Summary
We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.
Abstract
Verschillende beperkingen van de 2D-cel cultuursystemen hebben gevonkt interesse in 3D-cel cultuur en analyse platforms, die beter zou nabootsen van de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels en na te bootsen in vivo weefsel functies. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de ontwikkeling van 3D in vitro omgevingen vergemakkelijkt waarin cellen kunnen worden geïntegreerd in een goed gedefinieerde extracellulaire matrix (ECM) en een gedefinieerde set van oplosbare of matrix geassocieerde biomoleculen. De technologische belemmeringen hebben echter hun wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria beperkt. Hier beschrijven we een methode om eenvoudige apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids in 3D-micromilieus met een gedefinieerde chemoattractant gradiënt. Wij illustreren het gebruik van dit platform voor de analyse van de respons van epitheelcellen en organoids naar gradiënten van groeifactoren, zoals epidermale groeifactor (EFG). EFG gradiënten waren stabiel in de apparaten voor enkele dagen die leiden tot gerichte Branch vorming in de borst organoids. Deze analyse konden we concluderen dat collectieve gradiënt sensing door groepen van cellen is gevoeliger versus enkele cellen. We beschrijven ook de fabricagemethode, die niet nodig fotolitho grafie faciliteiten, noch geavanceerde zachte lithografie technieken. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen in de context van de analyse van de ontwikkeling en pathologische staten, met inbegrip van kanker.
Introduction
In fysiologische omgeving, cellen zijn ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) en blootgesteld aan een overvloed aan biomoleculen. Interacties tussen cellen en de omliggende omgeving reguleren intracellulaire processen die diverse fenotypes beheersen, waaronder migratie, groei, differentiatie en overleving1,2. Er is veel geleerd over cellulair gedrag in een conventionele 2D-cel cultuur. Echter, met de komst van intravital Imaging en experimenten met cellen ingebed in 3D-hydrogels, belangrijke verschillen in cel gedrag zijn erkend in de vereenvoudigde 2D in vitro culturen versus 3D-weefsel-achtige omgevingen. Terwijl de cellen interageren met ECM vezels en de betekenis van hun mechanische eigenschappen binnen de 3D-matrix, de materiële stijfheid van de gel is niet een volledig onafhankelijke variabele in een 2D in vitro-systeem. De dimensionaliteit verandert focal adhesie vorming, wat resulteert in verschillende cel morfologie en gedrag. Bovendien zijn cellen op een 2D-oppervlak blootgesteld aan minder signalering cues dan cellen open voor alle richtingen in 3D.
Deze beperkingen hebben de belangen verhoogd voor 3D-systemen die de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels vertegenwoordigen en beter voorspellen in vivo weefsel functies. Zij zijn ontwikkeld in vele vormen van organoids als zelf-assembleert cellulaire microstructuren aan cellen die willekeurig in ECM worden gestrooid3,4. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de komst van verschillende soorten 3D-cultuursystemen5,6,7,8,9 voor het bestuderen van fenotypische veranderingen en cellulaire reacties op oplosbare signalen; technologische belemmeringen beperken echter het wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria. In veel gevallen, de fabricageprocessen vereisen fotolitho grafie technieken en achtergrondkennis voor zachte lithografie. Bovendien moeten verschillende factoren worden gecontroleerd om met succes een apparaat te bouwen en om een optimale functie van het apparaat te bereiken over een lange periode van tijd.
Onze methode beschrijft hoe een 3D PDMS apparaat te construeren voor de integratie van cellen en multicellulaire organoids in een 3D-omgeving met gedefinieerde chemoattractant gradiënten en vervolgens te analyseren epitheel reacties op EFG10. Uit onze gegevens blijkt dat de capaciteit van organoids om te reageren op ondiepe EFG-gradiënten voortvloeit uit intercellulaire chemische koppeling door gap junctions. Het suggereert het potentieel van organoids voor een nauwkeurigere opsporing van zwakke en lawaaierige ruimtelijk gegradeerde ingangen. Het fabricageproces vereist geen cleanroom installatie, noch fotolitho grafie technieken. Echter, de 3D PDMS apparaat bevat de nodige factoren van 3D fysiologische omgeving. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen en het heeft groot onderzoekpotentieel met verschillende cel types, chemoattractants, en ECM combinaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren werk werd uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite, Johns Hopkins University, school of Medicine.
1. fabricage van het mesofluidic apparaat
- Ontwerp het masker van de mal voor PDMS apparaat met behulp van een 3D-CAD-software.
- Print de mal met behulp van stereolithography apparatuur met een thermisch resistente hars.
