Summary
このプロトコルでは、子供からの息のサンプルの獲得のための簡単な方法について説明します。簡単に言えば、混合空気のサンプル事前ガスクロマトグラフィー質量分析の前に吸着管に集中しています。感染性と非感染性疾患の呼吸のバイオ マーカーは、この息のコレクション メソッドを使用して識別できます。
Abstract
息の収集と分析は、感染・非感染症、マラリア、結核、肺癌、肝疾患.など多数の揮発性のバイオ マーカーを発見する使用ことができます。このプロトコルでは、子供たちの息をサンプリングし、採取のガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) と詳細な分析を安定化の再現可能な方法について説明します。このメソッドの目的は、採取 4-15 歳のお子様から、さらに化学分析のための獲得のための標準化されたプロトコルを確立することです。まず、息をサンプリングし、3 L のバッグに接続されている 2 ウェイ バルブに接続されている段ボールのマウスピースを使用します。息 analytes は熱脱離チューブに転送し、解析まで 4-5 ° C で保存します。この手法は、以前成功した息のバイオ マーカーの同定のためマラリア児の息をキャプチャするために使用されています。その後、我々 が追加小児コホートにこの手法を応用.この方法の利点は、それ (小児集団における特定の値) の患者の一部の最小限の協力が必要です、短い回収期間は、訓練を受けたスタッフを必要としないポータブル機器で実行できます。リソースの限られたフィールドの設定。
Introduction
バイオ マーカーは臨床的に識別可能な病気に貢献するかもしれない正常および病的の生物学的プロセスに関する貴重な情報をもたらすことができます。最近、さまざまな病気の状態、感染症、代謝性疾患、がん1などのバイオ マーカーとしての息の揮発性物質の評価が注目されています。呼気には、微生物派生材料 (例えば、核酸から細菌、ウイルス)、半揮発性有機化合物揮発性有機化合物 (Voc) の定量化可能なレベルが含まれています。呼気分析の中心的な目標は、非侵襲的医療条件および環境の露出の状態に洞察力を得ることです。収集および興味の成分によって、呼気を分析するさまざまな方法があります。現時点で研究結果の比較分析を複雑にする標準化された呼気コレクション メソッドはありません。サンプリング プロシージャ自体呼吸解析の下流の結果にかなりの効果があり、息コレクション手順の標準化が不可欠です。
多くの研究で後半呼吸息のサンプリングは雇われた2,3です。このサンプリングは、優先的に呼吸周期の終わりに空気をキャプチャするために呼気 (「デッド スペース」) 最初部分を破棄することを含みます。この方式の利点は、内因性、患者固有の豊かな中外因性 VOC (例えば、環境 Voc) のレベルを最小限に抑えられます。このメソッドは、息のサンプルを収集する前に個人からの呼気の最初の数秒間を除外します。他の研究者は有効期限4、5の定義済みの段階でサンプリングを有効にする圧力センサーを採用しています。圧力センサーは、複雑な工学を必要とするため、この代替方法には献身的で比較的高価なサンプリング デバイスが必要です。
小児呼吸サンプリングを特に困難になることができます。主な懸念は、幼児が自発的呼気「デッド スペース」空気のためのプロトコルと協力することがないことです。このため、子供たちから混合呼吸息を取得する簡単です。しかし、混合呼吸器呼気と主要な警告は環境や材料の汚染の危険性です。したがって、小児コレクション性はフィールドで運転は問題です。
また、収集方法、息試料の保存することができますもサンプルの質に影響。息 exhalate、揮発性有機化合物作る息採取ストレージ6,7に関連する問題に特に敏感超低濃度 (兆ごとの部分) で湿度が高い。プロトン移動反応質量分析計 (PTR MS) のようなリアルタイム技術の偉大な潜在性にもかかわらず GC-MS のまま息のサンプルの分析のためのゴールド スタンダードです。呼気のガスクロマトグラフィー質量分析がオフライン手法と、熱脱着 (TD) チューブ、固相マイクロ抽出、ニードル トラップ デバイスなど前濃度方法それ結合されます。前濃度前に呼気をポリマー袋8に一時的に保存する必要があります。ポリマー袋は、適度な価格、比較的よい耐久性および再利用性のため人気があります。中袋は再利用、時間と労力が効率的な清掃7、8を確認しておく必要。各特定の袋タイプも品質管理、再利用性、および回復の経験的に断固としたな、標準化されたプロシージャが必要です。
TD チューブを彼らは揮発性物質の数が多いをキャプチャし、カスタマイズすることができますので、広く息前濃度に使用されます。TD チューブを梱包に使用される吸収性材料は、特定のアプリケーションや興味の特定のターゲットを揮発性物質に適応させること。TD チューブ実質的に息バイオ マーカー研究、特に遠隔地の利便性の向上、TD チューブ安全ので、少なくとも 2 週間の息の揮発性物質を保管、輸送3易い。
