Summary
Nós apresentamos um protocolo para determinar o solvente óptimo da extração para medir o cortisol da pele do Koala. Os solventes utilizados neste protocolo são metanol, etanol e isopropanol. Determinar um solvente de extração ideal ajudará na medição de peles de forma confiável para determinar o impacto do estresse crônico em coalas.
Abstract
Os métodos ideais de extração hormonal utilizados para medir o stress em animais através de tipos de amostras não são sempre os mesmos. A icónica espécie marsupial da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), enfrenta a exposição prolongada a estressores antropogênicos-induzidos e a avaliação do estresse crônico em populações selvagens é urgentemente justificada. Uma das maneiras mais eficazes de medir o estresse crônico é através da análise do hormônio glicocorticóide cortisol no cabelo ou pele, uma vez que suporta respostas fisiológicas e comportamentais. Este estudo de validação laboratorial tem como objetivo testar as técnicas atuais para validar um método de extração hormonal ideal para ser usado como uma medida não invasiva de cortisol em peles de coala. Reconhece-se que o uso de técnicas não invasivas para medir os hormônios do estresse é preferível sobre técnicas tradicionais e invasivas devido a seus pontos de vista práticos e éticos ideais. Além disso, é comparativamente mais fácil de adquirir peles de coalas do que é para adquirir amostras de seu sangue. Este estudo utilizou amostras de peles de coala adquiridas do Adelaide Koala and Wildlife hospital para executar uma série de técnicas de extração hormonal na tentativa de validar um método de extração de cortisol ideal. Os resultados mostraram que o metanol de 100% forneceu a extração solvente a mais óptima comparada ao etanol de 100% ou ao isopropanol de 100% baseado em resultados do paralelismo. Em conclusão, este método da extração do cortisol da pele do Koala forneceu um ensaio não invasor de confiança que poderia ser usado para estudar o esforço crônico em koalas.
Introduction
Os ecossistemas australianos sustentam a vida humana através da prestação de serviços, incluindo alimentos e fibras, entre muitas outras interações dinâmicas1. Ironicamente, é atividade humana que atua como o condutor dominante da perturbação do ecossistema através da mudança de biodiversidade2. A fragmentação do habitat, conhecida como o processo de divisão de grandes habitats contínuos em pequenas manchas de terra, isoladas umas das outras, é a maior mudança de biodiversidade antropogênica ameaçando os ecossistemas australianos2. A fragmentação do habitat modifica a estrutura e a diversidade da composição de espécies em uma determinada área, reduzindo assim a área de habitat necessária para que essas espécies mantenham populações viáveis2. O resultado disso é o aumento da concorrência entre as espécies de recursos, incluindo alimentos, combustíveis, fibras e água3. A destruição de ecossistemas australianos através da mudança de biodiversidade está tendo conseqüências catastróficas em muitas espécies nativas australianas1.
A espécie marsupial mais emblemática da Austrália, ocoala (Phascolarctos cinereus), depende dos ecossistemas australianos que permanecem saudáveis para sua sobrevivência4. A introdução do assentamento europeu causou um rápido declínio nas populações australianas de coalas, como eles foram abatidos por suas peles em busca de lucro em um grande comércio de exportação5. Esta prática foi proibida na década de 1980 e as populações de coalas foram então capazes de estabilizar5. No entanto, o crescimento exponencial da população humana resultou nesta espécie competindo por grande parte de seu habitat, e sua sobrevivência é novamente ameaça6. De acordo com a União Internacional para a conservação da natureza (IUCN), todas as populações de coalas australianas estão listadas como vulneráveis à extinção com uma tendência populacional decrescente7. Este anúncio é atribuído à incerteza em torno dos parâmetros populacionais relevantes e à variação acentuada das tendências populacionais para esta espécie7. Como os animais mais emblemáticos e endêmicos, coalas em grande parte beneficiam a economia australiana através do turismo (NSW Office of Environment and Heritage 2018). Uma estimativa sugere que o turismo relacionado Koala gerou aproximadamente 9.000 empregos e contribui entre $1.01 e $2500000000 para a economia (NSW escritório de meio ambiente e património 2018). A remoção de qualquer uma das espécies tem o potencial de ser catastrófico, e pode ser visto no declínio constante da vida selvagem australiana nativa6. Adicionalmente, a economia de Austrália sentirá as ramificações se as populações de coalas Australian continuarem a declinar na taxa que são6.