Opmerking: de hier beschreven procedures werden uitgevoerd door een commerciële 3D print service. - Meng een PDMS monomeer oplossing met het Uithardings middel in een 10:1 verhouding. voor de fabricage van het apparaat is 3 mL PDMS mengsel vereist. Het totale volume is afhankelijk van het aantal van de mallen worden gefabriceerd.
- Degas het mengsel door het toepassen van een vacuüm met het gebruik van een in-house laboratorium vacuüm of vacuümpomp in een vacuüm verdrooger gedurende 1 uur.
- DEP het oppervlak van de mal met een plakband om stof te verwijderen, en giet het PDMS mengsel aan de mal. Als bubbels worden ingevoerd in het proces, herhaal ontgassing in de vacuüm verdrooger. Bubbels opgesloten tussen de pilaren van de mal kan worden verwijderd doorprikken ze met een scherpe naald.
Opmerking: de ontgassing proces bij kamertemperatuur moet worden gedaan binnen 1 uur of minder. - Cure de PDMS door het verwarmen van 80 °C gedurende 2 uur. Laat de mal af te koelen bij kamertemperatuur.
- Snijd de grens tussen de mal en PDMS met een mes en dan afpellen PDMS uit de mal zorgvuldig.
- Trim de PDMS deel aan de 22 mm x 22 mm dekglaasje te passen en punch een gat aan de inlaat.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Reinig de PDMS deel en 22 mm x 22 mm dekglaasje door het afvegen van de oppervlakken met een laag-lint weefsels en 70% ethanol. Verwijder vervolgens grote stofdeeltjes door deppen met een plakband.
- Steriliseer het PDMS deel en dekglaasje door een van beide autoclaaf (121 °C gedurende 8 minuten NAT, 15 minuten droog) of blootstelling aan UV-licht gedurende 1 uur.
- Behandel de onderkant van de PDMS deel en cover slip met Corona kwijting Gun voor 5 min in het weefselcultuur kap en vervolgens Bond ze samen.
Let op: Leg alle niet-geleidend materiaal zoals polystyreenschuim op de bodem en verwijder alle geleidende materialen tijdens dit proces. Injecteer collageen onmiddellijk in het apparaat, binnen 5 minuten, na de behandeling om de verlijming tussen collageen gel en glas dekglaasje te verhogen.
2. Cell voorbereiding: primaire borst organite isolatie
Opmerking: de details van de borstklier organite isolatie kan worden gevonden in een vorig werk11. Elke vorm van enkele cel of organite kan worden bereid volgens hun eigen isolatie/detachement protocollen.
- Gehakt de borstklier weefsel van de muizen met een scalpel tot het weefsel ontspant en schud het voor 30 min bij 37 ° c in 50 mL van Collagenase/trypsine oplossing (10 mL per muis) in DEME/F12 aangevuld met 0,1 g van trypsine, 0,1 g van Collagenase , 5 mL FBS, 250 l van 1 μg/mL insuline, en 50 l van 50 μg/mL gentamicine.
- Centrifugeer de Collagenase/trypsine oplossing bij 1.250 x g voor 10 min. Verwijder de bovendrijvende door aspiratie. Verspreid cellen in 10 mL van DMEM/F12, en centrifugeer bij 1.250 x g gedurende 10 min. Na het verwijderen van DMEM/F12 door aspiratie, opnieuw op te schorten cellen in 4 mL van DMEM/F12 aangevuld met 40 l van DNase (2 eenheden/l).
- Schud de DNase oplossing met de hand voor 2-5 min en dan Centrifugeer bij 1.250 x g voor 10 min.
- Afzonderlijke organoids van enkele cellen door vier differentiële Centrifuges (Pulse tot 1.250 x g en stop de centrifuge 3-4 s na het bereiken van de beoogde snelheid). Tussen elke puls, aspireren de bovendrijvende en de pellet opnieuw op te schorten in 10 mL van DMEM/F12.
- Re-Suspend de laatste pellet in de gewenste hoeveelheid groeimedium van DMEM/F12 met 1% penicilline/streptomycine en 1% insuline-transferrin-selenium-X voor de voorbereiding van collageen.
3. collageen voorbereiding en injectie
Opmerking: andere soorten ECM gels kunnen worden bereid volgens hun eigen gelering protocollen.
- Bereid collageen type I oplossing (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH oplossing, normaal groeimedium op ijs.
Nota: Houd op ijs tot de procedure wordt voltooid. - Voeg 6 l van 1 N NaOH oplossing toe, 200 l van groeimedium en 50 l van 10x DMEM in een pre-gekoelde micro centrifugebuis en meng de oplossing grondig.
