Summary
该协议描述了一种从儿童身上采集呼吸样本的简单方法。简单地说, 混合空气样品在气相色谱-质谱分析之前, 先在吸附剂管中进行预浓缩。使用这种呼吸收集方法可以确定传染病和非传染性疾病的呼吸生物标志物。
Abstract
呼吸收集和分析可用于发现疟疾、结核病、肺癌和肝病等一些传染病和非传染性疾病中的挥发性生物标志物.该协议描述了一种可重复的方法, 用于在儿童中采样呼吸, 然后稳定呼吸样本, 以便使用气相色谱-质谱联用 (gc-ms) 进行进一步分析。这种方法的目的是建立一个标准化的协议, 从4-15 的儿童身上采集呼吸样本, 以便进一步进行化学分析。首先, 使用连接到双向阀门上的纸板喉舌对呼吸进行采样, 该口子连接到3l 袋上。呼吸分析物然后被转移到热解吸管中, 并存储在 4-5, 直到分析。这种技术以前已被用来捕捉疟疾儿童的呼吸, 以成功地识别呼吸生物标志物。随后, 我们成功地将这一技术应用于其他儿科队列。这种方法的优点是, 它需要患者的最低限度的合作 (在儿科人口中具有特殊价值), 收集时间很短, 不需要训练有素的工作人员, 可以使用便携式设备在资源有限的字段设置。
Introduction
生物标志物可以产生关于正常和病理生物过程的有价值的信息, 这些过程可能导致临床可识别的疾病。最近, 人们越来越关注将呼吸挥发物作为各种疾病状态的生物标志物进行评估, 包括感染、代谢紊乱和癌症1。呼气含有可量化的挥发性有机化合物 (vocs)、半挥发性有机化合物和微生物衍生材料 (例如细菌和病毒的核酸)。呼气分析的中心目标是深入了解非侵入性医疗状况和/或环境暴露的状况。根据感兴趣的成分, 有多种方法可以收集和分析呼气。目前还没有标准化的呼气采集方法, 这使得对各种研究结果的比较分析复杂化。标准化的呼吸收集程序至关重要, 因为取样程序本身对呼吸分析的下游结果有相当大的影响。
在许多研究中, 呼吸后期采样采用了2,3.这种采样包括丢弃呼气的初始部分 ("死空间"), 以便在呼吸周期结束时优先捕捉空气。这种策略的优点是, 它最大限度地减少了外源 voc (如环境挥发性有机化合物) 的水平, 同时丰富了内生的、针对患者的挥发性有机化合物。此方法排除在收集呼吸样本之前从单个中呼出的前几秒钟。其他研究人员使用压力传感器在预定义的到期阶段激活采样4,5。由于压力传感器需要复杂的工程, 这种替代方法需要专用且成本相对较高的采样装置。
儿童呼吸采样可能特别具有挑战性。一个主要关切是, 幼儿可能无法配合自愿呼出 "死空间" 空气的议定书。因此, 从儿童身上获得混合呼吸更容易。然而, 混合呼吸样本的一个主要警告是环境和材料污染的风险。因此, 儿科收藏的可行性是该领域的一个驱动问题。
此外, 对于采集方法, 呼吸样品的储存也会影响样品的质量。呼吸中的高湿度和挥发性有机呼吸化合物的超低浓度 (每万亿分之) 使得呼吸样本特别容易受到与储存6,7有关的问题的影响。尽管质子转移反应质谱 (ptr-ms) 等实时技术潜力巨大, 但 gc-ms 仍然是分析呼吸样本的黄金标准。由于气检的 gc-ms 分析是一种离线技术, 它与预浓缩方法 (如热解吸管、固相微萃取和针陷阱装置) 相结合。在预浓缩之前, 呼吸样品需要暂时储存在聚合物袋中8。聚合物袋之所以受欢迎, 是因为它们价格适中, 耐久性相对较好, 可重用性强。虽然袋子可以重复使用, 但需要时间和精力来确保高效清洁7,8。每种特定的包类型还需要经过经验确定和标准化的程序来进行质量控制、可重用性和恢复。
td 管被广泛用于呼吸预浓缩, 因为它们捕获大量挥发物, 并且可以定制。用于包装 td 管的吸收材料可适用于特定的应用和感兴趣的特定目标挥发物。td 管极大地提高了呼吸生物标志物研究的便利性, 特别是在偏远的现场, 因为 td 管安全地储存呼吸挥发物至少两周, 并且易于运输3。
为了规范儿童的呼吸收集生物标志物的发现, 我们在这里描述了一个简单的方法来收集幼儿的呼吸。为了说明已实施的方案的代表性结果, 正在进行非酒精性脂肪酸肝病 (nafld) 评估的儿童 (8-17) 中提供了被取消识别的数据。这项研究的全部结果和分析将在以后的出版物中报告。在这项工作中, 我们报告了一个数据子集, 以演示我们协议的应用。简单地说, 孩子们被指示通过喉舌正常呼气到一个聚合物袋子里, 就像 "吹气球" 一样。这个过程重复2-4 次, 直到收集到1升的呼吸。然后将样品转移到 td 管中, 并在 gc-ms 分析之前在5°c 下储存。