Sugere-se que a prevalência de morte e doença em resposta à fragmentação do habitat é o resultado do estresse crônico8. Já, vinte e quatro espécies marsupiais foram declaradas extintas na Austrália devido à fragmentação do habitat, com coalas seguindo uma tendência semelhante8. A complexidade da fragmentação do habitat e dos sistemas biológicos é sinergética, mas pode ser desempacotada através da análise da resposta ao estresse6. Geralmente, qualquer perturbação em um ambiente natural de animais ativa uma cascata complexa de eventos Neurohormonais, conhecida como uma resposta de "luta ou fuga"9,10. Esta resposta ao stress é um processo que começa no cérebro onde o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) é ativado11. Um componente do cérebro chamado hipotálamo libera o hormônio liberador de corticotrofina (CRH), que então sinaliza a hipófise anterior para liberar o hormônio adrenocorticotrófico (ACTH)11. Isso, por sua vez, estimula a secreção glicocorticóide da medula adrenal. O corpo circula glicocorticóides através do sangue, que desvia o armazenamento da glicose do glicogênio e mobiliza a glicose do glicogênio armazenado11. Esta cascata de eventos Neurohormonais é a resposta usada pelo animal para lidar com estímulos imprevisíveis11. No entanto, quando os glicocorticóides estão sendo liberados e permanecem elevados por um período prolongado de tempo, o animal é considerado como tendo estresse crônico12,13. Esse processo envolve desviar a energia de outras funções corporais corpóreas, como é necessário para a produção contínua de glicocorticóides13. Como resultado, o estresse crônico pode proibir o crescimento, a reprodução e a imunidade, sendo todos os principais traços de aptidão necessários para a sobrevida14.
Medir a produção de glicocorticóides de um animal é um indicador comum usado para determinar se o animal está ou não experimentando estresse fisiológico15. Para isso, os glicocorticóides podem ser medidos no plasma sanguíneo, soro, saliva, urina ou fezes16. No entanto, evidências sugerem que o cabelo é um indicador muito mais eficaz do estresse crônico, em oposição aos16acima mencionados. Isso é porque o cabelo é pensado para incorporar hormônios transmitidos pelo sangue durante a sua fase de crescimento; é relativamente estável; e todo o cortisol detectado no cabelo reflete o esforço fisiológico experimentado sobre o período de crescimento do cabelo, que pode ser semanas completamente aos meses16. Além disso, qualquer coleta de cortisol deve ser não invasiva, a fim de minimizar o estresse associado à captura e manuseio16. No entanto, qualquer estresse experimentado durante este evento não afetaria os níveis de glicocorticóides no cabelo16. Houve muitos estudos que exploram a proficiência de usar o cabelo para medir o stress a longo prazo em um número de animais, e incluem estudos em Rena, ursos de urso, macacos de rhesus, muskoxen, e ursos marrons17,18, 19 anos de , 20 anos de , o cortisol 21. Hair é extraído geralmente primeiramente lavando a amostra para assegurar o cortisol do suor e do sebo-derivado depositado na superfície do cabelo não é coextraído com cortisol e então pulverizando a amostra em um grânulo-batedor22. Após a lavagem, a amostra precisa de ser secada para assegurar a evaporação completa22. Finalmente, usando um solvente, a amostra pode ser extraída e reconstituída para facilitar o ensaio de cortisol22. O solvente mais comum usado para extrair o cortisol da pele é o metanol21,23; no entanto, existem alguns estudos que usam etanol e isopropanol em suas técnicas de extração de cortisol. Por exemplo, um estudo que utilizou etanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do fluido amniótico humano24. Adicionalmente, um estudo que utilizou isopropanol foi bem-sucedido para extrair o cortisol do cabelo humano e unhas25,26. Por esta razão, este estudo testou todos os três solventes (metanol, etanol e isopropanol) para determinar qual foi o mais bem sucedido para a extração de cortisol de amostras de peles de coala.
O objetivo preliminar deste estudo era usar técnicas atuais para validar uma técnica óptima da extração de hormona a ser usada como uma medida não invasora do cortisol da pele do Koala. Isto foi conseguido testando três solventes da extração (metanol, ethanol, e isopropanol). Nós supor que o metanol será o solvente ideal usado para extrair o cortisol da pele do Koala porque é o solvente recomendado da extração pelos jogos27do cortisol do ensaio da árvore.