- Voeg 425 l van collageen in de pre-Mixed oplossing toe en meng door pipetten.
- Centrifugeer het collageen mengsel kort (minder dan 5 seconden) te scheiden en te verwijderen bubbels uit het mengsel.
- Houd de geneutraliseerde collageen oplossing op ijs voor 1 uur tot vezelvorming te induceren.
- Voeg 50 l van de cel schorsing in het collageen mengsel en meng grondig.
Opmerking: de uiteindelijke collageen concentratie is 2 mg/mL. - Injecteer de oplossing met 200 l pipet door de inlaat van het PDMS apparaat totdat de hele kamer is ingevuld. Als het collageen mengsel overloopt door de lacunes van de pilaren, knip de overtollige collageen gel met scherpe chirurgische mes na gelering.
- Houd het apparaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 voor 1 uur om gelering te induceren.
- Vul de reservoirs aan beide zijden met groeimedium en houd het apparaat in de incubator op 37 ° c met 5% CO2 tot confocale beeldvorming wordt uitgevoerd.
4.3D beeldvorming en kwantificering
- Installeer een levende-cel Imaging cultuurkamer aan een confocale Microscoop en vooraf ingesteld de temperatuur en CO2 tot 37 ° c en 5%, respectievelijk. Om vochtigheid omhoog te krijgen, voeg water in het reservoir van de kamer toe en plaats natte doekjes in de kamer indien nodig.
- Plaats het PDMS apparaat in de kamer en voeg EFG toe aan een van de reservoirs als "bron" van het EFG in de gradiënt formatie. Het andere reservoir zal een ' gootsteen ' dienen voor de ontwikkeling van de ruimtelijk gegradeerde EFG-verdeling. 2,5 nM EFG werd toegevoegd in de gootsteen voor het maken van de gradiënt van 0,5 nM/mm in deze studie.
- Stel het bereik van de Z-stack met betrekking tot het volume van de organoids van belang en start de Imaging.
Let op: om fototoxiciteit te voorkomen, probeer dan een lagere Laser intensiteit in confocale beeldvorming of gebruik multi-foton Imaging technieken. - Reconstrueren een 3D-beeld van 2D-afbeelding stacks met behulp van commerciële software of een op maat gemaakt programma. Meet de lengte en hoek van de takken die zich uitstrekken van de organoids of migratie van individuele cellen. Hier, uit te voeren kwantificering door het tekenen van een FreeHand schets rond de organite lichaam met behulp van ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EFG is een essentiële regulator van vertakking morfogenese in de borstklieren en een kritische chemoattractant het begeleiden van de migratie van borst epitheelcellen in invasieve groei van kanker. We gebruikten de mesoscopische vloeibare apparaten hierboven beschreven om de reactie van cellen te bestuderen om gedefinieerde EFG gradiënten (Figuur 1a, B)10. Het apparaat levert een cultuurgebied van 5 mm breed, 10 mm lang en 1 mm hoog. De kanten van het cultuurgebied worden gescheiden van open putten door hexagonale pijlers, die worden gebruikt om het vloeibare ECM en cel mengsel binnen het gebied van de cel cultuur door oppervlaktespanning te vangen. We merken op dat, gezien de omvang van deze 3D-cultuur, zou het zeer moeilijk, duur, en tijdrovend om een passend formaat mal te construeren door fotolitho10. Door het gebruik van een nieuwe toepassing van een standaardtechniek, stereolithography, we snel en goedkoop geproduceerd de mal. Bovendien kan door het wijzigen van het ontwerp, een exponentiële gradiënt (figuur 1c, i) of meerdere lineaire gradiënten in een chip (figuur 1c, II) worden geïnduceerd, alsmede een stabiele gradiënt met continue stroom (figuur 1c, III).
Zowel in silico (Figuur 2a, B, C) en in vitro (figuur 2D, E, F) tests aangetoond dat de vorming van een stabiele lineaire EFG gradiënt over de cel cultuurgebied dat duurde ongeveer twee dagen zonder het aanvullen van de ' Bron ' en ' sink ' reservoirs. De tijdafhankelijke diffusie van de eiwitten werd gesimuleerd met behulp van een gecommercialiseerde Multifysica software. De 3D-geometrie van de kamer configuratie werd herschapen op de software en de gemiddelde concentratie in het kamer volume werd bepaald en uitgezet. Deze resultaten suggereerden dat EFG, een 6,4 kDa eiwit, kan een stabiele diffusie-gebaseerde gradiënt vormen binnen de collageen gel bereid zoals hierboven beschreven over een relatief korte periode van tijd. We hebben ook vastgesteld dat soortgelijke profielen van eiwitten van 1, 10, en 150 kDa kunnen worden gevormd met behulp van deze methode.