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Protocol
这项研究已得到华盛顿大学医学院机构审查委员会 (#201709030) 的批准。在纳入研究报告之前, 必须征得父母或法定监护人的知情同意。图2中的照片在父母书面知情同意的情况下转载。
1. 呼吸采样器总成
- 使用一次性手套, 在呼吸采样器上安装一个纸板喉舌, 如补充图 1所示。将短长度的大直径油管连接到呼吸采样器的另一个极端, 如补充图 1所示。为每个病人使用新的导管。
- 通过管道将呼吸接头连接到袋阀上。有关连接的呼吸采样器和包的照片, 请参见图 1 。
- 逆时针转动进气口接头一侧的滚花拇指螺钉, 解锁阀门, 向下推袋阀杆, 打开进气道接头进行取样。
- 将阀门锁上, 顺时针旋转进气口安装一侧的滚花拇指螺钉。
- 确认呼吸采样器上的蓝色阀门是打开的 (与连接器平行)。
- 在聚合物袋的标签上写上病人的身份证、日期和时间。
- 使用推荐的程序 (可从个别制造商处获得) 在呼吸收集前使用的条件 td 吸附剂管。在吸气收集前, 将热解吸管盖好并存放在 4–5°c, 以最大限度地减少伪影。
2. 呼吸收集
- 使用呼吸采样器 (不带袋子) 向孩子进行呼气演示。向孩子解释, 他们应该像 "吹气球" 时那样呼气, 尽可能舒服地继续呼气。把纸板喉舌夹在嘴唇之间, 尽可能地呼气。
- 为孩子提供一个新的呼吸采样器连接到一个袋子, 并要求他们呼气, 如图 2所示。
- 孩子一呼吸完毕, 就关闭呼吸采样器装置上的蓝阀。在额外呼气之前, 根据需要重新打开阀门。
- 重复步骤2.2 和 2.3, 直到收集到至少1升的呼吸。对于健康的孩子, 这可能需要2次呼气, 对于生病或更小的孩子, 可能需要2-4 次呼气。1 l 呼吸是最低限度的分析要求。在袋子标签上注意从病人那里收集了多少次呼吸。有关包含不同呼吸量的袋子的照片, 请参见补充图 2 。
- 在从呼吸采样器上分离袋子之前, 请确保将其逆时针转动, 并将阀门的阀杆向上推, 以关闭进气接头, 从而松开进气接头一侧的滚花拇指螺钉。有关在打开和关闭位置的袋阀的照片, 请参见补充图 3 。
- 顺时针转动进口管接头一侧的滚花拇指螺钉, 将包阀锁定。
- 从呼吸采样器中拆下袋子。
- 在与其他病人一起使用之前, 将喉舌放在一边, 以便清洗呼吸采样器。
3. 呼吸转移到热解接管
- 从冰箱中取出 td 管。使用制造商提供的管材封盖工具, 取下吸附剂管的长期储存盖。
- 使用管道将 td 吸附剂管的槽端连接到取样袋上。请注意, 管方向很重要, 因为 td 管的设计仅让空气向一个方向流动, 从沟槽端开始。请注意, 从袋子到 td 的呼吸转移应在呼吸收集后1小时内完成。
- 将 td 管的另一端插入连接到泵的管道中。
- 打开泵, 设置为以 100 mL/min 运行10分钟。
- 通过逆时针旋转进气道接头一侧的滚花拇指螺钉打开袋子上的阀门, 然后向下推阀门的阀杆打开进气道接头。这在补充图 4中得到了说明, 它演示了使用泵将呼吸转移到 td 吸附剂管中。
- 启动泵, 收集10分钟后将停止。
- 使用管封盖工具卸下道明吸附剂管, 并将瓶盖拧紧两端。必须牢固地拧紧长期储存盖, 以确保密封密封不安全。
- 在一顶瓶盖的末端贴上标签, 表示已使用管。在贴纸上, 注明患者学习识别 (id) 号和日期。
- 将管子放入一个可重新密封的小塑料袋中。将吸附剂管存放在4–5°c。按下其余的呼吸出的袋子和丢弃袋。记录患者学习 id、td 管序列号、收集日、呼吸收集时间、呼吸转移时间和食物摄入量 (呼吸收集前的食物摄入量和进食时间)。
4. 环境空气收集
- 呼吸采集后, 立即收集患者环境中的环境空气样本。
- 使用管道将袋子连接到泵出口端口, 如补充图 5所示。
- 向下推袋阀的阀杆, 打开进气管接头进行取样。
- 通过顺时针转动进气管接头一侧的滚花拇指螺钉将阀门锁定打开。
- 打开泵, 以 100 mL/min 的速度运行12分钟。该泵将收集1200毫升的环境空气。
- 收集所需的体积后, 将其逆时针转动, 并将阀门的阀杆向上推, 以关闭进气道接头, 从而松开进口管接头一侧的滚花拇指螺钉。
- 通过顺时针转动进气配件一侧的滚花拇指螺钉, 将包阀锁定。
- 把袋子从泵上拆下来。