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Protocol
Este projeto foi realizado rigorosas diretrizes de cuidado animal e humano. A ética animal foi concedida pela Western Sydney University (A12373). Adicionalmente, uma avaliação de risco laboratorial e uma forma de biossegurança e radiação foram submetidas e aceitas pela Western Sydney University para realizar esta pesquisa com segurança (B12366).
Nota: as amostras de peles de Koala para este projeto foram obtidas do Adelaide Koala and Wildlife hospital, localizado na 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. A pele foi tomada de um koala que fosse admitido ao hospital e eutanasiado devido a suas lesões severas. O Koala falecido tinha sido armazenado em um congelador dentro de um saco do corpo logo após a morte. Depois de remover o Koala falecido do saco do corpo, 1,2 g de pêlo foi raspado da nuca do pescoço usando cortadores de animais padrão. O pêlo foi raspado o mais próximo possível da pele, de modo a garantir que a pele não foi cortada. Uma vez raspada, o Koala falecido foi colocado de volta no saco do corpo e colocado no congelador. A pele foi então colocada em uma bolsa feita de folha de alumínio e armazenada abaixo de-20 ° c. Em trânsito, a pele foi mantida à temperatura ambiente, e na chegada ao laboratório, a pele foi armazenada em-80 ° c.
1. extração do cortisol da pele do Koala
- Retire a pele do armazenamento a-80 ° c e Reserve tempo para descongelar.
- Pesar a pele em um laboratório de equilíbrio de precisão analítica.
- Coloque 60 mg de pele em um tubo de centrifugação pré-pesado e rotulado de 1,5 mL e repita até que 18 tubos estejam preenchidos.
Nota: foram utilizadas 18 subamostras de peles para este estudo de validação. - Adicione 1 mL de isopropanol de grau de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) a 100% a cada tubo usando uma pipeta.
- Amostras de vórtice para 30 s.
- Coe cada amostra usando uma peneira de precisão micro 0,5 mm de modo a alcançar a separação de líquidos e peles.
- Descarte o líquido em um recipiente de resíduos.
- Coloc cada amostra da pele em um barco de pesagem plástico etiquetado, a seguir coloc em um desiccator do vácuo, deixe a pele para secar por 3 dias.
- Uma vez completamente seco, coloque cada amostra em um tubo de microcentrífuga rotulado de 1,5 mL.
- Coloque cada amostra em um moinho de contas com 3 grânulos de aço cromado (3,2 mm) e pulverizar por 2 min a 30 shakes por segundo.
- Pipeta 1,5 mL da primeira técnica de extração (100% de etanol de grau analítico) em 6 1,5 mL de tubos de microcentrífuga contendo a amostra de peles.
- Realize o mesmo para 100% de metanol de grau analítico e 100% de isopropanol analítico até dezoito tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estarem preenchidos.
- Tampe cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e incubar à temperatura ambiente (RT) com pulsante constante usando uma coqueteleira por 3 h.
- Retire e Coe amostras usando uma peneira de precisão micro de 0,5 mm.
- Transfira o líquido para um novo e rotulado tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com uma pipeta, assegurando que a pele seja descartada apropriadamente.
- Extrato solvente completamente seco um córrego do vapor de N2 um fume-armário.
- Reconstituir o extrato da amostra seca usando 400 μL de tampão de ensaio (composição fornecida no kit comercial de cortisol; ver tabela de materiais) e 100 μl de 100% de etanol de grau analítico.
Nota: as extrações de amostra podem ser armazenadas em-80.
2. controlos internos
- Para fazer controles, faça um pool de amostras extraídas com altos níveis hormonais. Para fazer esta piscina, selecione amostras de animais com exposição conhecida ao estressor. Por exemplo, selecione amostras de coalas que foram resgatadas do trauma ambiental, pois geralmente exibirão níveis elevados de hormônio cortisol6.
- Para fazer o pool de extração, tomar 20 μL de extrato de cada amostra (n = 10) até que um volume total de 200 μL seja obtido. O pool de extração pode ser armazenado em-80 C até os ensaios. Execute o pool em cada ensaio como controles internos baixos ou altos (consulte a etapa 2,2).
