Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לצורך רכישת דגימות נשימה מילדים. בקצרה, דגימות אוויר מעורב מרוכזים מראש צינורות sorbent לפני ניתוח גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית. ניתן לזהות סמנים ביולוגיים נשימה של מחלות זיהומיות, שאינן זיהומיות בשיטה זו אוסף נשימה.
Abstract
נשימה איסוף וניתוח יכול לשמש כדי לגלות סמנים ביולוגיים נדיף במספר מחלות זיהומיות שאינן זיהומיות, כגון מלריה, שחפת, סרטן ריאות מחלת כבד. פרוטוקול זה מתאר שיטה ישימה עבור דגימה נשימה אצל ילדים וייצוב ואז דגימות נשימה לצורך ניתוח נוסף עם גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS). מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול מתוקננת לצורך רכישת דגימות נשימה לצורך ניתוח כימי נוסף, של ילדים בגילאי 4-15 שנים. ראשית, נשימה נדגמים באמצעות דוברת מקרטון מחובר שסתום 2-way, אשר מחובר אל שקית 3 L. נשימה analytes לאחר מכן הועבר צינור desorption תרמית, המאוחסנים ב 4-5 ° C עד הניתוח. טכניקה זו שימש בעבר ללכוד את הנשימה של ילדים עם מלריה לזיהוי סמן נשימה מוצלחת. לאחר מכן, אנחנו בהצלחה החלת טכניקה זו על גדודים ילדים נוספים. היתרון של שיטה זו הוא כי דורש שיתוף מינימלית של המטופל (של ערך מסוים בקרב אוכלוסיות ילדים), תקופה קצרה אוסף, לא דורשת צוות מיומן בו ניתן לבצע באמצעות ציוד נייד הגדרות שדה משאב מוגבל.
Introduction
סמנים ביולוגיים יכולות להניב מידע חיוני על תהליכים ביולוגיים נורמליים ופתולוגיים שעשויים לתרום קלינית לזיהוי המחלה. לאחרונה, יש כבר עניין גובר בהערכה של נשימה שיכללו חומרים נדיפים כמו סמנים ביולוגיים למגוון רחב של מצבי מחלה, כולל זיהום, הפרעות מטבוליות סרטן 1. והבל הפה מכיל רמות לכימות של תרכובות אורגניות נדיפות (Voc), תרכובות אורגניות נדיפות למחצה, microbially נגזרת חומר (למשל, חומצות גרעין מפני חיידקים ווירוסים). המטרה המרכזית של ניתוח והבל הפה הוא להשיג תובנה המצב של מצב רפואי ו/או חשיפות סביבתיות לא פולשני. ישנן שיטות שונות עבור איסוף וניתוח והבל הפה, בהתאם המרכיבים של עניין. כיום יש אין שיטה אוסף מתוקננת והבל הפה, אשר מסבך ניתוח השוואתי של תוצאות מעבר ללימודים. האחדת נשימה אוסף נהלים חיוני, כמו הליך הדגימה עצמה יש השפעה רבה על התוצאות במורד הזרם של נשימה ניתוחים.
במחקרים רבים, מאחר נשימה נשימה הדגימה הוא המועסקים2,3. דגימה זו כרוכה השמטת את החלק הראשוני של והבל הפה ("שטח מת"), על מנת ללכוד את האוויר מעדיפים בסוף מחזור נשימה. היתרון של אסטרטגיה זו היא כי מצמצם את רמות VOC אקסוגני (למשל, איכות הסביבה Voc), תוך העשרת עבור Voc אנדוגני, מטופל ספציפי. שיטה זו אינה כוללת השניות הראשונות של נשיפה מאדם בודד לפני איסוף המדגם נשימה. חוקרים אחרים המועסקים חיישן לחץ כדי להפעיל את הדגימה במהלך תקופה מוגדרת מראש של תפוגה4,5. מכיוון חיישני לחץ דורשים הנדסה מורכבים, שיטה חלופית זו דורשת מכשיר דגימה ייעודי ויקר יחסית.
