי, וניתן לראות את הירידה המתמדת של חיות הבר האוסטרלי מקורי6. בנוסף, הכלכלה באוסטרליה ירגיש את ההשלכות אם אוכלוסיות של קואלאס האוסטרלי ממשיכים לרדת בקצב שהם6.

הוא הציע כי שכיחות של מוות ומחלות בתגובה לפיצול הגידול היא תוצאה של לחץ כרוני8. כבר, עשרים וארבע מינים של חיות כיס הוכרזו נכחדו באוסטרליה בשל הפיצול הגידול, עם koalas בעקבות מגמה דומה8. המורכבות של הפיצול בבית הגידול ומערכות ביולוגיות הוא סינגיסטי אך ניתן לפרוק באמצעות ניתוח של תגובת הלחץ6. בדרך כלל, כל הפרעה בסביבה טבעית בעלי חיים מפעילה מפל מורכב של אירועים נוירוהורמונלית, המכונה "להילחם או הטיסה" תגובה9,10. תגובה זו ללחץ הוא תהליך המתחיל במוח שבו ציר ההיפותלמי-יותרת הכליה (HPA) הצירים מופעל11. רכיב של המוח שנקרא ההיפותלמוס משחרר corticotrophin-שחרור הורמון (CRH), אשר לאחר מכן מאותת יותרת המוח הקדמי כדי לשחרר adrenocorticotrophic הורמון (ACTH)11. זה בתורו מגרה את הפרשת glucocorticoid מתוך ליבת יותרת הכליה. הגוף זורם גלוקוקורטיקואידים דרך הדם, אשר מסיט את האחסון של גלוקוז מן הגליקוגן ומגייס גלוקוז מאוחסן הגליקוגן11. זה מפל של אירועים נוירוהורמונלית היא התגובה המשמשת את בעל החיים להתמודד עם גירויים בלתי צפויים11. עם זאת, כאשר גלוקוקורטיקואידים משתחררים ונשארים מוגבהים למשך תקופה ממושכת, החיה נחשבת לאדם הסובל מלחץ כרוני של12,13. תהליך זה כרוך הטיית אנרגיה הרחק מפונקציות אחרות הגוף הגופני, כפי שהוא נדרש עבור glucocorticoid מתמשך הייצור13. כתוצאה מכך, לחץ כרוני יכול לאסור על צמיחה, רבייה וחסינות, כל להיות תכונות מפתח הכושר הנדרש להישרדות14.

מדידת ייצור glucocorticoid של בעל חיים הוא מחוון נפוץ המשמש כדי לקבוע אם בעל החיים חווים לחץ פיזיולוגי15. כדי לעשות זאת, ניתן למדוד את גלוקוקורטיקואידים בדם, בסרום, ברוק, בשתן או בצואה16. עם זאת, הראיות מצביעות על כך שהשיער הוא אינדיקטור הרבה יותר אפקטיבי ללחץ כרוני, בניגוד ל-16האמורות. זה בגלל השיער נחשב לשלב הורמונים הנישאים בדם במהלך הגידול שלה; הוא יציב יחסית; וכל קורטיזול שזוהו בשיער משקף את הלחץ הפיזיולוגי מנוסים על התקופה של צמיחת השיער, אשר יכול להיות שבועות עד חודשים16. יתר על כן, כל אוסף של קורטיזול צריך להיות לא פולשני כדי למזער את הלחץ הקשור ללכוד וטיפול16. עם זאת, כל הלחץ המנוסה במהלך אירוע זה לא ישפיע על רמות glucocorticoid בשיער16. היו מחקרים רבים לחקור את מיומנות השימוש בשיער כדי למדוד מתח לטווח ארוך במספר בעלי חיים, וכוללים מחקרים על איילים, דובי גריזלי, רזוס קופים, מוקוקסן, ו בראון דובים17,18, מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 21. שיער קורטיזול מופק בדרך כלל על ידי הראשון לשטוף את המדגם כדי להבטיח זיעה ואת החלב הנגזר קורטיזול הופקד על פני השטח של השיער אינו מופק משותף עם קורטיזול ולאחר מכן לרסק את המדגם במכה חרוז22. לאחר הכביסה, המדגם צריך להתייבש כדי להבטיח אידוי מלאה22. לבסוף, באמצעות ממיס, את המדגם ניתן לחלץ ולאפשר מחדש כדי להקל על הקיום של קורטיזול22. הממס הנפוץ ביותר המשמש לחילוץ קורטיזול מפרווה הוא מתנול21,23; עם זאת, ישנם מחקרים המשתמשים אתנול ו איזופנול בטכניקות החילוץ שלהם קורטיזול. לדוגמה, מחקר שהשתמשו באתנול היה מוצלח להפקת קורטיזול מנוזל השפיר האנושי24. בנוסף, מחקר שהשתמשו באיזופנול היה מוצלח להפקת קורטיזול משיער האדם והציפורניים25,26. מסיבה זו, מחקר זה בדק את כל שלושת ממיסים (מתנול, אתנול, ו איזופנול) כדי לקבוע איזה הוא המוצלח ביותר עבור החילוץ של קורטיזול מדגימות של פרווה קואלה.