- Para o ensaio, use a piscina para fazer estoques para controles baixos e altos que se ligam a 70% (C1) e 30% (C2), respectivamente. Obter o fator de diluição para os pontos de ligação de 30% e 70% do gráfico de paralelismo para o extrato contra o padrão de cortisol (Figura 1). Utilize o tampão de ensaio para diluição do conjunto de amostras. Por exemplo, use 60 μL do extrato da piscina e 60 μL de tampão de ensaio para a diluição 1:2.
Nota: para o extrato de metanol, o ponto de ligação de 30% estava em puro, enquanto 70% ponto de ligação foi aproximadamente 1:2 como por Figura 1. Assim, estes forneceram o fator de diluição para os controles internos (C1 e C2 respectivamente) para a execução dentro do ensaio.
3. análise de cortisol em extratos de peles de coala
- Use um kit de cortisol comercial (tabela de materiais) e configure a placa de tira 96 bem, incluindo as amostras, controles, padrões de cortisol, poços de ligação não específicos e poços de ligação máximos seguindo as instruções do fornecedor. Use a folha de layout da placa fornecida no livreto do kit para listar as posições de amostras, controles e padrões no mapa da placa.
Observação: é recomendável que todas as amostras, controles e padrões são executados em duplicado para permitir a precisão dos resultados. - Prepare amostras. Siga a extração de hormônio da pele (seção 1) para obter 100% de pele de Koala extraída metanol.
- Prepare os reagentes. Siga o procedimento descrito no kit de cortisol comercial para preparar os reagentes, incluindo (1) tampão de ensaio, (2) tampão de lavagem e (3) padrões (composições fornecidas no kit de cortisol, tabela de materiais).
- De acordo com as instruções fornecidas no kit de cortisol, Pipet 50 μL de amostras ou normas em poços na placa. Pipet 75 μL e 50 μL de tampão de ensaio nos poços de ligação não específica (NSB) e os poços de ligação máxima (B0 ou padrão zero), respetivamente.
- Adicionar 25 μL do conjugado de cortisol a cada poço usando um repetidor Pipet. Em seguida, Pipet 25 μL do anticorpo cortisol em cada poço, exceto os poços NSB. Bata delicadamente os lados da placa para assegurar-se de que os reagentes estejam bem misturados.
- Cubra a placa com o aferidor da placa e agitar à temperatura ambiente para 1 h (em velocidade lenta) usando um agitador orbital.
- Retire o aferidor da placa e aspirar a placa de poço lavando cada poço com 300 μL de tampão de lavagem 4 vezes.
- Seque a placa tocando na placa em toalhas absorventes limpas.
- Pipete 100 μL de substrato tetrametilbenzadina (TMB) (composição fornecida no kit de cortisol, tabela de materiais) a cada poço.
- Coloque o aferidor da placa na placa de poço e incubar a RT durante 30 min.
- Pipeta 50 μL de solução de paragem para cada poço.
- Coloc a placa do poço em um leitor da placa capaz da leitura 450 nanômetro.
- Para calcular a concentração hormonal final, derivar a concentração final de cortisol de pele em ng/mg de amostra multiplicando a concentração hormonal pg/mL com o volume de extrato final (0,5 mL) e dividindo-se pela massa da amostra de peles (60 mg).
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Representative Results
A detecção do ensaio de metabólitos hormonais de interesse é determinada usando paralelismo. Usando uma curva de paralelismo, o ponto de ligação de 50% também determina o fator de diluição da amostra na curva padrão (Figura 1). Como mostrado no gráfico de paralelismo (Figura 1), os extratos de 100% de etanol e 100% de isopropanol não proporcionam deslocamento paralelo contra o padrão de cortisol. No entanto, o extrato de metanol 100% forneceu deslocamento paralelo contra o padrão de cortisol. Os extratos secos foram executados de forma pura através da diluição em tampão de ensaio (100 μL de etanol 100% e 400 μL de tampão de ensaio).
Os coeficientes de variação (CV) intra (dentro) e inter (entre) foram determinados a partir de alta (aproximadamente 70%) e baixa (aproximadamente 30%) os extratos de amostra de ligação são executados em todos os ensaios. Com base no gráfico de paralelismo (Figura 1), os controles internos de ligação de 30% (baixo) foram o pool de extrato de coala puro, enquanto os controles internos de ligação 70% (alta) foram 1:2 diluídos piscina de extrato de coala. CV% para controles internos altos e baixos foram < 15%.