דגימה נשימה בילדים יכול להיות מאתגר במיוחד. מופעיו היא ילדים צעירים עשויים להיות מסוגלים לשתף פעולה עם פרוטוקולים עבור מרצון נשיפה של אוויר "שטח מת". מסיבה זו, קל יותר להשיג נשימה נשימה מעורבת של ילדים. אזהרה גדולה עם דגימות נשימה נשימה מעורבות זאת, הסיכון של זיהום סביבתי, החומרי. לכן, הכדאיות של אוסף ילדים היא דאגה נהיגה בשטח.
בנוסף, שיטות איסוף, אחסון של דגימות נשימה יכול להשפיע גם על איכות דגימת. הלחות הגבוהה exhalate נשימה, ריכוז נמוך במיוחד (חלקים-לכל-טריליון) נשימה אורגניים נדיפים תרכובות להפוך נשימה דגימות רגישים במיוחד לבעיות הקשורות לאחסון6,7. למרות הפוטנציאל הגדול של טכניקות בזמן אמת כמו פרוטון העברה התגובה-ספקטרומטריית (PTR-MS), GC-MS עדיין תקן הזהב לניתוח של דגימות נשימה. מאז GC-MS ניתוח דוגמאות הנשימה הוא שיטת מנותק, זה משולב עם ריכוז קדם שיטות כגון צינורות התרמי desorption (TD), מיקרו-מיצוי מעבדתי והתקני מלכודת המחט. לפני קדם ריכוז, דגימות נשימה צריך להיות מאוחסנים באופן זמני בפולימר שקיות8. פולימר שקיות פופולריים בשל מחיר מתון שלהם, עמידות טובה יחסית, שימושית. בזמן ייתכן ניתנים לשימוש חוזר בתוך שקיות, זמן ומאמץ נדרשים על מנת להבטיח יעילות ניקוי7,8. כל סוג תיק מסוים דורש גם נחושה מדעית ושגרות מתוקנן עבור בקרת איכות, שימושית ושחזור.
צינורות TD נמצאים בשימוש נרחב עבור הנשימה ריכוז מראש כי הם ללכוד מספר גדול של שיכללו חומרים נדיפים, יכול להיות מותאם אישית. החומרים סופג בהם אריזה צינורות TD עשוי להיות מותאם כדי שיכללו חומרים נדיפים מסויימת עניין ויישומים מסוימים. TD צינורות באופן משמעותי לשפר את הנוחות של מחקרים סמן נשימה, במיוחד באתרים מרחוק שדה, כי TD צינורות בבטחה לאחסן שיכללו חומרים נדיפים נשימה במשך לפחות שבועיים, בקרבת תחבורה3.
במאמץ לתקנן נשימה בילדים אוסף עבור גילוי סמן, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לאסוף את הנשימה של ילדים צעירים. כדי להמחיש את התוצאות נציג של הפרוטוקולים מיושמים, מוצגים נתונים מבטל את שזוהה מ פוסקת קוהורטה של הילדים (גיל 8-17) שעברו הערכה למחלה ללא אלכוהול חומצת שומן בכבד (אלכוהולי NAFLD). תוצאות מלאות וניתוח של מחקר זה ידווחו בפרסום מאוחר יותר. בעבודה זאת, מדווחים ערכת משנה נתונים כדי להדגים את היישום של פרוטוקול שלנו. בקצרה, הילדים הורו נשוף בדרך כלל באמצעות פייה לשקית פולימר, כאילו "לפוצץ בלון". התהליך חוזר על עצמו 2 - 4 פעמים עד 1 ליטר נשימה נאסף. המדגם הוא לאחר מכן הועבר לתוך צינור TD, המאוחסנים ב 5 ° C לפני ניתוח GC-MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה הלוח של וושינגטון הספר לרפואה של אוניברסיטת (#201709030). הסכמה מדעת היה המתקבלים הורה או אפוטרופוס לפני ההכללה במחקר. תמונות באיור 2 מרובה עם הסכמת ההורים הודיע בכתב.