המטרה העיקרית של מחקר זה היה להשתמש בטכניקות הנוכחיות כדי לאמת הורמון מיטבי החילוץ טכניקה לשמש כמדד לא פולשני של הקורטיזול פרווה קואלה. זה הושג על ידי בדיקת שלושה ממיסים החילוץ (מתנול, אתנול, ו איזופנול). אנו שיערו כי מתנול יהיה הממס האופטימלי המשמש לחילוץ קורטיזול מן הפרווה קואלה כי זה הממס המומלץ של החילוץ על ידי שיטת הקורטיזול שינון ערכת27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרויקט זה בוצע תחת בעלי חיים קפדנית והנחיות לטיפול בבני אדם. האתיקה בבעלי חיים ניתנה על ידי אוניברסיטת סידני המערבית (A12373). בנוסף, הערכת סיכוני מעבדה וביובטיחות והקרנות הוגשו והתקבלו על ידי אוניברסיטת סידני המערבית כדי להתחייב בבטחה למחקר זה (B12366).

הערה: דוגמאות לפרוות קואלה לפרויקט זה הושגו מבית החולים של קואלה וחיות הבר של אדלייד, הממוקם ב 282 אנזאק כביש, אוסטרליה דרום אוסטרליה. פרווה נלקחה מקואלה אחד שאושפז בבית החולים והורדמים בשל הפציעות החמורות שלהם. הקואלה המנוח אוחסן במקפיא. בתוך שק גופות זמן קצר לאחר המוות לאחר הסרת קואלה המנוח מן שק הגוף, 1.2 גרם של פרווה גולח מן העורף של הצוואר באמצעות קוצץ בעלי חיים סטנדרטיים. הפרווה הייתה מגולחת קרוב ככל האפשר לעור, כדי להבטיח את העור לא נחתך. ברגע שגולח, הקואלה המנוח הוצב. בחזרה לשק הגופות והוצב במקפיא הפרווה הונחה לאחר מכן בנרתיק עשוי רדיד אלומיניום ומאוחסן למטה-20 ° c. במהלך המעבר, הפרווה נשמרת בטמפרטורת הסביבה, ובהגיעם למעבדה, הפרווה אוחסנה ב-80 ° c.