A margem de erro dentro do ensaio pode ser determinada usando o controle de qualidade, incluindo os coeficientes de variação intra e inter-ensaio, que deve ser < 15%. A sensibilidade do ensaio foi calculada como o valor 2 desvios padrão da resposta média das amostras em branco (ligação zero) e expressa em 81,26 PG/poço.
Figura 1: paralelismo da pele de Koala agrupada extraída usando 3 solventes diferentes (100% etanol, 100% isopropanol ou 100% metanol) contra a curva padrão de cortisol uma enzima de cortisol-imunoensaio. B/TB é a percentagem de ligação sobre a ligação total. O fator de diluição serial (por exemplo, 1:2X fator de diluição médio de 2) foi fornecido juntamente com a concentração de cada padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em segundo lugar, a associação entre cada extrato de solvente e padrão de cortisol foi determinada por meio de um gráfico de regressão (Figura 2). Como mostrado na Figura 2, o extrato de metanol 100% proporcionou a melhor linha de regressão com o maior valor de R2 em comparação com os extratos de etanol a 100% e de isopropanol a 100%.
Figura 2: parcelas de regressão para a ligação percentual do padrão de cortisol em relação a cada um dos 3 solventes (etanol, metanol e isopropanol) usados para extrair peles de coala. O valor de R2 foi obtido a partir da linha de melhor ajuste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Além disso, o subconjunto de peles de coala extraídos usando cada um dos três solventes foi analisado e os resultados são fornecidos na tabela 1 abaixo. Como mostrado na tabela 1, a concentração observada de padrão de cortisol estava dentro da faixa de 2879.61-125.70 PG/poço. Nem o método de extração de etanol ou isopropanol poderia obter consistência no resultado, pois as concentrações de extrato de pele obtidas usando qualquer um dos métodos resultaram em uma gama muito alta de concentrações hormonais mín-máx (ver números da tabela 1 marcados em vermelho), que estavam além do limite de detecção do ensaio de cortisol. No entanto, os extratos de metanol resultaram em concentrações de cortisol dentro da faixa do padrão de cortisol (como mostrado em negrito números pretos na tabela 1). Além disso, as concentrações de cortisol de pele detectadas utilizando o método de extração de metanol foram altamente consistentes em relação aos resultados obtidos com os outros dois métodos (ver tabela 1). Assim, aceitamos a hipótese nula de que o metanol é o solvente mais adequado para a extração de hormônio da pele de coala em comparação com etanol e isopropanol.
Tabela 1: a concentração de cortisol (ng/mg) para a pele de coala (n = 18) extraída usando 3 solventes diferentes (etanol, isopropanol ou metanol) e executar contra a curva padrão de cortisol uma enzima de cortisol-imunoensaio. Os números vermelhos ousados mostram concentrações inconsistentes para extratos de etanol e isopropanol que estavam além da faixa de ensaio (PG/poço). Os números pretos bold (realce) mostram as concentrações para o cortisol da pele extraído usando o metanol que caiu dentro da escala dos padrões do cortisol (PG/poço). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma série de estudos que usam uma série de técnicas para detectar o cortisol na pele de mamíferos. Este estudo apresenta resultados para a detecção de cortisol em peles coletadas de um koala selvagem exposto ao estresse antropogênico atual. Este estudo inovador usou peles para testar qual dos três solventes comumente usados são melhores na extração de cortisol, uma medida de estresse crônico, de peles de coala. Os resultados mostraram que 100% de metanol foi o solvente recomendado para extração de cortisol neste tipo de pele de mamíferos.
Etanol, metanol e isopropanol são todos álcoois primários que são ligados por moléculas de hidrogênio e são comumente usados como solventes em experimentos de extração hormonal28. Geralmente, as substâncias polares se dissolvem melhor em outras substâncias polares, enquanto que as substâncias não-polares se dissolvem melhor em outras substâncias não-polares. O grupo de álcool contendo metanol é muito polar, enquanto o grupo de álcool contendo isopropanol é muito não polar. Devido à sua construção molecular, o grupo de álcool contendo etanol tem a vantagem de ser um solvente polar e não polar. Hormônios esteroides como o cortisol são considerados não-polar, o que significa que o cortisol deve ter uma associação forte ligação com solventes polares.