1. נשימה סמפלר הרכבה
- באמצעות כפפות חד פעמיות, לצרף לגלקסיית קרטון הדוגם נשימה, כפי שמוצג משלימה איור 1. צרף באורך קצר של צינורות בקוטר גדול לקיצוניות אחרת של דוגם הנשימה, כפי שמוצג באיור1 משלימה. השתמש לצנרת חדשה עבור כל מטופל.
- לצרף את מחבר נשימה השסתום תיק דרך הצנרת. לקבלת תמונה של דוגם את הנשימה ואת התיק מחובר, ראה איור 1 .
- להפוך את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים נגד כיוון השעון כדי לפתוח את השסתום לדחוף את הגבעול של השסתום התיק למטה, כדי לפתוח את הים נאוה הדגימה.
- לנעול את פתח השסתום, על-ידי הפעלת את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים עם כיוון השעון.
- לאשר כי השסתום כחול על הדוגם נשימה פתוחה (מקביל עם המחבר).
- לכתוב החולה מזהה, תאריך ושעה על התווית של השקית פולימר.
- תנאי TD צינור sorbent לפני הנשימה באמצעות אוסף מומלץ הליכים (זמין של יצרנים בודדים). קאפ ולאחסן desorption תרמי צינורות ב 4-5 מעלות צלזיוס לפני נשימה אוסף כדי למזער את החפצים.
2. נשימה אוסף
- לבצע הדגמה של נשימה נשיפה לילד באמצעות דוגמאות נשימה (בלי תיק). להסביר לילד כי הם צריכים תנשוף החוצה כאילו הם עושים כאשר "ניפוח בלון" ולהמשיך נושף ככל שהם יכולים בנוחות. ויצאה קרטון בין השפתיים שלך ולנשוף רחוק ככל שאתה יכול.
- לספק את הילד עם דוגמאות נשימה החדש מצורף תיק ובקש ממנו לנשוף כמו בהפגנה, כמופיע באיור2.
- סגור את השסתום כחול על המכשיר דוגם נשימה ברגע שהילד סיים נושף. פתח מחדש את השסתום כנדרש לפני נשימות נוספים.
- חזור על שלב 2.2 ו- 2.3 עד שנאספו לפחות 1 ליטר של נשימה. עבור ילד בריא זה עשוי להימשך 2 נשימות, ועבור נשימות של ילד חולה או צעירים 2 – 4. 1 ליטר נשימה הוא הדרישה המינימלית אנליטית. הערה על התווית התיק כמה נשימות שנאספו מן המטופל. ראה איור משלים 2 תמונה של התיק המכיל כמויות שונות של נשימה.
- לפני ניתוק השקית. של דוגם הנשימה, הקפד לשחרר את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים על ידי הפעלתו התרחקותו ודחף את הגבעול של השסתום עד קרוב ההתאמה מפרץ צר. ראה איור משלים 3 צילום של השסתום התיק במצב פתוחים וסגורים.
- לנעול את השסתום התיק נסגר על ידי הפעלת את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים עם כיוון השעון.
- ניתוק השקית. של דוגם הנשימה.
- להיפטר פיו, לשים בצד את הדוגם נשימה לניקוי לפני השימוש עם מטופל אחר.
3. נשימה העברת צינורות desorption תרמית
- הסר את הצינור TD מהמקרר. הסר את הפקקים אחסון לטווח ארוך של הרכבת התחתית sorbent, באמצעות הכלי מיצוי/uncapping צינור שסופק על-ידי היצרן.