- 按照第3节中的步骤执行相同的操作。唯一不同的是, 环境空气中的挥发性有机化合物将被转移, 而不是那些从呼吸。
5. 样本和数据分析
注: 呼吸和空气样品的分析条件已在前面描述9。
- 分析收集到的数据并检测色谱图中的化合物。使用典型的软件程序查找和识别仪器检测到的所有化合物 (图 3 a)。例如, 使用反卷积特征来识别化合物。过滤数据使用保留窗口大小系数 80, 质量高度过滤器≥100计数, 和复合绝对面积过滤器≥500计数。
- 使用化学标准来识别呼吸和空气样本中的化合物。提取有关化合物 (如异戊烯和β-pinene) 的碱性离子峰面积 (图 4), 并比较呼吸和空气中挥发物的含量。
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Representative Results
在我们的研究中, 从圣路易斯儿童医院接受评估的10名儿童 (8-17) 采集了呼吸样本。如上文所述, 采集了呼吸样本和环境空气样本 (n = 10)。如前面所述, 使用气相色谱四极飞行时间质谱 (gc-qtof-ms) 和热解吸法对样品进行了分析。在去除背景污染物后, 已实施的协议在每个混合呼气样品中平均产生311种挥发性有机化合物 (vocs)。平均而言, 与环境对照相比, 呼吸样本中的挥发性有机化合物明显增多 (311±11.5, 对 190±12.6, p < 0.0001) (图 3 a)。与周围空气相比, 呼吸中挥发性有机化合物数量的增加, 通过比较具有代表性的总离子色谱图 (tics) 可以明显区分 (图 3b)。
作为成功采集呼吸的质量控制措施, 将两种常见呼吸的挥发性有机化合物 (异戊烷和β-pinene) 的水平与室内空气控制进行了比较 (图 4)。异戊烯是呼吸中最丰富的挥发性有机化合物之一, 通常在人均 10亿 (13伏) 水平 (131 ppb) 中发现, 而β-pinene 则在亚ppb 水平 (0.59 ppb)6中发现。这两种化合物都被证实可以在健康的成年人的呼吸中得到丰富, 而室内空气中的低水平则表明, 正常的生理过程是呼吸中这些分析物的主要来源.在保留时间发现异戊烯 (m/z67) 2.12 分, 在保留时间发现β-pinene (m/z93), 为14.4 分。我们发现, 在儿科呼吸样本中, 异戊烷的丰度是室内空气控制的 10倍 (图 4; 平均含量±sem 为 4.2x10 5±0x105和 3.9x104±0.9 x10 4 用于呼吸和空气 分别为呼吸和空气, p = 0.0003) 和β-pinene 的呼吸丰度比空气高 3倍 (平均丰度±sem 分别为 3.0x10 4±1.3 x104和 9.1 x10 3±1.6 x103 , p = 0.007), 确认成功的呼吸收集。这项研究对生物标志物发现结果的全面描述性分析将在未来的出版物中报告。
图 1: 组装呼吸采样器和袋呼气的呼吸收集.呼吸采样器 (蓝色阀门打开, 即平行连接器, 如双面红色箭头指示) 和袋连接的油管, 准备呼吸收集。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 儿童呼气进入呼吸采样袋.(a) 儿童手持呼吸采样器, 呼气, (b) 将呼吸样本放入袋子中。经允许拍照。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 呼出的呼吸膨胀.(a) 来自儿科研究对象 (n = 10) 和环境空气控制 (n = 10) 的每个呼吸样本中不同挥发性化合物的数量。显示的是均值 (sem) 的手段和标准误差。(b) 具有代表性的儿科呼吸样本的总离子色谱仪 (tic) 与空气控制, 用于可视化。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 两个呼出的呼吸挥发物的丰富程度.儿童患者呼吸样本中异戊烯和β-松烯的丰富性 (n = 10) 和室内空气控制 (n = 10)。由基子峰面积量化的丰度。显示平均值和扫描电镜。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 呼吸采样器.左:a) 组装呼吸采样器: 1) 男性适配器 + 2) 双向球阀连接器 + 3) 聚四氟乙烯男性适配器。b) 纸板喉舌。c) 小直径和大直径油管。右:呼吸采样器, 并附有喉舌和管材。请点击此处下载此文件.