1. מיצוי הקורטיזול של קואלה לפרווה

  1. להסיר את הפרווה מאחסון ב--80 ° צ' ולאפשר זמן להפשיר.
  2. שוקלים את הפרווה על. איזון אנליטי מעבדתי
  3. מקום 60 mg של הפרווה לתוך שקלה מראש ומתויג 1.5 mL צנטריפוגה שפופרת ולחזור עד 18 צינורות מלאים.
    הערה: 18 תתי-דגימות של פרווה שימשו למחקר אימות זה.
  4. הוסף 1 מ ל של 100% כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים ברמת האיזופנול לכל צינור באמצעות פיפטה.
  5. . דגימות של מערבולת של 30 מנות
  6. מסננים כל מדגם באמצעות מסננת 0.5 mm מיקרו מדויק כדי להשיג הפרדה של נוזל ופרווה.
  7. להשליך את הנוזל לתוך מיכל פסולת.
  8. מניחים כל מדגם פרווה לתוך סירה פלסטיק מתויג שקילה, ואז מקום לתוך ואקום desiccator, להשאיר את הפרווה להתייבש במשך 3 ימים.
  9. לאחר ייבוש לחלוטין, למקם כל מדגם לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL מתויג.
  10. מניחים כל מדגם בטחנת חרוז עם 3 חרוזי פלדה כרום (3.2 מ"מ) ו לרסק עבור 2 דקות ב 30 שייקים לשנייה.
  11. פיפטה 1.5 mL של טכניקת החילוץ הראשון (100% אתנול כיתה אנליטית) לתוך 6 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה הצינורות המכילים את דגימת פרווה.
  12. בצע את אותו הדבר עבור 100% כיתה אנליטית מתנול ו 100% בכיתה אנליטית איזופנול עד 18 1.5 mL שפופרות מיקרוצנטריפוגה מלאים.
  13. Cap כל 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה שפופרת ו-דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עם פועם קבוע באמצעות שייקר עבור 3 h.
  14. להסיר ולהתאמץ דגימות באמצעות מסננת 0.5 מ"מ דיוק מיקרו.
  15. להעביר את הנוזל לתוך חדש, מתויג 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם פיפטה תוך הקפדה כי הפרווה נמחקת כראוי.
  16. לגמרי ייבוש ממיסים יבש תחת זרם של N2 אדים תחת הארון מאדים.
  17. מרכיבים מחדש את התמצית לדוגמה מיובש באמצעות 400 μL של מאגר שיטות (הרכב המסופק בערכת קורטיזול מסחרי; ראה טבלת חומרים) ו 100 μl של 100% אתנול כיתה אנליטית.
    הערה: תמציות לדוגמה ניתן לאחסן ב-80.

2. בקרה פנימית

  1. כדי להפוך פקדים, לעשות בריכה של דגימות שחולצו עם רמות ההורמונים גבוהה. כדי להפוך את הבריכה, לבחור דגימות מבעלי חיים עם חשיפה ידוע ללחץ. לדוגמה, דוגמאות לבחור מ koalas כי חולצו מפני טראומה הסביבה כפי שהם בדרך כלל להציג גבוהה הורמון קורטיזול רמות6.
    1. כדי להפוך את המאגר לחלץ, לקחת 20 μL של חילוץ מכל מדגם (n = 10) עד נפח כולל של 200 μL מתקבל. בריכת החילוץ ניתן לאחסן ב-80 C עד assays. הפעל את המאגר בכל אחת מהמאגרים כפקדים פנימיים נמוכים או גבוהים (ראה שלב 2.2).
  2. עבור הצורך, השתמש במאגר כדי להפוך מניות עבור פקדים נמוכים וגבוהים התאגד ב 70% (C1) ו-30% (C2), בהתאמה. השג את פקטור הדילול עבור 30% ו 70% נקודות קשירה של הגרף המקביל לתמצית נגד תקן קורטיזול (איור 1). השתמש במאגר השיטת הדגימה לדילול של בריכה לדוגמה. לדוגמה, השתמש ב-60 μL של תמצית המאגר ו-60 μL של מאגר השימוש עבור 1:2 דילול.
    הערה: לתמצית המתנול, נקודת האיגוד של 30% הייתה מסודרת בזמן שנקודת האיגוד של 70% הייתה בקירוב כ-1:2 לפי איור 1. לפיכך, אלה סיפקו את פקטור הדילול עבור הבקרות הפנימיות (C1 ו-C2 בהתאמה) לצורך ריצה בתוך השיקול.