バイオ マーカー探索に小児呼吸コレクションを標準化する努力、ここで我々 は幼児から息を収集する簡単な方法をについて説明します。実装プロトコルの代表の結果を示すためには、匿名化したデータを提示する子供 (年齢 8-17) の継続的コホートからアルコールの脂肪酸の肝臓病 (NAFLD) に対する評価を受けています。全結果と本研究の分析より遅い出版物で報告されます。この作業では、プロトコルのアプリケーションを実証するデータのサブセットを報告します。まるで「風船をふくらまして「簡単に言えば、子供を指示し通常マウスピースを介してポリマー袋の中に息を吐き出すに息の 1 L が収集されるまで、プロセスは 2-4 回を繰り返されます。サンプルは TD チューブに転送し、ガスクロマトグラフィー質量分析の前に 5 ° C で保存します。
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Protocol
研究は、制度のレビュー ボードのワシントン大学医学部 (#201709030) によって承認されています。親または研究の包含前に保護者からインフォームド コンセントを得た。図 2の写真は、書面による通知保護者の同意で再現。
1. 息サンプラー アセンブリ
- 使い捨て手袋を使用すると、補足図 1に示すよう、段ボールのマウスピースを息サンプラーに取り付けます。補足図 1に示すように、息のサンプラーの他の極端に大口径チューブの短い長さを取り付けます。患者ごとに新しいチューブを使用します。
- チューブを介して袋弁に息コネクタを取り付けます。息サンプラーと接続されているバッグの写真は、図 1を参照してください。
- 反時計回りにバルブのロックを解除する継ぎ手入口側にローレットつまみを回すと押し袋弁の茎、サンプリング用の継手入口を開くには。
- 時計回りに継ぎ手入口側にローレットつまみを回すことによって弁の開閉をロックします。
- 息サンプラーの青いバルブが開いていることを確認 (コネクタと平行)。
- ポリマー袋のラベルに患者 ID、日付、および時刻を書きます。
- 条件 TD 吸着管息コレクションを使用する前は、(個々 の製造業者から利用可能) の手順をお勧めします。キャップ、アーチファクトを最小限に抑えるため息コレクション前に 4 ~ 5 ° C で熱脱離チューブを格納します。
2. 息コレクション
- 子供に呼吸の呼気のデモを実行するには、(袋) なし息サンプラーを使用します。「風船爆破」ときだろうか彼らが快適にできる限り息を吐き続けるような息を取得する必要があります彼らの子供に説明します。あなたの唇とマウスピースを段ボールと限りすることができます息を吐き出します。
- バッグに接続されている新しい息サンプラーを子供に提供してもらう、デモのように息を図 2に示すよう。
- 子供が息を吐き終わったすぐに息サンプラー デバイスの青いバルブを閉じます。追加キラーズの前に必要に応じて、バルブを開きます。
- 息の少なくとも 1 L が収集されるまでは、2.2 と 2.3 の手順を繰り返します。健常児 2 キラーズをかかることがありますこの、病気や若い子 2-4 キラーズ。息の 1 L は、最低限の分析要件です。患者から採取したどのように多くの呼吸バッグのラベルに注意してください。息の異なるボリュームを含む袋の写真の補足図 2を参照してください。
- 息サンプラーからバッグをデタッチする前にそれを反時計回りに回すことにより継ぎ手入口側にローレットをゆるめます確認し、閉じる入口継手までバルブのステムをプッシュします。オープンおよびクローズ ポジションで袋弁の写真の補足の図 3を参照してください。
- 袋弁を時計回りに継ぎ手入口側にローレットつまみを回して閉めをロックします。
- 息サンプラーからバッグをデタッチします。
- マウスピースの処分し、異なる患者に使用する前に洗浄するため息サンプラーを脇に置きます。
3. 呼吸熱脱離チューブに転送
- TD チューブを冷蔵庫から取り出します。メーカー提供のチューブ キャップ/コレク ツールを使用して、吸着管の長期的なストレージ ・ キャップを取り外します。
- チューブを使用してサンプリング バッグに TD の吸着管の溝の端を接続します。管の向きが重要、TD としてチューブ、溝の端から始まってだけ、1 つの方向に流れる空気を持っている設計されて ことに注意してください。息コレクションの 1 時間以内 td バッグから息の転送が行われることに注意してください。
- TD チューブのもう一方の端をポンプに接続されているチューブに挿入します。
- ポンプをオンにして、100 mL/min で 10 分間で実行する設定。
- 入口継手側にローレットつまみを反時計回り回して袋にバルブを開き、開く入口継手にバルブのステムをプッシュします。これは、補足図 4ポンプを使用して TD 吸着管に息転送について説明するに示します。
- コレクションの 10 分後停止するポンプを起動します。
- TD 吸着チューブ、チューブ キャップ/コレク ツールを使用して、両端にキャップを締めます。リーク気密シールを確保するために長期的なストレージ ・ キャップをしっかりと締める必要があります。
