Summary
نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.
Abstract
وقد أثارت القيود المختلفة لنظم الثقافة الخلية 2D الاهتمام في ثقافة الخلية 3D ومنصات التحليل ، والتي من شانها ان تحاكي بشكل أفضل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية وتقليد في وظائف الانسجه المجرية. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري تطوير بيئات ثلاثية الابعاد في المختبر يمكن فيها دمج الخلايا في مصفوفة واضحة المعالم خارج الخلية (ECM) ومجموعه محدده من الجزيئات البيولوجية المرتبطة القابلة للذوبان أو المصفوفة. غير ان الحواجز التكنولوجية قد حدت من استخدامها علي نطاق واسع في مختبرات البحوث. هنا ، ونحن وصف طريقه لبناء أجهزه بسيطه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئات المجهرية 3D مع التدرج تشيمواتراكتانت محدده. ونحن نوضح استخدام هذه المنصة لتحليل استجابه الخلايا الظهاريه والعضوية العضوية لتدرجات عوامل النمو ، مثل عامل نمو البشرة (EGF). وكانت التدرجات EGF مستقره في الاجهزه لعده أيام مما ادي إلى تشكيل فرع الموجهة في الثدي العضوي. وقد سمح لنا هذا التحليل بالخلوص إلى ان استشعار التدرج الجماعي من قبل مجموعات من الخلايا أكثر حساسية مقارنه بالخلايا المفردة. ونحن أيضا وصف طريقه التصنيع ، والتي لا تتطلب مرافق التصوير الضوئي ولا تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة المتقدمة. سيكون هذا الأسلوب مفيدا لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد في سياق تحليل التطور والحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.
Introduction
في البيئة الفسيولوجية ، يتم تضمين الخلايا في مصفوفة خارج الخلية (ECM) وتتعرض لكثرة من الجزيئات الحيوية. التفاعلات بين الخلايا والبيئة المجهرية المحيطة تنظم العمليات داخل الخلايا السيطرة علي الأنماط الظاهرية المتنوعة ، بما في ذلك الهجرة والنمو والتمايز والبقاء علي قيد الحياة1،2. وقد تعلمت الكثير عن السلوكيات الخلوية في ثقافة خليه ثنائيه الابعاد التقليدية. ومع ذلك ، مع ظهور التصوير الانترافيتال والتجريب مع الخلايا المضمنة في الهلام المائي ثلاثي الابعاد ، تم التعرف علي الاختلافات الهامه في سلوكيات الخلايا في الثقافات المبسطة ثنائيه الابعاد في المختبر مقابل بيئات تشبه الانسجه ثلاثية الابعاد. بينما تتفاعل الخلايا مع ألياف ECM وتستشعر خواصها الميكانيكية داخل المصفوفة ثلاثية الابعاد ، فان الصلابة المادية للجل ليست متغيرا مستقلا تماما في نظام ثنائي الابعاد في المختبر. الابعاد يغير تشكيل التصاق البؤري ، مما يؤدي إلى شكل الخلية المختلفة والسلوك. وعلاوة علي ذلك ، تتعرض الخلايا علي سطح ثنائي الابعاد لإشارات اقل من الخلايا المفتوحة لجميع الاتجاات في الابعاد الثلاثية.
وقد زادت هذه القيود من الاهتمام بالانظمه ثلاثية الابعاد التي تمثل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية والتنبؤ بشكل أفضل بوظائف الانسجه المجرية. وقد وضعت في اشكال كثيره من organoids كما الذاتي تجميع الهياكل الخلوية إلى خلايا تتخللها عشوائيا في ECM3,4. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري ظهور أنواع مختلفه من نظم الثقافة ثلاثية الابعاد5، 6،7،8،9 لدراسة التغيرات الظاهرية الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان; بيد ان الحواجز التكنولوجية تحد من الاستخدام الواسع النطاق في مختبرات البحوث. في كثير من الحالات ، تتطلب عمليات التصنيع تقنيات التصوير الضوئي والمعارف الخلفية للطباعة الحجرية الناعمة. وعلاوة علي ذلك ، يجب السيطرة علي عوامل مختلفه لبناء جهاز بنجاح وتحقيق وظيفة الأمثل للجهاز علي مدي فتره طويلة من الزمن.