3. ניתוח קורטיזול בתמציות פרוות קואלה

  1. השתמש ערכת קורטיזול מסחרית (טבלה של חומרים) ולהגדיר את צלחת הסטריפ 96 היטב כולל דגימות, פקדים, תקני קורטיזול, בארות מחייב לא ספציפי, ובארות מחייב מירבי לאחר הוראות הספק. השתמש בגיליון פריסת הלוח המסופק בחוברת הערכה כדי לפרט את המיקומים של דגימות, פקדים ותקנים במפת הלוחית.
    הערה: מומלץ שכל הדגימות, הפקדים והתקנים יופעלו בכפולות כדי לאפשר דיוק של תוצאות.
  2. . הכן דגימות בצע את החילוץ הורמון פרווה (סעיף 1) כדי לקבל 100% מתנול הופק פרווה קואלה.
  3. הכינו ריאגנטים. בצע את ההליך המתואר בערכת קורטיזול מסחרי כדי להכין את ריאגנטים כולל (1) מאגר שיטת, (2) לשטוף מאגר, ו (3) תקנים (היצירות המסופקות ערכת קורטיזול, לוח חומרים).
  4. לפי ההוראות המסופקות ערכת קורטיזול, pipet 50 μL של דגימות או תקנים לתוך בארות בצלחת. Pipet 75 μL ו 50 μL של מאגר שיטות לתוך המאגרים הלא ספציפיים (NSB) ובארות הכריכה המקסימלית (B0 או האפס), בהתאמה.
  5. הוסף 25 μL של המשלים קורטיזול לכל טוב באמצעות משחזר. לאחר מכן pipet 25 μL של נוגדן הקורטיזול לתוך כל טוב, מלבד בארות NSB. להקיש בעדינות את הצדדים של הצלחת כדי להבטיח כי הריאגנטים מעורבים היטב.
  6. לכסות את הצלחת עם חותם לוחית ללחוץ בטמפרטורת החדר עבור 1 h (במהירות איטית) באמצעות שייקר מסלולית.
  7. הסר את לוחית החותם ומטפי את צלחת הבאר על ידי שטיפת כל טוב עם 300 μL של מאגר לשטוף 4 פעמים.
  8. לייבש את הצלחת על ידי הקשה על הצלחת על מגבות ספיגה נקי.
  9. פיפטה 100 μL של המצע טטרמתיאנאדין (TMB) (קומפוזיציה המסופקת בערכת הקורטיזול, טבלת חומרים) לכל באר.
  10. מניחים את הצלחת החותם על צלחת הבאר ואת הדגירה ב RT עבור 30 דקות.
  11. פיפטה 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב.
  12. מניחים את צלחת הבאר בקורא צלחת מסוגל לקרוא 450 ננומטר.
  13. כדי לחשב את ריכוז ההורמון הסופי, להפיק את הריכוז הסופי קורטיזול הפרווה ng/mg של המדגם על ידי הכפלת הורמון pg/mL עם נפח התמצית הסופי (0.5 mL) וחילוק על ידי המסה לדוגמה פרווה (60 mg).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת זיהוי של הורמון מטבוליטים של עניין נקבעת באמצעות הקביריזם. באמצעות עקומת מקבילים, נקודת האיגוד של 50% קובעת גם את פקטור הדילול לדוגמה בעקומה הסטנדרטית (איור 1). כפי שמוצג בגרף המקביל (איור 1), האתנול 100% ו-100% מתמציות איזופנול לא סיפקו הזחה מקבילה נגד תקן הקורטיזול. עם זאת, 100% התמצית מתנול סיפק הזחה מקבילה נגד תקן קורטיזול. תמציות מיובש הופעל מסודר באמצעות דילול במאגר השיטת (100 μL של 100% אתנול ו 400 μL של מאגר השיטת).

פנים-(בתוך) ובין-(בין) מקדמי שיטת הווריאציה (CV) נקבעו מ-high-(כ 70%) ונמוך-(כ -30%) מחייב לדוגמה מחלץ לפעול בכל הנאמר. בהתבסס על הגרף המקביל (איור 1), 30% (נמוך) הפקדים הפנימיים הכריכה היו מסודר לחלץ קואלה בריכה בעוד 70% (גבוה) השליטה הפנימית קשירה היו 1:2 בריכת קואלה מדולל לחלץ. CV% עבור פקדים פנימיים גבוהים ונמוכים היו < 15%.