- チューブが使用されているを示す 1 つのキャップの端にステッカーを配置します。ステッカーの患者の診療識別 (ID) 番号と日付を示します。
- 小さな再密封可能なビニール袋にチューブを置きます。4-5 ° C でストア収チューブ袋の中から息の残りの部分を押し、袋を破棄します。患者の診療の記録 ID、TD チューブ シリアル番号、収集日、息コレクションの時間、息転送と摂餌量 (呼吸コレクションおよび消費の食事の前に食物摂取の時間) の時間。
4. 周囲の空気のコレクション
- 息のコレクションの直後に患者の環境で周囲の空気のサンプルを収集します。
- ポンプ排気ポートにバッグを添付する補足の図 5に示すように、チューブを使用します。
- 開くサンプリング用入口継手袋弁の茎をプッシュします。
- 入口継手側にローレットつまみを時計回りに回してバルブを開くをロックします。
- ポンプをオンにして、12 分の 100 mL/分で実行する設定。ポンプは、大気の 1,200 mL を収集します。
- 要求されたボリュームが収集されたあとそれを反時計回りに回すことにより継ぎ手入口側にローレットをゆるめます、閉じる入口継手までバルブのステムをプッシュします。
- 袋弁を入口継手側にローレットつまみを時計回りに回して閉めをロックします。
- ポンプからバッグをデタッチします。
- セクション 3 と同じ手順に従ってください。唯一の違いは、その大気中 VOCs を移管、息からです。
5. サンプルとデータ解析
注: 呼吸と空気のサンプルの分析のための条件がされている9で説明しました。
- 収集したデータを分析し、クロマト グラムの化合物を検出します。典型的なソフトウェア プログラムを使用して検索および計測器 (図 3 a) によって検出されたすべての化合物を識別します。たとえば、化合物を識別するためにデコンボリューション機能を使用します。80 の保存ウィンドウ サイズ係数を使用してデータをフィルター処理、大量ハイツ フィルター ≥100 カウント、および化合物の絶対領域フィルター ≥500 をカウントします。
- 呼吸と空気サンプルでアイデンティティ化合物化学の標準を使用します。イソプレンおよび β-ピネン (図 4) など、関心の化合物の基本イオン ピーク領域を抽出し、息や空気の揮発性物質のレベルを比較します。
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Representative Results
私たちの研究では 10 人の子供 (8-17 歳) から採取した息はセントルイス小児病院での評価を受けています。息と周囲の空気サンプルが (n = 10) 上記のように収集されました。上記9におけるガスクロマト グラフ四重極飛行時間質量分析 (GC-QToF-MS) と熱脱着, を使用して行なった。バック グラウンド汚染物質を除去した後実装されたプロトコルは混合呼気サンプルのそれぞれの 311 揮発性有機化合物 (Voc) の平均をもたらした。多くの揮発性有機化合物がアンビエント/環境コントロールに比べて呼吸サンプルで発見された大幅を平均では、(311 ± 11.5 対 190 ± 12.6、 p < 0.0001) (図 3 a)。呼吸で、周囲の空気と比較して Voc の増加数は、総イオンの代表的なクロマト グラム (TICs) (図 3 b) を比較することによって目に見えて区別されます。
成功した息コレクションの品質管理対策として一般的な息 Voc (イソプレンおよび β-ピネン) は、2 つのレベルは、室内空気コントロール (図 4) と比較されました。イソプレン、呼吸で、最も豊富な揮発性有機化合物の 1 つは、β-ピネンがサブ ppb レベル (0.59 ppb)6で見つかった通常部品あたり億 (ppb) レベル (131 ppb) で発見されます。両方の化合物は、息6これらの analytes の主なソースとして正常な生理学的なプロセスを示す部屋の空気に存在する低レベルと比較すると、健康な成人の呼吸の豊かさに定評。イソプレン (m/z 67) が発見された保持時間 2.12 分と β-ピネン (m/z 93) は保持、時間 14.4 分。我々 はイソプレンの豊かさの 10 倍高かった (図 4; 平均豊富 ± SEM が 4.2x105 ± 1.0x105 3.9x104 ± 0.9x104息や空気のため室内空気コントロールでよりの小児の呼気を見つけるそれぞれ、 p = 0.0003) と β-ピネン展示空気よりも息の 3 倍の高い豊かさ (豊かさ ± SEM は、それぞれ、3.0x104 ± 1.3x104 9.1x103 ± 1.6x103息や空気のための意味p =0.007)、成功した息のコレクションを確認します。この研究からバイオ マーカー探索結果の完全記述的分析は、今後文書で報告されます。