Borstklieren organoids gevormd meerdere takken in de aanwezigheid van ruimte uniform 2,5 nM EFG en de tak formatie weergegeven geen directionele bias meer dan 3 dagen (Figuur 3a, D). Nochtans, als EFG in de vorm van een lineaire gradiënt van 0,5 nM/mm werd toegevoegd, toonde de tak vorming een significante directionele bias (Figuur 3b, E). Echter, we ontdekt geen dergelijke bias voor enkele cellen in dezelfde gradiënt. Om te bepalen of multicellulaire communicatie nodig was voor de gradiënt reactie, onderzochten we of het blokkeren van intercellulaire kloof verbindingen met verschillende remmers zou de bevooroordeelde tak vorming te voorkomen. De gap junction remmers inderdaad onderdrukt het vermogen van de organoids om te reageren op de gradiënt (figuur 3c, F). Zoals uitvoeriger onderzocht in de oorspronkelijke studie waarin deze methode10, dit resultaat ondersteunt de hypothese dat de communicatie via gap junctions is noodzakelijk voor het EFG gradiënt Response in de borst organoids10.
Figuur 1. Mesofluidic apparaat met gedefinieerde EFG-gradiënt. (A) 3D- weergave van PDMS chip: (i) bovenaanzicht en (II) vooraanzicht van een mal (eenheid: mm) (III) een array van mallen (rood) gevuld met PDMS (transparant) (IV) PDMS kamers pilled off van de mal (v) een schematisch schema van een geassembleerd apparaat (VI) een reëel beeld van het apparaat te vullen Ed met collageen gel en kweekmedium. B een schematisch schema van de mesofluidic kamer met organoids ingebed in een collageen gel en reservoirs van hoge (rode) en lage (rode) EFG-concentratie, resulterend in EFG-gradiënten (dit cijfer is gewijzigd van10). (C) potentiële ontwerpen voor het induceren van een exponentiële gradiënt (i), vier verschillende lineaire gradiënten in een chip (II), en een stabiele gradiënt met continue stroom (III). De rode gebieden wijzen op bronnen of gootstenen die met cultuur worden gevuld de middelgrote en grijze gebieden wijzen op kamers die met gel/cellen mengsel worden gevuld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Evaluatie van ligand gradiënten over de chip. (A) simulatie van de ligand concentratie over de chip die gradiënt profielen weergeeft. Gesimuleerde gradiënt profielen van (B) 1 kDa proteïne en (C) 70 kDa proteïne. D beeld van het apparaat met een lineaire gradiënt van 10 kDa dextran blauw gebruikt om de verspreiding van het EFG te visualiseren. Zeshoekige stippellijnen geven pilaren aan de zijkant van het gel gebied. Experimentele Gradiënt profielen van 1, 10 en 150 kDa dextran over de chip (dit cijfer is gewijzigd van Ellison et al. 201610) (E) na 8 uur en (F) na 48 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Cellulaire reactie op EFG-gradiënt. A niet-directionele vertakking van organoids in collageen met een uniform 2,5 nm EFG. B directionele vertakking van organoids in collageen met een lineaire gradiënt van 0,5 nm/mm EFG. C niet-directionele vertakking van organoids in een lineaire gradiënt van 0,5 nm/mm van EFG met een gap junction blocker. (D-F) Hoekige histogrammen van organite vertakkings richtingen die overeenkomen met (A)-(C), respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fabricage van PDMS mallen werd uitgevoerd met behulp van een commerciële 3D print service, maar kan ook worden bereikt door een high-end 3D-printer in-House. Onder verschillende 3D fabricagemethoden, stereolithography wordt aanbevolen voor hoge resolutie schimmel generatie. Omdat PDMS uitharding op hoge temperatuur (80 °C) plaatsvindt, moeten de materialen voldoende thermisch resistent zijn, die expliciet moeten worden gespecificeerd, als het afdrukken uitbesteed is. Een thermische post-Cure kan worden besproken met de drukkerij service bedrijf om de thermische weerstand van het onderdeel te verhogen. De details van de afdrukservice en materialen worden gespecificeerd in de materiaallijst.
De mechanische eigenschap van genezen PDMS is afhankelijk van de Uithardings temperatuur. Als de PDMS mengsel wordt bewaard bij kamertemperatuur voor een lange tijd voordat genezen in een oven, wordt het te elastisch, zelfs na de volledige uitharding. Zo, de ontgassing proces bij kamertemperatuur moet worden gedaan binnen 1 uur of minder. Ontgassing verwijst naar een cyclische toepassing van vacuüm dat kan helpen bij het verwijderen alle micro-bubbels binnen PDMS.