ניתן לקבוע את מרווח השגיאות בתוך הקביעה באמצעות בקרת איכות, לרבות מקדמי הווריאציה הפנים-והבין-לבין-מקדמים, שאמורים ל< 15%. רגישות של שיטת החישוב חושבה כ-2 הסטיות הסטנדרטיות מהתגובה המושמעות של הדגימות הריקות (כריכת אפס), ומבוטא כ-81.26 pg/טוב.

Figure 1
איור 1: מקבינות של פרווה של קואלה במאגר שחולצו באמצעות 3 ממיסים שונים (100% אתנול, 100% איזופנול או 100% מתנול) נגד עקומת הקורטיזול בתקן הקורטיזול תחת האנזים החיסוני של אנזימים. B/TB הוא אחוז האיגוד מעל האיגוד הכולל. גורם הדילול הסדרתי (למשל, 1: מקדם דילול ממוצע של 2) סופק יחד עם הריכוז של כל תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

שנית, הקשר בין תמצית הממס ותקן קורטיזול נקבע באמצעות מזימת רגרסיה (איור 2). כפי שמוצג באיור 2, 100% מתנול לחלץ את השורה הטובה ביותר של הרגרסיה עם הערך R2 הגבוה ביותר בהשוואה ל-100% אתנול ו 100% תמציות איזופנול.

Figure 2
איור 2: מגרשים הרגרסיה לכריכה באחוזים של תקן הקורטיזול נגד כל אחד 3 ממיסים (אתנול, מתנול, ו איזופנול) השתמשו כדי לחלץ פרווה קואלה. ערך R2 התקבל מקו ההתאמה הטובה ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

יתר על כן, תת מערכת של פרווה קואלה שחולצו באמצעות כל אחד מממסים שלושה היו מסופקים והתוצאות מסופקות בטבלה 1 להלן. כפי שמוצג בטבלה 1, הריכוז הנצפה של תקן קורטיזול היה בטווח של 2879.61-125.70 pg/טוב. לא האתנול או איזופנול שיטת החילוץ יכול להשיג עקביות בתוצאה כמו ריכוזי תמצית הפרווה המתקבל באמצעות אחת השיטות הביא מאוד גבוה מינימום-max טווח של ריכוזי הורמונים (ראה שולחן 1 מספרים המסומנים באדום), שהיו מעבר למגבלת הגילוי של שיטת הקורטיזול. עם זאת, תמציות מתנול הביא ריכוזי קורטיזול בתוך מגוון של תקן קורטיזול (כפי שמוצג מספרים שחורים מודגש בטבלה 1). יתר על כן, ריכוזי הקורטיזול של פרווה שאותרו באמצעות שיטת החילוץ מתנול היה עקבי בהשוואה לתוצאות שהתקבלו באמצעות שתי השיטות האחרות (ראה טבלה 1). כך, אנו מקבלים את ההשערה האפס כי מתנול הוא הממס המתאים ביותר עבור הורמון פרווה הקואלה שאיבת לעומת אתנול ו איזופנול.

Table 1
טבלה 1: ריכוז קורטיזול (ng/mg) עבור הפרווה קואלה (n = 18) חולץ באמצעות 3 ממיסים שונים (אתנול, איזופנול או מתנול) ולרוץ נגד עקומת התקן קורטיזול תחת אנזים קורטיזול-חיסוני. מספרים אדומים מודגשים מציגים ריכוזים לא עקביים עבור מחלץ אתנול ותמציות איזופנול שהיו מעבר לטווח השיטת הנתונים (pg/ועוד). מספרים שחורים מודגש להראות את ריכוזי עבור הקורטיזול הפרווה שחולצו באמצעות מתנול שנפלו בתוך מגוון של תקני קורטיזול (pg/טוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר מחקרים המשתמשים במגוון טכניקות כדי לזהות קורטיזול בפרוות היונקים. מחקר זה מציג תוצאות לגילוי של קורטיזול בפרווה שנאסף קואלה פראי חשוף המתח אנתרופוגניים הנוכחי. זה מחקר הקרקע פורצת בשימוש בפרווה כדי לבדוק מי מתוך שלושת ממיסים בשימוש נפוץ הם הטובים ביותר לחילוץ קורטיזול, מידה של לחץ כרוני, מן הפרווה קואלה. תוצאות המחקר הראו כי 100% המתנול היה הממס המומלץ להפקת קורטיזול בסוג זה של פרוות היונקים.