図 1: 組み立て息サンプラーと呼気コレクションのバッグ。息サンプラー (青いバルブ オープン、すなわち、平行コネクタと両面の赤い矢印で示されているように)、チューブ、息コレクションの準備ができてとバッグの接続します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 息サンプリング バッグに息を吐き出す子。(A) 子供が吐き出す、サンプラーの息を保持している、(B) 袋の中に息のサンプルを提供します。許可を得て撮影します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BreathVolatiles は呼気します。小児被験者からサンプル呼吸のたびに異なる揮発性化合物の (A) 数 (n = 10) と周囲の空気コントロール (n = 10)。表示、意味と意味 (SEM) の標準誤差です。(B) 合計イオンクロマト グラフ (TIC)、航空管制と代表的な小児呼吸サンプルの可視化。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 2 つの呼気揮発性物質の豊かさ。小児喘息から豊富なイソプレンと β-ピネンの息のサンプル (n = 10) と室内空気コントロール (n = 10)。豊富な基本イオン ピーク面積により定量化します。意味、SEM が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 息サンプラー 。左:A) 呼吸サンプラーを組み立てられる: 1) 男性のアダプター + 2) 双方向ボールバルブ コネクタ + 3) テフロン男性アダプター。B) 段ボールのマウスピース。C) 小と大口径チューブ。右:息サンプラー マウスピースとチューブを接続します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 2: 異なる息ボリューム。上記サンプリング バッグの写真に満ちている空気 (1 L、2 L と 2.5 L) の異なるボリュームを収集するおおよそ息ボリュームの視覚的表現として。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 3: 袋にバルブ。左: バルブのステムがダウン (袋弁が開いている)。袋弁を入口継手側にローレットつまみを時計回りに回して閉めをロックします。バッグは息コレクションの準備ができて。右:バルブのステムが起こっている (バッグ バルブが閉じている)。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 4: 息転送します。左:吸着管 (1) 小規模および大規模な直径のチューブを使用して袋と、ポンプに、もう一方の端の 1 つの端に接続されています。右:吸着管; 注意溝終了サンプリング バッグに向かって溝の終わりを指す必要があります。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
補足図 5: 大気コレクション。左: 2 つのポートを持つポンプ: 入口と出口。出口ポートは、サンプリング バッグに添付されます。入口ポートは周囲の空気を描画し、袋にそれを転送します。右:大気収集システムが組み立てられました。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
最後のディケイド息研究でかなりの進歩にもかかわらずサンプリングと呼吸ガスの揮発性成分分析の標準化されたプラクティス未定義10のまま。標準化の欠如の主な理由は、任意の与えられた呼気サンプルで現在結果の化学的多様性に直接影響を与える息のコレクション方法の多様性をされています。Exhalate の息には、非常に多様な濃度6揮発性有機化合物の広範な範囲が含まれています。したがって、コレクション メソッドを変更すると変更の豊かさだけでなく、ある特定のサンプルに存在する化合物の多様性。
呼吸ガスのサンプリングは、驚くほど複雑です。息のサンプリングする必要がありますアカウント科目または分析の前に気密容器に息コレクターのマウスピースに息を吐くだけに必要と潜在的な変数の数のコントロールします。この作品は、子供の呼吸ガスのサンプリングのための特定の検証プロトコルを詳しく説明します。以前正常に実施してこのプロトコル熱性子供 (マラウイ)、リソースの限られた設定のフィールドのシナリオで、4 歳ほど若いバイオ マーカーの息収集・解析パイプラインの実現可能性を示すと探索9。その後、私たちも実装し、アメリカ合衆国で近代的な小児サブスペシャリティ クリニックで評価未満の子供からの息のサンプルのコレクションのためのプロトコルを評価しました。示唆された小児呼吸バイオ マーカーの探索、混合空気のコレクション、重要ですが真の与えられた個々 の"breathprint"を提供しています。さらに、混合呼気息だからも取得することができます息の最も単純な型呼気 (口と鼻) のすべてのフェーズが買収した3