- לצרף את קצה הצינורית sorbent TD מחורץ השקית דגימה באמצעות צינורות. שים לב כי כיוון צינור חשוב, כמו TD צינורות נועדו יש אוויר זורם בכיוון אחד בלבד, החל מסוף מחורץ. שימו לב כי ההעברה של נשימה מהתיק כדי TD נעשה בתוך שעה של אוסף נשימה.
- להכניס את הקצה השני של הצינור TD הצנרת, אשר מחובר אל משאבה.
- . תפעילו את המשאבה ולהגדיר לפעול ב- 100 מ ל/דקה 10 דקות.
- לפתוח את השסתום על התיק על-ידי הפעלת התרחקותו של בורג כנף המחורצים בצד של ההתאמה כניסת ודחף את הגבעול של השסתום עד פתח כניסת ההתאמה. זה מודגם משלימה איור 4, אשר מדגים נשימה העברת לתוך צינור sorbent TD באמצעות משאבה.
- . הפעל את המשאבה, אשר יפסיק לאחר 10 דקות של אוסף
- להסיר את הצינור sorbent TD והדק את הפקקים על גבי שני הקצוות באמצעות הכלי מיצוי/uncapping צינור. כמוסות אחסון לטווח ארוך חייב להיות התהדקו בחוזקה על מנת להבטיח חותם צר-דליפה.
- מקם מדבקה בצד של כיפה אחת כדי לציין שהצינור שימש. על המדבקה, מציינים מספר זיהוי (ID) לימוד סבלני ותאריך.
- הצב צינור בתוך שקית פלסטיק קטנה sealable מחדש. צינור sorbent החנות ב 4-5 ° C. הקש את שאר הנשימה מהשק ולמחוק את התיק. להקליט את המחקר החולה מזהה, TD טורפדו מספר סידורי, אוסף היום, זמן של אוסף נשימה, זמן של נשימה, והעברת צריכת המזון (זמן של צריכת המזון לפני נשימה אוסף וארוחות הנצרכת).
4. הסביבתית אוסף
- לאסוף דגימות אויר בסביבה של החולה מיד לאחר איסוף נשימה.
- חבר את השקית ליציאה משאבת לשקע באמצעות צינורות, כמופיע באיור5 משלימה.
- לדחוף את הגבעול של השסתום התיק עד פתח כניסת ההתאמה עבור הדגימה.
- נעל פתח שסתום על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את בורג כנף המחורצים בצד כניסת ההתאמה.
- . תפעילו את המשאבה ולהגדיר לפעול ב- 100 מ ל/דקה במשך 12 דקות. המשאבה תאסוף 1200 מ של אויר.
- לאחר האחסון המבוקש נאסף, לשחרר את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים על ידי הפעלתו התרחקותו ודחף את הגבעול של השסתום עד קרוב ההתאמה מפרץ צר.
- לנעול את השסתום התיק נסגר על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את בורג כנף המחורצים בצד כניסת ההתאמה.
- ניתוק השקית מהמשאבה.
- בצע את אותם שלבים כמו בסעיף 3. ההבדל היחיד הוא את אוויר הסביבה ש-voc יועבר, לא אלה של נשימה.
5. מדגם וניתוח נתונים
הערה: היו תנאים לצורך ניתוח של דגימות נשימה ואוויר שתוארה לעיל9.
- לנתח את הנתונים שנאספו, לזהות תרכובות chromatograms. השתמש בתוכנות טיפוסי למצוא ולזהות כל התרכובות שזיהה את המכשיר (איור 3 א). לדוגמה, השתמש תכונה deconvolution כדי לזהות תרכובות. לסנן נתונים תוך שימוש בגורם גודל חלון שמירה של 80, סופרת הייטס המוני מסננים ≥100, וכן מתחם מוחלטת מסנן ≥500.