אתנול, מתנול ו איזופנול הם כל האלכוהול העיקרי כי הם בונדד על ידי מולקולות מימן משמשים בדרך כלל ממיסים בניסויים הורמון החילוץ28. בדרך כלל, חומרי הקוטב מתמוסס הטוב ביותר בחומרים קוטביים אחרים, בעוד חומרים שאינם הקוטב מתמוסס הטוב ביותר חומרים שאינם קוטבי. קבוצת האלכוהול המכילה מתנול היא מאוד קוטבית, בעוד שקבוצת האלכוהול המכילה את האיזופנול היא מאוד לא קוטבית. בשל מבנה מולקולרי שלה, הקבוצה אלכוהול המכיל אתנול יש את היתרון של להיות הן ממיס קוטבי וגם לא קוטבי. הורמונים לסטרואידים כגון קורטיזול נחשבים לא קוטבי, כלומר קורטיזול צריכה להיות שיוך מחייב חזק עם ממיסים קוטבי.

לניתוח מקיף יותר של ממיסים החילוץ המשמשים להערכת הלחץ הפיזיולוגי בפרווה קואלה, בעתיד פרויקטים מחקר צריך לנסות שיטות זהות בסדר זה כפי שמתואר באיור 3. מחקרים דומים יש היסטורית לבצע את הכביסה לפני שחיקה22, כדי להבטיח כי אין מכוון זיעה ו/או הסבום הנגזר קורטיזול הופקד לתוך דגימת פרווה. יתרה מזאת, חשוב כי מדידת קורטיזול לבד לא יכול להבטיח אינדיקציה מלאה של לחץ כרוני. קריאות קורטיזול שיער הם כלי רב ערך כאשר מנסים להבין את הלחץ הפיזיולוגי מנוסים על ידי בעל חיים, אבל פעילות HPA גבוהות יכול להתרחש תחת מגוון של תנאים כולל פעילות גופנית, חריגות מטבולית ונוכחות של מחלה זיהומית22. גורמים חשובים אחרים שיש לקחת בחשבון את השלמות העיקרית של נתוני ההורמונים כוללים את הבאים. (1) רמה מקובלת של שגיאה אקראית-המקדמים של וריאציה שהתקבלו מפקדים פנימיים (CV1 ו-CV2) צריך להיות ממוצעים כדי < 15% עבור כל הנאמר. (2) שגיאה אקראית בתוך שיטת הדגימה – דגימות כפולות הפועלות על כל צלחת צריכה להיות בעלת קורות חיים% של < 15%; אחרת המדגם יהיה צורך להפעיל מחדש. (3) מגבלת זיהוי שיטות-ריכוז הורמון הורמונלי בתוך כל מבחן צריך להיות בתוך מגבלת זיהוי היכולת (בין קריאות לדילול הגבוה ביותר ותקן מסודר); דוגמאות אחרות עשויות לדרוש דילול נוסף (אם הרמות שזוהו עבור דגימות גדולות יותר מאשר הריכוז של תקן מסודר) או שלא ניתן לנתח בתוך הבדיקה (אם הרמות שזוהו עבור דגימות נמוכות מריכוז הגבוה ביותר מדולל סטנדרטי). (4) שיטת רגישות-הדבר עלול להיות מושפע מקריאת הרקע (איגוד שאינו ספציפי), ולכן חשוב לשמור על הרמה הגבוהה ביותר של אבטחת איכות עבור הטיפול (למשל, ציוד כגון מכונת כביסה וקורא הצלחות צריך להיות שירות באופן סדיר). (5) לסחוט לדוגמה ייבוש-שלב זה יכול לגרום לזיהום פוטנציאלי או אובדן של דגימות. מומלץ כי הדגימות להתייבש תחת קיטור של N2 גז בנפרד ולהחליף את הפיפטה פסטר המשמש לחילוץ בין כל דגימה.