补充图 2: 不同的呼吸量.上面是一个充满不同空气体积 (1 升、2升和 2.5 l) 的取样袋的图片, 作为要收集的近似呼吸量的视觉表示。请点击此处下载此文件.
补充图 3: 袋子上的阀门.左: 阀杆向下 (袋阀打开)。通过顺时针转动进气配件一侧的滚花拇指螺钉, 将包阀锁定。袋子已经准备好呼吸收集了。右:阀杆向上 (袋阀关闭)。请点击此处下载此文件.
补充图 4: 呼吸转移.左:用小直径和大直径的油管连接到袋子的一端, 另一端连接到泵上的吸附剂管 (1)。右:注意在吸附剂管上的凹槽末端;凹槽端应指向取样袋。请点击此处下载此文件.
补充图 5: 环境空气收集.左:泵有两个端口: 入口和出口。出口端口连接到取样袋上。入口端口将绘制环境空气并将其转移到袋子中。右:组装环境空气收集系统。请点击此处下载此文件.
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Discussion
尽管在过去十年中在呼吸研究方面取得了相当大的进展, 但对呼吸气体挥发物进行取样和分析的标准化做法仍未确定10。缺乏标准化的一个主要原因是呼吸收集方法的多样性, 这直接影响到任何特定呼气样本中由此产生的化学多样性。呼气液含有广泛的挥发性有机化合物, 浓度千差万别.因此, 改变收集方法不仅改变了特定样品中可能存在的化合物的丰度, 也改变了化合物的多样性。
呼吸气体采样是令人惊讶的复杂。虽然受试者在分析之前只需呼出呼吸收集器的喉舌或气密容器, 但呼吸采样必须考虑和控制一些潜在的变量。在这项工作中, 我们详细介绍了一个具体的, 验证方案的呼吸气体采样的儿童。此前, 我们在资源有限的环境下 (马拉维) 成功地与4岁以下的发热儿童一起实施了这一协议, 这证明了我们收集和分析生物标志物管道的可行性发现9。随后, 我们还在美国一家现代化的儿科专科诊所实施并评估了从接受评估的儿童中收集呼吸样本的方案。我们的研究结果表明, 对于发现儿科呼吸生物标志物, 混合空气的收集至关重要, 因为它提供了一个特定个体的真正 "呼吸打印"。此外, 混合呼气也是最简单的类型, 可以获得, 因为呼气的空气 (嘴和鼻腔) 的所有阶段都是获得3。
在现场, 特别是当研究对象患有急性疾病时, 可能很难控制常见的混淆物, 如饮食、体温、/或特定对象使用香水或乳霜。这些因素可能会对呼吸水平和质量产生深远的影响。因此, 我们建议调查人员不仅记录采集呼吸和转移到吸附剂管的时间, 而且还注意到其他患者特定的因素, 如饮食 (如24小时饮食召回)、使用漱口水和药物使用, 以便在生物标志物发现和下游分析过程中, 具体评估这些潜在混淆物的影响。
从周围空气中吸入的化合物也会影响呼气的成分, 这可能会对呼吸生物标志物的发现工作构成挑战。因此, 分析和收集环境空气是一个关键的控制, 产生了重要的见解的起源呼气挥发物。例如, 环境空气挥发性剖面被用来确定与周围空气相比, 某一呼吸挥发性的呼吸丰度是较高还是较低。因此, 如果一种特定的呼吸化合物在呼吸中高于周围空气, 则认为该化合物来自体内 (例如内源), 而呼吸浓度的降低表明化合物来自环境(例如, 外源)。比较呼吸中的挥发性丰度和周围空气也是一个重要的积极控制是否呼吸收集是足够的。正如我们的代表性数据 (图 4) 所示, 挥发性化合物异戊烷是内生来源, 应以环境空气6的浓度和 gt;10 倍存在于呼吸样本中.
对于生物标志物的发现, 必须将来自有兴趣条件的个体的挥发性特征与匹配的健康控制个体进行比较, 这样就可以使用机器学习和多元等统计技术来识别模式分析12。这里描述的呼吸收集方法可以应用于广泛的病理状态;唯一的要求是孩子能够自愿配合呼吸采样。由于呼吸检测是非侵入性的, 容易重复, 并密切反映了生物物质的动脉浓度, 因此在临床使用的护理点检测中具有很大的应用前景。
今后的工作将侧重于开发幼儿和儿童 (< 4岁) 的新方法, 他们在发育过程中无法根据命令呼气。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢参加这项研究的圣路易斯儿童医院的儿童和家庭。我们感谢斯泰西·波斯马女士和珍妮特·索科利奇女士在呼吸收集过程中作出的独特努力。这项工作得到圣路易斯儿童医院基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
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