طريقتنا يصف كيفيه بناء جهاز PDMS 3D لدمج الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئة المجهرية 3D مع التدرجات تشيمواتراكتانت المحددة ومن ثم تحليل الاستجابات الظهاريه إلى EGF10. بياناتنا تكشف عن ان قدره organoids للرد علي التدرجات EGF الضحلة تنشا من اقتران الكيميائية بين الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة. وهو يوحي بقدره العضو العضوي علي الكشف بدقه أكبر عن المدخلات الضعيفة والصاخبة المصنفة مكانيا. عمليه التصنيع لا تتطلب مرفق غرفه الأبحاث ولا تقنيات التصوير الضوئي. ومع ذلك ، فان جهاز PDMS ثلاثي الابعاد يتضمن العوامل الضرورية للبيئة الفسيولوجية ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة ستكون مفيده لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد ولديها إمكانات بحثيه كبيره مع أنواع مختلفه من الخلايا ، تشيمواتراكتانتس ، وتركيبات ECM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها ، جامعه جونز هوبكنز ، كليه الطب.
1. تصنيع جهاز الجريان الوسطي
- تصميم قناع العفن للجهاز PDMS باستخدام برنامج CAD 3D.
- اطبع القالب باستخدام معدات التصوير الفراغي مع الراتنج المقاوم للحرارة.
ملاحظه: تم تنفيذ الإجراءات الموصوفة هنا بواسطة خدمه طباعه ثلاثية الابعاد تجاريه. - اخلط جيدا محلول مونومير PDMS مع عامل المعالجة بنسبه 10:1. 3 مل من خليط PDMS كان مطلوبا لتصنيع الجهاز. الحجم الكلي يعتمد علي عدد من قوالب لتكون ملفقه.
- Degas الخليط عن طريق تطبيق فراغ مع استخدام فراغ مختبر في المنزل أو مضخة فراغ في المجفف فراغ لمده 1 ساعة.
- ربت سطح القالب مع شريط لاصق لأزاله الغبار ، ومن ثم صب خليط PDMS إلى العفن. إذا تم إدخال فقاعات في هذه العملية ، وتكرار التفريغ في المجفف فراغ. فقاعات المحاصرين بين أعمده من العفن يمكن ازالتها بدس لهم مع ابره حاده.
ملاحظه: يجب ان يتم عمليه التفريغ في درجه حرارة الغرفة في غضون ساعة واحده أو اقل. - علاج PDMS عن طريق التدفئة في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة. السماح للقالب لتهدئه في درجه حرارة الغرفة.
- قطع الحدود بين العفن و PDMS مع شفره ثم قشر قباله PDMS من العفن بعناية.
- تقليم الجزء pdms لتناسب 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب ولكمه ثقب في مدخل.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - تنظيف الجزء pdms و 22 مم × 22 ملم كوفيرسليب عن طريق مسح الأسطح مع انسجه منخفضه الوبر و 70 ٪ الايثانول. ثم قم بازاله جزيئات الغبار الكبيرة عن طريق الضباب بشريط لاصق.
- تعقيم الجزء pdms وكوفيرسليب اما عن طريق التعقيم (121 درجه مئوية لمده 8 دقائق الرطب ، 15 دقيقه جافه) أو التعرض للاشعه فوق البنفسجية لمده 1 ساعة.
- علاج السطح السفلي للجزء PDMS وتغطيه زلة مع بندقية التفريغ كورونا لمده 5 دقائق في النسيج الثقافة هود ومن ثم السندات لهم معا.
تحذير: وضع اي مواد غير الاجراء مثل رغوة البوليسترين في الجزء السفلي وأزاله جميع المواد التي تجري خلال هذه العملية. حقن الكولاجين في الجهاز علي الفور ، في غضون 5 دقائق ، بعد العلاج لزيادة الترابط بين هلام الكولاجين والزجاج coverslip.
2. اعداد الخلية: العزل العضوي الثديية الاوليه
ملاحظه: يمكن العثور علي تفاصيل العزلة organoid الثديية في العمل السابق11. يمكن اعداد اي نوع من خليه واحده أو organoid وفقا لبروتوكولات العزلة/مفرزه الخاصة بهم.
- فرم نسيج الغدة الثديية من الفئران مع مشرط حتى يرتاح النسيج ويهز لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية في 50 مل من محلول كولاجيناز/التريبسين (10 مل لكل ماوس) في DEME/F12 تستكمل مع 0.1 غرام من التريبسين ، 0.1 غرام من كولاجيناز ، 5 مل من ال250 الواحدة ، والتي تبلغ μL 1 ميكروغرام/مل الانسولين ، و 50 μL من 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
- الطرد المركزي الحل كولاجيناز/التريبسين في 1,250 x g لمده 10 دقيقه أزاله ماده طافي عن طريق الطموح. تفريق الخلايا في 10 مل من DMEM/F12 ، وأجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه. بعد أزاله DMEM/F12 عن طريق الطموح ، أعاده تعليق الخلايا في 4 مل من DMEM/F12 تستكمل مع 40 μL من DNase (2 وحده/μL).