Figure 3
איור 3: דיאגרמת זרימה מושגית המציגה את שלבי המפתח המעורבים בשיטת האנזים האנזימים של הקואלה לפרווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ההליך המתואר במחקר זה (איור 3) הוא אחד שניתן לשכפל בקלות כפי שהוא קל יחסית לבצע, צעד אחר צעד מתודולוגיה אשר משלבת כימיקלים זמינים, ריאגנטים, ואספקה עם ציוד סביר להיות נמצא במעבדה אנליטית סטנדרטית. היישום של מחקר זה מאפשר טכניקה לא פולשנית לשמש כדי להעריך את הלחץ הפיזיולוגי הן koalas פראי ובשבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה באמצעות התחל מחקר מימון עבור אדוארד נאראיאן באמצעות אוניברסיטת סידני המערבית, בית הספר למדע ובריאות. המחברים מודים לג נאקהאול לקבלת סיוע בעיבוד לדוגמא.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Centrifuge Tubes n/a n/a 1.5 mL
Chrome Steel Beads n/a n/a 3.2 mm x 3
Cortisol Kit Arbor Assays K003-H1W Manufactured in Michigan USA
DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit Arbor Assays K003-H5 Used first-time for cortisol testing in koala fur
Ethanol n/a n/a HPLC Grade
Isopropanol n/a n/a HPLC Grade
Methanol n/a n/a HPLC Grade
Micro Pipette n/a n/a n/a
Micro Precision Sieve n/a n/a 0.5 mm
Microplate Reader Bio Radi n/a n/a
Microplate Washer Bio Radi n/a n/a
Orbital Shaker Bio Line n/a n/a
Plastic Weighing Boat n/a n/a n/a
Plate Sealer n/a n/a n/a
Precision Balance n/a n/a n/a
Vortex Mixer Eppendorf n/a n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. Ecosystem services and Australian agricultural enterprises. Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).
  2. Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).
  3. Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities. PLoS ONE. 12 (1), 0170615 (2017).
  4. MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse. Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).
  5. Hrdina, F., Gordon, G. The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936. Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).
  6. Narayan, E. J., Williams, M. Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus). BMC Zoology. 1 (1), (2016).
  7. Woinarski, J., Burbidge, A. Phascolarctos cinereus. The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).
  8. Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity. Scientific Reports. 7, 42587 (2017).
  9. Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation. Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).
  10. Whirledge, S., Cidlowski, J. Glucocorticoids, stree, and fertility. Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109 (2010).
  11. Romero, L. M. Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research. Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).
  12. McEwen, B. S., Wingfield, J. C. What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress. Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).
  13. Wingfield, J. C. The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments. Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).
  14. Chrousos, G. P. Stress and disorders of the stress system. Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).
  15. Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus). General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).
  16. Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus). Conservation Physiology. 2 (1), 055 (2014).
  17. Ashley, N. T., et al. Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge. General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).
  18. Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife. Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).
  19. Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses. Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).
  20. Di Francesco, J., et al. Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies. Conservation Physiology. 5 (1), 052 (2017).
  21. Cattet, M., et al. Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling. Conservation Physiology. 2 (1), 026 (2014).
  22. Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair. Journal of Visualized Experiments. (83), e50882 (2014).
  23. Carlitz, E. H., et al. Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes). PLoS ONE. 11 (4), 0151870 (2016).
  24. Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid. Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).
  25. Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. A Cortisol Study; Facial Hair and Nails. Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177 (2016).
  26. Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. Steroid extraction: get the best out of faecal samples. Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).
  27. Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).
  28. Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model. Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 מתח כרוני קואלה גלוקוקורטיקואידים פרווה מתנול אתנול איזופנול
הקורטיזול מדידה קואלה (<em>פאיסקולארקטוס cinereus</em>) פרווה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Charalambous, R., Narayan, E.… More

Charalambous, R., Narayan, E. Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur. J. Vis. Exp. (150), e59216, doi:10.3791/59216 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter