Summary
Vi beskriver en metode til at konstruere enheder til 3D-kultur og eksperimenter med celler og fler cellulære organoider. Denne enhed gør det muligt at analysere cellulære reaktioner på opløselige signaler i 3D-mikromiljøer med definerede chemoattraktant gradienter. Organoider er bedre end enkeltceller ved påvisning af svage støjende indgange.
Abstract
Forskellige begrænsninger af 2D cellekultur systemer har udløst interesse i 3D cellekultur og analyseplatforme, som ville bedre efterligne den rumlige og kemiske kompleksitet af levende væv og efterligne in vivo vævs funktioner. De seneste fremskridt inden for mikrofabrikations teknologier har lettet udviklingen af 3D in vitro-miljøer, hvor cellerne kan integreres i en veldefineret ekstracellulær matrix (ECM) og et defineret sæt af opløselige eller matrix associerede biomolekyler. De teknologiske barrierer har imidlertid begrænset deres udbredte anvendelse i forskningslaboratorier. Her beskriver vi en metode til at konstruere simple enheder til 3D-kultur og eksperimenter med celler og flercellede organoider i 3D-mikromiljøer med en defineret kemoattraktant gradient. Vi illustrerer brugen af denne platform til analyse af respons af epitheliale celler og organoider til stigninger i vækstfaktorer, såsom epidermal vækstfaktor (EGF). EGF-gradienter var stabile i enhederne i flere dage, hvilket førte til direkte forgrenings dannelse i bryst organoider. Denne analyse gjorde det muligt for os at konk drage, at kollektiv gradient sensing efter grupper af celler er mere følsom vs. enkeltceller. Vi beskriver også fabrikations metoden, som ikke kræver photolithografi faciliteter eller avancerede Soft litografi teknikker. Denne metode vil være nyttigt at studere 3D cellulære adfærd i forbindelse med analysen af udvikling og patologiske tilstande, herunder kræft.
Introduction
I fysiologisk miljø er cellerne indlejret i en ekstracellulær matrix (ECM) og eksponeret for et væld af biomolekyler. Interaktioner mellem celler og det omgivende mikromiljø regulerer intracellulære processer, der kontrollerer forskellige fænotyper, herunder migration, vækst, differentiering og overlevelse1,2. Meget er blevet lært om cellulære adfærd i en konventionel 2D cellekultur. Men med fremkomsten af intravital Imaging og eksperimenter med celler indlejret i 3D hydrogels, vigtige forskelle i celle adfærd er blevet anerkendt i den forenklede 2D in vitro-kulturer vs. 3D vævs lignende miljøer. Mens cellerne interagerer med ECM-fibre og fornemmer deres mekaniske egenskaber i 3D-matrixen, er gelen ikke en helt uafhængig variabel i et 2D in vitro-system. Dimensionaliteten ændrer fokale vedhæftnings dannelse, hvilket resulterer i forskellige cellers morfologi og opførsel. Desuden er celler på en 2D-overflade udsat for færre signalering signaler end celler åbne for alle retninger i 3D.
Disse begrænsninger har øget interesserne for 3D-systemer, der repræsenterer den rumlige og kemiske kompleksitet af levende væv og bedre forudsige in vivo vævs funktioner. De er blevet udviklet i mange former fra organoider som selv-samle cellulære mikrostrukturer til celler tilfældigt afbrudt i ECM3,4. Nylige fremskridt inden for mikrofabrikation teknologier har lettet fremkomsten af forskellige typer af 3D-kultur systemer5,6,7,8,9 for at studere fænotypiske ændringer og cellulære reaktioner på opløselige signaler; teknologiske barrierer begrænser imidlertid den udbredte anvendelse i forskningslaboratorier. I mange tilfælde kræver fremstillingsprocessen photolitografi teknikker og baggrundsviden for Soft litografi. Desuden skal forskellige faktorer styres for at kunne bygge en anordning og for at opnå en optimal funktion af enheden over en lang periode.