Para uma análise mais abrangente dos solventes de extração utilizados para avaliar o estresse fisiológico em peles de coala, futuros projetos de pesquisa devem tentar métodos idênticos nessa ordem, conforme descrito na Figura 3. Estudos semelhantes têm realizado historicamente a lavagem antes de moer22, de modo a garantir que não há suor involuntaria e/ou sebo derivado de cortisol depositado na amostra de peles. Além disso, é importante que a medição do cortisol isoladamente não possa garantir uma indicação completa do estresse crônico. As leituras do cortisol do cabelo são uma ferramenta valiosa ao tentar compreender o stress fisiológico experimentado por um animal, mas a atividade elevada de HPA pode ocorrer uma variedade de circunstâncias que incluem o exercício físico, anomalias metabólicas e a presença de doença infecciosa22. Outros fatores importantes que devem ser levados em consideração para a integridade principal dos dados hormonais incluem o seguinte. (1) nível aceitável de erro aleatório-os coeficientes de variação obtidos a partir de controles internos (CV1 e CV2) devem ser calculados para < 15% para todos os ensaios. (2) erro aleatório dentro do ensaio da amostra ― as amostras duplicadas executadas em cada placa devem ter um CV% de < 15%; caso contrário, a amostra precisará ser re-Run. (3) limite de detecção de ensaio-a concentração de hormônio quantificado dentro de cada ensaio deve estar dentro do limite de detecção de ensaio (entre leituras para maior diluição e padrão puro); caso contrário, as amostras podem necessitar de uma diluição adicional (se os níveis detectados para as amostras forem superiores à concentração de padrão puro) ou não podem ser analisados dentro do ensaio (se os níveis detectados para as amostras forem inferiores à concentração da maior diluição padrão). (4) sensibilidade do ensaio-isto pode ser afetado pela leitura do fundo (ligação não específica), conseqüentemente é importante manter o nível o mais elevado de garantia de qualidade para o ensaio (por exemplo, o equipamento tal como a arruela da placa e o leitor da placa devem ser servidos regularmente). (5) amostra extrato de secagem-esta etapa pode resultar em potencial de contaminação cruzada ou perda de amostras. Recomenda-se que as amostras sejam secas vapor de gás N2 individualmente e para substituir a pipeta Pasteur usada para extração entre cada amostra.
Figura 3: diagrama de fluxo conceitual mostrando as principais etapas envolvidas na enzima-imunoensaio de cortisol de pele de Koala (EIA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O procedimento descrito neste estudo (Figura 3) é aquele que pode ser facilmente replicado, pois é relativamente fácil de executar, metodologia passo a passo que incorpora produtos químicos, reagentes e suprimentos prontamente disponíveis com equipamentos que provavelmente serão encontrado em um laboratório analítico padrão. A aplicação deste estudo permite que uma técnica não invasiva seja utilizada para avaliar o estresse fisiológico em coalas selvagens e cativas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado através de financiamento de pesquisa de start-up para Edward Narayan através da Western Sydney University, escola de ciência e saúde. Os autores agradecem Jack Nakhoul pela assistência com o processamento amostral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge Tubes | n/a | n/a | 1.5 mL |
| Chrome Steel Beads | n/a | n/a | 3.2 mm x 3 |
| Cortisol Kit | Arbor Assays | K003-H1W | Manufactured in Michigan USA |
| DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit | Arbor Assays | K003-H5 | Used first-time for cortisol testing in koala fur |
| Ethanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Isopropanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Methanol | n/a | n/a | HPLC Grade |
| Micro Pipette | n/a | n/a | n/a |
| Micro Precision Sieve | n/a | n/a | 0.5 mm |
| Microplate Reader | Bio Radi | n/a | n/a |
| Microplate Washer | Bio Radi | n/a | n/a |
| Orbital Shaker | Bio Line | n/a | n/a |
| Plastic Weighing Boat | n/a | n/a | n/a |
| Plate Sealer | n/a | n/a | n/a |
| Precision Balance | n/a | n/a | n/a |
| Vortex Mixer | Eppendorf | n/a | n/a |
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