- يهز حل DNase باليد ل 2-5 دقيقه ومن ثم أجهزه الطرد المركزي في 1,250 x g لمده 10 دقيقه.
- منفصلة organoids من خلايا واحده من خلال أربعه سينتريفوجيشنز التفاضلية (النبض إلى 1,250 x g ووقف الطرد المركزي 3-4 s بعد ان تصل إلى السرعة المقصودة). بين كل نبضه ، يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من dmem/F12.
- أعاده تعليق بيليه النهائي في المبلغ المطلوب من متوسط نمو DMEM/F12 مع 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين و 1 ٪ الانسولين-ترانسفيرين-السيلينيوم-X لاعداد الكولاجين.
3. اعداد الكولاجين والحقن
ملاحظه: يمكن اعداد أنواع أخرى من الهلام ECM وفقا لبروتوكولات دبق الخاصة بهم.
- اعداد الكولاجين نوع I الحل (3.78 ملغ/مل) ، 10x DMEM ، 1 N NaOH الحل ، متوسط النمو العادي علي الجليد.
ملاحظه: الاحتفاظ علي الجليد حتى يتم إكمال الاجراء. - أضافه 6 μL من 1 N NaOH الحل ، 200 μL من المتوسطة النمو و 50 μL من 10x DMEM إلى أنبوب الطرد المركزي قبل المبردة ومزيج الحل تماما.
- أضف 425 μL من الكولاجين إلى المحلول المختلط مسبقا واخلطه جيدا عن طريق التنضيد.
- الطرد المركزي خليط الكولاجين لفتره وجيزة (اقل من 5 ثوان) لفصل وأزاله فقاعات من الخليط.
- الحفاظ علي محلول الكولاجين تحييد علي الجليد لمده 1 ساعة للحث علي تشكيل ألياف.
- أضافه 50 μL من تعليق الخلية في خليط الكولاجين وتخلط جيدا.
ملاحظه: تركيز الكولاجين النهائي هو 2 ملغ/مل. - حقن المحلول باستخدام ماصه pipet-x 200 μL من خلال مدخل الجهاز PDMS حتى يتم ملء الغرفة بأكملها في. إذا كان خليط الكولاجين يفيض من خلال الفجوات من الركائز ، وقطع هلام الكولاجين الزائدة مع شفره جراحيه حاده بعد gelation.
- الحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 لمده 1 ساعة للحث علي gelation.
- ملء الخزانات علي كلا الجانبين مع متوسط النمو والحفاظ علي الجهاز في الحاضنة في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 حتى يتم تنفيذ التصوير البؤري.
4-التصوير الثلاثي الابعاد والقياس الكمي
- تثبيت الخلية الحية التصوير الثقافة الغرفة إلى المجهر البؤري وقبل تعيين درجه الحرارة و CO2 إلى 37 درجه مئوية و 5 ٪ ، علي التوالي. للحصول علي الرطوبة ، أضافه الماء في خزان الغرفة ووضع مناديل مبلله في الغرفة إذا لزم الأمر.
- وضع جهاز PDMS في الغرفة وأضافه EGF إلى واحد من الخزان باعتباره ' مصدر ' EGF في تشكيل التدرج. سيخدم الخزان الآخر ' بالوعة ' اللازمة لتطوير توزيع EGF المتدرج مكانيا. تمت أضافه 2.5 nM من EGF في بالوعة لجعل الانحدار من 0.5 nM/mm في هذه الدراسة.
- تعيين نطاق Z-المكدس تغطي حجم العضوية من الاهتمام وبدء التصوير.