De pH van de collageen oplossing is niet alleen kritisch voor gelering maar ook voor de levensvatbaarheid van cellen. Als collageen niet wordt geneutraliseerd alvorens met cellen te mengen, zal de levensvatbaarheid van de cel laag zijn. Het bedrag van 1 N NaOH oplossing voor het neutraliseren van het collageen mengsel is afhankelijk van de pH van de originele collageen oplossing en het kan theoretisch worden berekend. Het is echter raadzaam om de NaOH oplossing toe te voegen aan de collageen oplossing geleidelijk, het controleren van de pH-waarden van het medium met behulp van fenol rode indicator of met behulp van pH-testen tapes.
Het ontgassen van de gel is belangrijk gedurende het hele proces. Als bubbels vorm tijdens gelering na het collageen mengsel wordt geïnjecteerd in het apparaat, kunnen ze ook worden verwijderd door het plaatsen van het apparaat op ijs voor 10 min of meer. Door het laten vallen van de temperatuur, vermindert de grootte van bellen en de leegte wordt uiteindelijk bezet door het gel mengsel. Dezelfde methode kan worden gebruikt wanneer bubbels zijn opgesloten tussen de pijlers na het toevoegen van cultuurmedium aan de reservoirs.
We gebruikten deze technologie om mesofluidic apparaten die het mogelijk maken inbedding van grote multi-cellulaire constructies in een fysiologisch relevante extracellulaire matrix omgeving te creëren en te integreren met gedefinieerde gradiënten van de groeifactoren en andere oplosbare bioactieve moleculen. Hoge resolutie stereolithography konden we produceren van hoge kwaliteit, goedkope mallen. De fabricageproces vereist geen cleanroom faciliteiten, noch fotolitho grafie technieken, en dus maakt een eenvoudige maar effectieve generatie van een 3D-omgeving voor de cel cultuur en experimenten, die meerdere voordelen versus de traditionele 2D Experimenten. Het apparaat illustreerde hier is ontworpen om een cultuurgebied van 5 mm breed, 10 mm lang, en 1 mm hoog. Het vrij grote cultuurgebied met dikkere hoogte laat de groei toe van mesoscopically grote organoids of sferoïden, variërend in grootte van tien tot honderden micrometers. Het maakt het ook mogelijk de analyse van vertakte epitheel morfogenese, en analyse van collectieve en enkele cel migratie in de 3D-omgeving. De zijkanten van het apparaat zijn open putten die het gebruik van standaard pipetten om de media te veranderen of om drugs toe te voegen zonder de noodzaak voor ingewikkelde interfacing met de vloeibare controle-apparaten, meestal gebruikt voor mainstream microvloeistoffen apparaten. Bovendien is de eenvoudige configuratie van een PDMS kamer en een cover glas aan de onderkant is universeel compatibel met diverse microscopische systemen. Het gebruik van de apparaten toonde de bevooroordeelde vertakking richting van morfogenese in normaal borstweefsel, in reactie op de opgelegde EFG gradiënt als een representatief voorbeeld voor het gebruik van het apparaat. Echter, dit gebruik kan ook worden uitgebreid tot verschillende weefsels, cel bronnen, chemoattractants, en drugs voor de analyse van de cel/weefsel gedrag in 3D. Het gebruik kan ook worden uitgebreid tot meer realistische weefsel modellering, die geschikt is voor vasculaire netwerkvorming van individuele cellen in de gel, samen met de integratie van andere soorten cellen, met inbegrip van mesenchymale stromale en immuun componenten en diverse epitheelcellen.
Hoewel stereolithography biedt de beste resolutie onder 3D-druktechnieken, de minimale functie grootte is nog steeds beperkt tot enkele tientallen micrometers. Daarom is dit protocol niet voldoende om de fotolitho grafie te vervangen in het fabriceren van schimmels op een schaal van verschillende micrometers. Een andere beperking van dit protocol is de relatief lage diepte van hoge kwaliteit beeldvorming in de z-richting in vergelijking met de x-y richting, dat is een inherent probleem van Imaging weefsel-schaal constructies, met behulp van conventionele microscopie. Echter, zelfs met deze beperkingen, de beschreven methode kan zorgen voor een krachtige en flexibele analyse platform dat is gemakkelijk te fabriceren en te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door toelagen aan AJE (NSF PD-11-7246, de Stichting van het onderzoek van de borstkanker (BCRF-17-048), en NCI U54 CA210173) en AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