Vores metode beskriver, hvordan man konstruerer en 3D PDMS-enhed til at inkorporere celler og fler cellulære organoider i et 3D-mikromiljø med definerede chemoattraktant gradienter og derefter analysere epitel svar til EGF10. Vores data afslører, at kapaciteten af organoider til at reagere på lavvandede EGF-gradienter skyldes intercellulære kemiske kobling gennem Gap vejkryds. Det antyder potentialet af organoider for mere præcis påvisning af svage og støjende rumligt graduerede indgange. Fremstillingsprocessen kræver ikke en renrum facilitet eller photolitografi teknikker. Men, 3D PDMS enhed omfatter nødvendige faktorer af 3D fysiologiske miljø. Denne metode vil være nyttigt at studere 3D cellulære adfærd og det har stor forskningspotentiale med forskellige celletyper, chemoattraktanter, og ECM kombinationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt animalsk arbejde blev udført i overensstemmelse med protokoller revideret og godkendt af den institutionelle dyrepasning og brug udvalget, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. fabrikation af mesofluidic enhed
- Design masken af formen til PDMS enhed ved hjælp af en 3D CAD-software.
- Udskriv formen ved hjælp af stereolitografi udstyr med en termisk resistent harpiks.
Bemærk: de beskrevne procedurer blev udført af en professionel 3D-udskrivningstjeneste. - Bland grundigt en PDMS-monomer opløsning med hærdnings midlet i et 10:1 ratio. der kræves 3 mL PDMS-blanding til fremstilling af anordningen. Den totale volumen afhænger af antallet af forme, der skal fabrikeres.
- Degas blandingen ved at anvende et vakuum med brug af en in-House laboratorie vakuum eller vakuumpumpe i en vakuum Ekssikator i 1 time.
- DUP overfladen af formen med en tape til at fjerne støv, og hæld derefter PDMS blandingen til formen. Hvis der indføres bobler i processen, gentages afgasning i vakuum Ekssikator. Bobler fanget mellem søjler af formen kan fjernes ved stikke dem med en skarp nål.
Bemærk: afgasnings processen ved stuetemperatur skal ske inden for 1 time eller derunder. - Du skal helbrede PDMS ved opvarmning ved 80 °C i 2 timer. Lad formen køle af ved stuetemperatur.
- Skær grænsen mellem formen og PDMS med en klinge og derefter skrælle PDMS fra formen omhyggeligt.
- Trim PDMS delen, så den passer til 22 mm x 22 mm dækglas og punch et hul ved indgangen.
Bemærk: protokollen kan sættes på pause her. - Rengør PDMS-delen og 22 mm x 22 mm dækglas ved at aftørre overfladerne med lavt fnug væv og 70% ethanol. Fjern derefter store støvpartikler ved at fuppe med et klæbebånd.
- Steriliser PDMS delen og dækglas ved enten autoklavering (121 °c i 8 minutter våd, 15 minutter tør) eller udsættelse for UV-lys i 1 time.
- Behandl den nederste overflade af PDMS del og Cover slip med Korona udladnings pistol i 5 min i vævet kultur hætte og derefter binde dem sammen.
Forsigtig: Læg ikke-ledende materiale såsom polystyren skum på bunden og fjern alle ledende materialer under denne proces. Injicer kollagen i enheden med det samme, inden for 5 minutter, efter behandlingen for at øge limning mellem kollagen gel og glas coverslip.
2. celle klargøring: primær mælke-og organoid isolering
Bemærk: detaljerne i mælke-organoid isolation kan findes i et tidligere arbejde11. Enhver form for enkelt celle eller organoid kan tilberedes i henhold til deres egen isolation/løsrivelse protokoller.
- Musens mælke kirtel væv med en skalpel, indtil vævet slapper af og rystes i 30 min ved 37 °c i 50 ml kollagenase/trypsin opløsning (10 ml pr. mus) i DEME/F12 suppleret med 0,1 g trypsin, 0,1 g kollagenase , 5 mL FBS, 250 μL 1 μg/mL insulin og 50 μL 50 μg/mL gentamicin.
- Kollagenase/trypsin-opløsningen centrifugeres ved 1.250 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten ved aspiration. Dispergerings celler i 10 mL DMEM/F12, og centrifuge ved 1.250 x g i 10 min. Efter fjernelse af DMEM/F12 ved aspiration, re-suspendere celler i 4 mL DMEM/F12 suppleret med 40 μL af DNase (2 enheder/μL).
- DNase-opløsningen rystes i hånden i 2-5 min. og centrifugeres derefter ved 1.250 x g i 10 min.