تحذير: لتجنب السمية الضوئية ، جرب كثافة الليزر الأقل في التصوير البؤري أو استخدم تقنيات التصوير متعدد الفوتونات. - أعاده بناء صوره ثلاثية الابعاد من مكدسات الصور ثنائيه الابعاد باستخدام برامج تجاريه أو برنامج مخصص. قياس طول وزاوية الفروع الممتدة من الهيكل العضوي أو هجره الخلايا الفردية. هنا ، قم باجراء القياس الكمي عن طريق رسم الخطوط العريضة اليدوية حول الجسم العضوي باستخدام ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF هو منظم أساسي من النشاه المتفرعة في الغدد الثديية وتشيمواتراكتانت الحرجة توجيه هجره الخلايا الظهاريه الثدي في نمو السرطان الغازية. استخدمنا الاجهزه ميسوسكوبيك فلويديك المذكورة أعلاه لدراسة استجابه الخلايا لتحديد التدرجات egf (الشكل 1a، B)10. الجهاز يعطي مساحة الثقافة 5 ملم واسعه ، 10 ملم طويلة ، و 1 مم طويل القامة. فصلت الجوانب من الثقافة منطقه من ابار مفتوحة باعمده سداسية, اي يكون استعملت ان فخ ال [ECM] سائله وخليه خليط ضمن الخلية ثقافة منطقه من خلال توتر سطحيه. ونلاحظ انه نظرا لحجم هذه الثقافة 3D ، سيكون من الصعب جدا ، مكلفه ، وتستغرق وقتا طويلا لبناء قالب بالحجم المناسب عن طريق التصوير الضوئي10. باستخدام تطبيق جديد لتقنية قياسيه ، المجسمة ، ونحن بسرعة وبتكلفه زهيده أنتجت العفن. وعلاوة علي ذلك ، من خلال تعديل التصميم ، والانحدار الاسي (الشكل 1c، i) أو التدرجات الخطية متعددة في رقاقه (الشكل1c، ii) يمكن ان تكون مستحثه ، فضلا عن التدرج مستقره مع تدفق مستمر (الشكل1c، iii).
علي حد سواء في سيليكو (الشكل 2a، B ، C) والمختبر (الشكل2a، E ، F) أثبتت الاختبارات تشكيل الانحدار egf الخطي مستقره عبر منطقه ثقافة الخلية التي استمرت لمده يومين تقريبا دون تجديد ' المصدر ' و ' بالوعة ' الخزانات. وقد تم محاكاة انتشار البروتينات المعتمد علي الوقت باستخدام برمجيات متعددة الفيزياء تجاريا. تمت أعاده إنشاء الهندسة ثلاثية الابعاد لتكوين الغرفة علي البرنامج وتم تحديد متوسط التركيز داخل حجم الغرفة ورسمه. وتشير هذه النتائج إلى ان EGF ، وهو بروتين 6.4 ده ، يمكن ان يشكل تدرجا مستقرا قائما علي الانتشار داخل هلام الكولاجين المعد علي النحو الموصوف أعلاه علي مدي فتره قصيرة نسبيا من الزمن. وقررنا أيضا انه يمكن تشكيل لمحات مماثله من البروتينات من 1 ، 10 ، و 150 كده باستخدام هذه الطريقة.
شكلت الثدي العضوي فروع متعددة في وجود المكانية موحده 2.5 nM EGF وتشكيل فرع عرض اي تحيز الاتجاه علي مدي 3 أيام (الشكل 3A، D). ومع ذلك ، إذا تمت أضافه EGF في شكل تدرج خطي من 0.5 نيوتن متر/مم ، فان تشكيل الفرع يظهر انحيازا اتجاهيا كبيرا (الشكل 3 ب، ه). ومع ذلك ، لم نكتشف اي تحيز من هذا القبيل للخلايا المفردة في نفس التدرج. من أجل تحديد ما إذا كان الاتصال متعدد الخلايا ضروري لاستجابه التدرج ، ونحن استكشاف إذا منع تقاطعات الفجوة بين الخلايا مع مثبطات مختلفه من شانه ان يمنع تشكيل فرع متحيزة. مثبطات تقاطع الفجوة في الواقع قمعت قدره organoids للرد علي التدرج (الشكل 3c، F). كما استكشفت أكثر علي نطاق واسع في الدراسة الاصليه تصف هذه الطريقة10، وهذه النتيجة تدعم فرضيه ان الاتصال من خلال تقاطعات الفجوة ضروري لاستجابه التدرج egf في الغدد العضوي10.