- השתמש סטנדרטים כימיים כדי לזהות תרכובות דגימות נשימה ואוויר. לחלץ את האזור שיא יון הבסיס של תרכובות של עניין, כגון איזופרן וβ-pinene (איור 4), ולהשוות את רמות שיכללו חומרים נדיפים, נשימה ואוויר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר שלנו, נשימה דגימות נאספו מ- 10 ילדים (בן 8-17 שנים) בתהליך ההערכה בבית החולים סנט לואיס לילדים. נשימה דוגמאות ודוגמאות הסביבתית (n = 10) נאספו כמתואר לעיל. דוגמאות נותחו באמצעות גז כרומטוגרפיה פאול זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (QToF-GC-MS) ו- desorption תרמית, כפי שתואר לעיל9. לאחר הסרת רקע מזהמים, הפרוטוקולים מיושמים הניב ממוצע של תרכובות אורגניות נדיפות (Voc) 311 בכל אחת הדגימות מעורב והבל הפה. בממוצע, משמעותית יותר Voc נמצאו דגימות נשימה לעומת שולט הסביבה/סביבתיים (311 ± 11.5 לעומת 190 ± 12.6, p < 0.0001) (איור 3 א). בשל מספר Voc נשימה, בהשוואה לאויר, נבדלים בעליל על-ידי השוואת נציג יון סה כ chromatograms (טיקים) (איור 3B).
כאמצעי בקרת איכות של אוסף נשימה מוצלחת, הרמות של שני Voc נשימה נפוצות (איזופרן וβ-pinene) היו לעומת חדר אוויר שולט (איור 4). איזופרן, לאחד Voc הנפוץ ביותר נשימה, נמצא בדרך כלל חלקים-לכל-מיליארד (ppb) רמות (131 ppb) בעוד β-pinene נמצא ב- sub-ppb רמות (0.59 אינצ ppb)6. שתי תרכובות מבוססים היטב כדי להעשיר נשימה של מבוגרים בריאים, לעומת רמות נמוכות מתנת באוויר החדר, אשר מציינת ותהליכים הפיזיולוגיות נורמלי כמקור העיקרי של אלה analytes נשימה6. איזופרן (מ/z 67) נמצאה בשלב השמירה 2.12 min וβ-pinene (מ/z 93) נמצאה השמירה בפעם 14.4 min. אנו מוצאים כי השפע של איזופרן היה גבוה 10-fold דגימות נשימה בילדים מאשר בפקדים אוויר החדר (איור 4; כלומר שפע ± SEM הם 4.2x105 ± 1.0x105 ו- 3.9x104 ± 0.9x104 עבור נשימה ואוויר בהתאמה, p = 0.0003) ו β-Pinene הציג שפע גבוה יותר 3-fold נשימה מאוויר (ז"א שפע ± SEM 3.0x104 ± 1.3x104 ו- 9.1x103 ± 1.6x103 עבור נשימה ואוויר בהתאמה, p = 0.007), המאשר אוסף נשימה מוצלחת. ניתוח תיאורי מלא של גילוי סמן ממצאי מחקר זה ידווחו בפרסום עתידי.