フィールドで、被験者が鋭く病気、食事、体温、香りや特定の件名によってクリームの使用など一般的な交絡因子の制御が困難になる可能性がある場合は特に。これらの要因は呼吸レベルと品質に大きな影響を与えるをかもしれません。このため、捜査だけでなく息コレクションの吸着管への転送時間を記録、またためにダイエット (例えば、24 時間食事リコール)、マウスウォッシュの使用および薬の使用など患者固有の要因を注意してくださいお勧めします。バイオ マーカーの探索と下流解析の間にこれらの潜在的な交絡因子の影響を具体的に評価します。
化合物の大気から吸入も息バイオ マーカー発見の努力への挑戦をもたらすことができる呼気の組成に影響ことができます。したがって、分析と周囲の空気のコレクションは、呼気揮発性物質の起源に関する重要な洞察をもたらす重要なコントロールです。たとえば、大気中揮発性プロファイルは、揮発性を指定した呼吸が呼吸で周囲の空気11と比較して高いか低い豊富かどうかを確立する使用されています。特定息化合物濃度が大気中よりも息の高い示し呼吸で集中力の低下、その化合物が環境から派生した場合 (例えば、内因性起源) の体内から派生すると考え(例えば、外因性起源)。息コレクションが適切かどうかの重要な肯定的な制御として周囲の空気と呼吸で揮発性の豊かさを比較することも。当社の代表的なデータ (図 4) で示した、揮発性の化合物のイソプレン、内因性の起源の呼気濃度で存在する必要があります > 10 回周囲の空気の6。
バイオ マーカー探索に関心を持つ条件を持つ個人から揮発性のプロファイルを比較すること一致した健康な対照個人に機械学習と多変量のような統計的手法を使用してパターンを識別することができますように解析12。息コレクション メソッドここで説明は、病理学的状態の広い範囲に適用できます。唯一の要件は、子供が自らサンプリング息に協力することです。息テストは簡単に繰り返される、非侵襲的血管生物学的物質濃度を反映ために、ポイント ・ オブ ・ ケア ・ テスト臨床使用のための実装のための偉大な約束を保持します。
今後の作業は息コレクション若い幼児や子供 (< 時代の 4 年)、発達コマンドに息を吐き出すことができない人のための新しい方法の開発に焦点を当てます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
子どもと本研究に参加したセントルイス小児病院の家族に感謝いたします。息コレクション中にさんのステイシーだとさんジャネット Sokolich のユニークな努力を認めます。この作品は、セント ルイス子供病院財団によってサポートされます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breath bag | SKC | 237-03 | These are 3 L bags |
| Cardboard mouthpiece | A-M systems | 161902 | 0.86" OD, 2.00" L |
| Large diameter tubing | Cole Parmer | 95802-11 | Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD, |
| Long-term storage caps | Markes International | C-CF010 | Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10 |
| Male adapter | Charlotte Pipe | 2109 | Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005) |
| Male adapter (made from Teflon) | In-house built | Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon | |
| Pump | SKC | 220-1000TC-C | Pocket PumpTouch with Charger |
| Small diameter tubing | Supelco | 20533 | Teflon tubing L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm) |
| Thermal desorption tubes | Markes International | C2-CAXX-5314 | Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10 |
| Tube capping/uncapping tool | Markes International | C-CPLOK | |
| Two-way ball valve connector | Homewerks Worldwide | VBV-P40-E3B | Part 2/3 of breath connector (1/2") |
References