الشكل 1 جهاز الجريان الوسطي مع التدرج EGF المحدد. (A) عرض 3d من رقاقه PDMS: ' 1 ' المنظر العلوي و (2) المنظر الامامي للقالب (الوحدة: مم) ' 3 ' مجموعه من القوالب (الحمراء) مملوءة ب PDMS (شفافة) ' 4 ' الغرف PDMS بالخروج من العفن (v) رسم تخطيطي للجهاز تجميعها (vi) صوره حقيقية للجهاز ملء ed مع هلام الكولاجين والثقافة المتوسطة. (ب) الرسم التخطيطي للغرفة الوسيطة الوسطي مع الغدد العضوية المضمنة في هلام الكولاجين وخزانات عاليه (حمراء) ومنخفضه (الأحمر) تركيز egf مما ادي إلى التدرجات egf (وقد تم تعديل هذا الرقم من10). (ج) التصاميم المحتملة للحث علي التدرج الاسي ' 1 ' ، وأربعه تدرجات خطيه مختلفه في رقاقه ' 2 ' ، وتدرج ثابت مع تدفق مستمر ' 3 '. تشير المناطق الحمراء إلى مصادر أو بالوعات مليئه بالمناطق الثقافية المتوسطة والرمادية تشير إلى غرف مملوءة بخليط الهلام/الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 تقييم التدرجات اللونية عبر الرقاقة. (ا) محاكاة التركيز علي الرقاقة التي تبين ملامح التدرج. ملامح التدرج المقلدة من (B) 1 البروتين و (ج) 70 البروتين. (D) صوره الجهاز مع التدرج الخطي من 10 ده دديككان الأزرق تستخدم لتصور انتشار egf. خطوط سداسية منقطه تشير إلى أعمده في الجانب من منطقه هلام. لمحات التدرج التجريبية من 1, 10 و 150 ده دديككان عبر رقاقه (وقد تم تعديل هذا الرقم من اليسون وآخرون 201610) (ه) بعد 8 ساعات و (و) بعد الساعة 48. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الاستجابة الخلوية لتدرج EGF. (ا) المتفرعة غير الاتجاهية من الهيكل العضوي في الكولاجين مع موحد 2.5 NM EGF. (B) المتفرعة الاتجاه من organoids في الكولاجين مع التدرج الخطي من 0.5 nM/MM من egf. (ج) المتفرعة غير الاتجاهية من الهيكل العضوي في التدرج الخطي من 0.5 نيوتن متر/مم من egf مع مانع تقاطع الفجوة. (مد-واو) الرسوم البيانية الزاوي من الاتجاات المتفرعة organoid المقابلة (A)-(ج) ، علي التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم اجراء تصنيع قوالب PDMS باستخدام خدمه الطباعة 3D التجارية ، ولكن يمكن أيضا ان يتحقق من قبل الطابعة 3D نهاية عاليه في المنزل. من بين مختلف أساليب التصنيع ثلاثي الابعاد ، ينصح بالتصوير المجسم لتوليد العفن عالي الدقة. لان معالجه PDMS يحدث في درجه حرارة عاليه (80 درجه مئوية) ، يجب ان تكون المواد مقاومه حراريا بما فيه الكفاية ، والتي ينبغي ان تكون محدده بوضوح ، إذا تم الاستعانة بمصادر خارجيه للطباعة. ويمكن مناقشه الحرارية بعد العلاج مع شركه خدمه الطباعة لزيادة المقاومة الحرارية للجزء. يتم تحديد تفاصيل خدمه الطباعة والمواد في جدول المواد.
الخاصية الميكانيكية من PDMS الشفاء يعتمد علي درجه حرارة العلاج. إذا تم الاحتفاظ بالخليط PDMS في درجه حرارة الغرفة لفتره طويلة قبل علاجه في الفرن ، يصبح مرنا جدا حتى بعد المعالجة الكاملة. التالي ، يجب ان يتم عمليه التفريغ في درجه حرارة الغرفة في غضون ساعة واحده أو اقل. التفريغ يشير إلى تطبيق دوري من الفراغ التي يمكن ان تساعد في أزاله اي فقاعات صغيره داخل PDMS.
درجه الحموضة من محلول الكولاجين أمر بالغ الاهميه ليس فقط لدبق ولكن أيضا لبقاء الخلية. إذا لم يتم تحييد الكولاجين قبل الاختلاط مع الخلايا ، ستكون قابليه الخلية منخفضه. يعتمد مقدار 1 N NaOH حل لتحييد خليط الكولاجين علي درجه الحموضة من محلول الكولاجين الأصلي ويمكن حسابه نظريا. ومع ذلك ، فمن المستحسن لأضافه حل NaOH إلى محلول الكولاجين تدريجيا ، والتحقق من قراءات الأس الهيدروجيني من المتوسط باستخدام مؤشر الفينول الأحمر أو باستخدام الاشرطه اختبار الأس الهيدروجيني.