איור 1: התאספו נשימה סמפלר ו שק לאיסוף והבל הפה. סמפלר נשימה (עם שסתום כחול פתוח, קרי, מקבילי עם המחבר כפי שמציין החץ האדום דו-צדדית) התיק ומחובר עם אבובים, מוכן לאיסוף נשימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הילד ונשיפה נשימה לתוך שקית דגימה נשימה. (א) הילד מחזיק נשימה סמפלר, exhales, ומספק (B) מדגם נשימה לתוך השקית. צילום עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נשף BreathVolatiles. (א) מספר תרכובות נדיפות ברורים בכל נשימה לטעום מן הנבדקים רפואת ילדים (n = 10) ופקדים הסביבתית (n = 10). המוצגים הם האמצעים ואת שגיאת התקן של הממוצע (SEM). (B) יון סה של כרומטוגרפיה (טיק) של דגימות נשימה בילדים נציג לעומת בקרת אוויר, להמחשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שפע של שני שיכללו חומרים נדיפים והבל הפה. שפע של איזופרן ו β-pinene נשימה דגימות מן הנבדקים רפואת ילדים (n = 10) ופקדים אוויר החדר (n = 10). שפע לכמת על-ידי האזור שיא יון הבסיס. זאת אומרת SEM מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: נשימה סמפלר. שמאל: א) התאספו סמפלר נשימה: 1) מתאם זכר + ברז כדורי 2) דו-כיווני מחבר + מתאם זכר טפלון 3). B) פייה קרטון. ג) קטן, אבובים קוטר גדול. נכון: נשימה סמפלר עם פייה, אבובים המצורפת. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה איור 2: אמצעי אחסון הנשימה. מעל תמונות של שקית דגימה מלאים בנפחים שונים של אוויר (1 ליטר, 2 ל' ו- 2.5 L), כמו ייצוג חזותי של אמצעי אחסון נשימה משוער להיות שנאספו. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה איור 3: שסתום על התיק. משמאל: גזע של השסתום הוא למטה (שסתום תיק פתוח). לנעול את השסתום התיק נסגר על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את בורג כנף המחורצים בצד כניסת ההתאמה. התיק מוכן לאיסוף נשימה. נכון: גזע של השסתום קורה (שסתום שקית סגורה). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה באיור 4: העברה נשימה. שמאל: הרכבת התחתית sorbent (1) מחובר בקצה אחד של התיק באמצעות צינורות בקוטר קטנים וגדולים, בצד השני, המשאבה. נכון: הערה סוף מחורץ ברכבת התחתית sorbent; סוף מחורץ פונות השקית הדגימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
משלימה איור 5: אוסף הסביבתית. שמאל: משאבה עם שתי יציאות: כניסת ו עודפים. הנמל שקע מחובר לתיק הדגימה. הנמל כניסת לצייר הסביבתית ולהעביר אותו לשקית. נכון: הסביבתית אוסף מערכת מורכבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות התקדמות ניכרת בחקר הנשימה בעשור האחרון, נהלים סטנדרטיים עבור דגימה וניתוח של נשימה גז שיכללו חומרים נדיפים נשאר לא מוגדר10. הסיבות העיקריות על היעדר סטנדרטיזציה כבר המגוון של שיטות איסוף נשימה, אשר יש השפעה ישירה על המגוון כימי שנוצר נוכח דוגמה נתון והבל הפה. נשימה exhalate מכיל מגוון רחב של תרכובות אורגניות נדיפות ריכוזים מאוד מגוונת6. לכן, שינוי שיטות ליקוט משנה לא רק את השפע, אלא גם את המגוון של תרכובות שעלולות להופיע במדגם נתון.
דיגום גז נשימה מורכבת באופן מפתיע. בעוד נושאים צריך רק לנשוף לתוך פיו של אספן נשימה או מיכל גז חזק לפני ניתוח, נשימה דגימה עליך לקחת בחשבון ושליטה עבור מספר משתנים פוטנציאליים. בעבודה זו, אנו מפרטים פרוטוקול ספציפי, לאמת לדיגום גז הנשימה אצל ילדים. בעבר בהצלחה יישמנו פרוטוקול זה עם צעיר כמו 4 שנים של גיל, בתרחיש שדה באווירה משאב מוגבל (מלאווי), קודח לילדים הממחיש את הכדאיות של צינורות איסוף וניתוח שלנו בנשימה על סמן גילוי9. לאחר מכן, יש גם מיושמת ואנו הערכה שלנו פרוטוקולים עבור אוסף דגימות נשימה מילדים תחת הערכה במרפאה המודרנית מגמת רפואת ילדים בארצות הברית. התוצאות שלנו מראים כי עבור גילוי של סמנים ביולוגיים נשימה בילדים, האוסף של אוויר מעורב הוא קריטי, כפי שהיא מספקת אמיתי "breathprint" של אדם נתון. בנוסף, מעורבות expiratory נשימה היא גם הסוג הפשוט ביותר של נשימה ניתן להשיג, כי בכל השלבים של אוויר בריכוז (הפה ואת האף) רכשה3.