- Ahmed, W. M., Lawal, O., Nilsen, T. M., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled volatile organic compounds of infection: a systematic review. ACS Infectious Diseases. 3 (10), 695-710 (2017).
- Berna, A. Z., et al. Analysis of breath specimens for biomarkers of Plasmodium falciparum infection. Journal of Infectious Diseases. 212 (7), 1120-1128 (2015).
- Lawal, O., Ahmed, W. M., Nijsen, T. M. E., Goodacre, R., Fowler, S. J. Exhaled breath analysis: a review of 'breath-taking' methods for off-line analysis. Metabolomics. 13 (10), (2017).
- Kang, S., Thomas, C. L. P. How long may a breath sample be stored for at-80 degrees C? A study of the stability of volatile organic compounds trapped onto a mixed Tenax:Carbograph trap adsorbent bed from exhaled breath. Journal of Breath Research. 10 (2), (2016).
- Basanta, M., et al. Non-invasive metabolomic analysis of breath using differential mobility spectrometry in patients with chronic obstructive pulmonary disease and healthy smokers. Analyst. 135 (2), 315-320 (2010).
- Mochalski, P., et al. Blood and breath levels of selected volatile organic compounds in healthy volunteers. Analyst. 138 (7), 2134-2145 (2013).
- Mochalski, P., Wzorek, B., Sliwka, I., Amann, A. Suitability of different polymer bags for storage of volatile sulphur compounds relevant to breath analysis. Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (3), 189-196 (2009).
- Mochalski, P., King, J., Unterkofler, K., Amann, A. Stability of selected volatile breath constituents in Tedlar, Kynar and Flexfilm sampling bags. Analyst. 138 (5), 1405-1418 (2013).
- Schaber, C., et al. Breathprinting reveals malaria-associated biomarkers and mosquito attractants. Journal of Infectious Diseases. 217 (10), 1553-1560 (2018).
- Herbig, J., Beauchamp, J. Towards standardization in the analysis of breath gas volatiles. Journal of Breath Research. 8 (3), (2014).
- Phillips, M., et al. Variation in volatile organic compounds in the breath of normal humans. Journal of Chromatography B. 729 (1-2), 75-88 (1999).
- Eckel, S. P., Baumbach, J., Hauschild, A. C. On the importance of statistics in breath analysis-hope or curse? Journal of Breath Research. 8 (1), (2014).