التفريغ الجل مهم طوال العملية برمتها. إذا شكلت فقاعات اثناء دبق بعد حقن خليط الكولاجين في الجهاز ، يمكن ازالتها أيضا عن طريق وضع الجهاز علي الجليد لمده 10 دقيقه أو أكثر. من خلال إسقاط درجه الحرارة ، وحجم فقاعات يقلل والفراغات في نهاية المطاف المحتلة من قبل خليط هلام. ويمكن استخدام نفس الطريقة عند المحاصرين فقاعات بين الركائز بعد أضافه الثقافة المتوسطة إلى الخزانات.
وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لإنشاء أجهزه الموائع الوسطي التي تسمح بتضمين البنيات المتعددة الخلوية الكبيرة في بيئة مصفوفة ذات صله من الناحية الفسيولوجية ودمجها مع تدرجات محدده من عوامل النمو والأخرى القابلة للذوبان جزيئات نشطه بيولوجيا. يسمح لنا التصوير الفراغي عالي الدقة بإنتاج قوالب عاليه الجودة ومنخفضه التكلفة. عمليه تصنيع لا تتطلب مرافق غرفه الأبحاث ولا تقنيات التصوير الضوئي ، التالي يسمح للجيل بسيط ولكنه فعال من بيئة 3D للثقافة الخلية والتجريب ، والتي لها مزايا متعددة مقابل 2D التقليدية التجريب. تم تصميم الجهاز الموضح هنا ليكون له مساحة ثقافيه تبلغ 5 ملم وطوله 10 ملم وطوله 1 مم. تسمح المساحة الثقافية الكبيرة نسبيا ذات الارتفاع السميك بنمو الخزانات العضوية الكبيرة الحجم والتي تتراوح من عشرات إلى مئات الميكرومتر. كما انه يسمح بتحليل النشاه الظهاريه المتفرعة ، وتحليل الهجرة الجماعية والخلية الواحدة داخل البيئة الثلاثية الابعاد. جوانب الجهاز هي الآبار المفتوحة التي تسمح باستخدام الماصات القياسية لتغيير وسائل الاعلام أو لأضافه المخدرات دون الحاجة إلى التفاعل معقده مع أجهزه التحكم السائل ، وعاده ما تستخدم للاجهزه ميكروفلويديك الرئيسية. وعلاوة علي ذلك ، فان التكوين البسيط للغرفة PDMS والزجاج الغطاء في الجزء السفلي متوافقة عالميا مع النظم المجهرية المتنوعة. واظهر استخدام الاجهزه اتجاه المتفرعة منحازة من التكوين في انسجه الثدي العادية ، استجابه لانحدار EGF المفروضة كمثال تمثيلي لاستخدام الجهاز. ومع ذلك ، يمكن أيضا ان يمتد هذا الاستخدام إلى انسجه مختلفه ، ومصادر الخلايا ، والتشيمواتراكتانتس ، والادويه لتحليل سلوك الخلايا/الانسجه في 3D. ويمكن أيضا توسيع استخدامها لاستيعاب النمذجة الانسجه أكثر واقعيه ، والتي من شانها ان تستوعب تشكيل شبكه الاوعيه الدموية من الخلايا الفردية داخل الهلام مع دمج أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك المكونات المناعية والمناعة وأنواع الخلايا الظهاريه المتنوعة.
علي الرغم من ان التصوير المجسم يوفر أفضل دقه بين تقنيات الطباعة ثلاثية الابعاد ، الا ان الحد الأدنى لحجم الميزة لا يزال يقتصر علي عده عشرات من الميكرومترات. لذلك ، هذا البروتوكول غير كافيه لتحل محل التصوير الضوئي في افتعال قوالب علي مقياس من عده ميكرومتر. ومن القيود الأخرى علي هذا البروتوكول العمق المنخفض نسبيا للتصوير عالي الجودة في الاتجاه z مقارنه بالاتجاه x-y ، الذي يعد مساله متاصله في التصوير بواسطة النسيج المجهري ، باستخدام المجهر التقليدي. ومع ذلك ، حتى مع هذه القيود ، يمكن ان توفر الطريقة الموصوفة منصة تحليل قويه ومرنه سهله التصنيع والاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة إلى الجمعية الخيرية (NSF PD-11-7246 ، ومؤسسه بحوث سرطان الثدي (BCRF) ، والU54 CA210173) وال (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al.
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