בשטח, במיוחד כאשר נושאים הם בחריפות חולה, זה יכול להיות קשה לשליטה בשביל confounders נפוצים כגון תזונה, טמפרטורת הגוף, ו/או שימוש ניחוח או קרמים על ידי נושא נתון. גורמים אלה עשויים להיות השפעה עמוקה על נשימה רמות ועל איכות. מסיבה זו, אנו ממליצים החוקרים לא רק לרשום את הזמן של אוסף נשימה, העברת צינורות sorbent, אבל שים לב גם של גורמים נוספים החולה הספציפי כגון דיאטה (למשל, 24 שעות ביממה תזונתיים האחזור), השתמש לשטיפת הפה ושימוש תרופות, על מנת להעריך באופן ספציפי על ההשפעות של confounders פוטנציאליים אלה במהלך גילוי סמן וניתוחים במורד הזרם.
תרכובות בשאיפה מהאוויר הסביבה יכול להשפיע גם ההרכב של והבל הפה, אשר עשוי להוות אתגר למאמצים גילוי סמן נשימה. לכן, ניתוח ואוסף של אויר הוא פקד קריטי, מניבים תובנות חשובות בנוגע למקור של שיכללו חומרים נדיפים והבל הפה. לדוגמה, אויר הפכפך פרופילים שימשו כדי לקבוע נשימה נתון תנודתי-שפע גבוהה או נמוכה יותר נשימה בהשוואה סביב אוויר11. תרכובת נשימה מסוים ובכך נחשב להיגזר בתוך הגוף (למשל, ממקור אנדוגני) אם הריכוז גבוהה נשימה מאשר באוויר פתוח, בעוד בריכוז נשימה מציין את התרכובת נגזר מן הסביבה (למשל, אקסוגני המקור). השוואה בין שפע נדיף נשימה לעומת הסביבתית משמש גם פקד חיובית חשוב עבור אם אוסף נשימה היא נאותה. כפי שמתואר בנתוני הנציגה שלנו (איור 4), איזופרן תרכובת נדיפים הוא ממקור אנדוגני, צריך להיות נוכח בחדר דגימות נשימה בריכוזים > 10 פעמים זה של תאורת הסביבה אוויר6.
עבור גילוי סמן, פרופילים נדיף מאנשים עם תנאי הריבית יש להשוות ליחידים בקרה בריאים תואמים, כך דפוסי ניתן לזהות באמצעות טכניקות סטטיסטיות למידה חישובית, multivariate ניתוחים12. אוסף נשימה השיטה המתוארת כאן יכול להיות מיושם למגוון רחב של מצבים פתולוגיים; הדרישה היחידה היא שהילד הוא מסוגל לשתף פעולה עם נשימה מדגם בהתנדבות. כי בדיקות נשימה אינה פולשנית, חזר בקלות, ומשקף היטב את עורקי ריכוזי חומרים ביולוגיים, היא מחזיקה הבטחה גדולה ליישום בשלב של טיפול בדיקה לשימוש קליני.
עבודה עתידיות יתמקדו בפיתוח שיטות חדשות לאוסף נשימה צעיר בתינוקות וילדים (< 4 שנים של גיל), שלא מסוגלים נכה נשוף לפי פקודה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מביעים את הכרת התודה שלנו ילדים ובני משפחותיהם של החולים סיינט לואיס לילדים שהשתתפו במחקר זה. אנו להכיר המאמצים ייחודי של גב' סטייסי פוסטמה, גברת ג'נט Sokolich במהלך איסוף נשימה. עבודה זו נתמכת על ידי קרן בית החולים לילדים סנט לואיס.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse? Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