- Adskil organoider fra enkeltceller gennem fire differentialcentrifugationer (puls til 1.250 x g og stop centrifuge 3-4 s, når den når den tilsigtede hastighed). Mellem hver impuls aspirerer supernatanten og genudsætter pellet i 10 mL DMEM/F12.
- Resuspension af den endelige pellet i den ønskede mængde vækstmedium af DMEM/F12 med 1% penicillin/streptomycin og 1% insulin-transferrin-selenium-X til kollagen præparat.
3. tilberedning og injektion af kollagen
Bemærk: andre typer af ECM-geler kan tilberedes i henhold til deres egne gelerings protokoller.
- Forbered kollagen type I opløsning (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH opløsning, normalt vækstmedium på is.
Bemærk: hold på is, indtil proceduren er afsluttet. - Der tilsættes 6 μL 1 N NaOH opløsning, 200 μL vækstmedium og 50 μL 10 x DMEM til et forkølet mikrocentrifuge glas, og opløsningen blandes grundigt.
- Der tilsættes 425 μL kollagen til den præ-blandede opløsning, som blandes grundigt ved pipettering.
- Kollagenblandingen centrifugeres kortvarigt (mindre end 5 sekunder) for at adskille og fjerne bobler fra blandingen.
- Opbevar den neutraliserede kollagenopløsning på is i 1 time for at fremkalde fiber dannelse.
- Der tilsættes 50 μL cellesuspension til kollagenblandingen, og blandingen blandes grundigt.
Bemærk: den endelige kollagen koncentration er 2 mg/mL. - Injicer opløsningen med 200 μL pipet gennem indgangen på PDMS-enheden, indtil hele kammeret er fyldt. Hvis kollagenblandingen løber ud gennem hullerne i søjlerne, skæres den overskydende kollagen gel med skarp kirurgisk klinge efter gelering.
- Opbevar apparatet i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 i 1 time for at fremkalde gelering.
- Fyld beholderne på begge sider med vækstmedium, og opbevar enheden i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2, indtil der udføres confokal Imaging.
4.3D-billeddannelse og kvantificering
- Installer en levende celle Billeddannende kultur kammer til et confokal mikroskop og præ-indstille temperaturen og CO2 til 37 °c og 5%, hhv. For at få fugt op, tilsæt vand i reservoiret af kammeret og placere våde klude i kammeret, hvis det er nødvendigt.
- Placer PDMS-enheden i kammeret, og Tilføj EGF til et af reservoiret som en» kilde «til GLOBALISERINGSFONDEN i gradient-dannelsen. Det andet reservoir vil tjene en "Sink", der er nødvendig for udviklingen af den rumligt graduerede EGF-distribution. 2,5 nM af EGF blev tilføjet i vasken for at gøre gradienten af 0,5 nM/mm i denne undersøgelse.
- Indstil rækken af Z-stack, der dækker mængden af organoider af interesse og starte billeddannelse.
Forsigtig: for at undgå fototoksicitet, prøv en lavere laser intensitet i Konfokal billeddannelse eller brug multi-photon Imaging teknikker. - Rekonstruere et 3D-billede fra 2D-billedstakke ved hjælp af enten kommerciel software eller et skræddersyet program. Mål længden og vinklen af grene, der strækker sig fra organoider eller migration af individuelle celler. Her kan du udføre kvantificering ved at tegne en frihånds skitse omkring den organoide krop ved hjælp af ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF er en vigtig regulator af forgrening morfogenese i brystkirtler og en kritisk chemoattraktant vejlede migration af bryst epiteliale celler i invasiv kræft vækst. Vi brugte de mesoscopiske Fluidic-enheder, der er beskrevet ovenfor, til at studere cellernes respons på definerede EGF-gradienter (figur 1a, B)10. Enheden giver et kultur område, der er 5 mm bredt, 10 mm langt og 1 mm højt. Siderne af kulturområdet er adskilt fra åbne brønde af sekskantede søjler, som bruges til at fælde den flydende ECM og celle blandingen inden for cellekultur området gennem overfladespænding. Vi bemærker, at i betragtning af størrelsen af denne 3D-kultur, ville det være meget vanskeligt, dyrt, og tidskrævende at konstruere en passende størrelse mug ved rotation10. Ved hjælp af en ny anvendelse af en standard teknik, stereolitografi, vi hurtigt og billigt produceret formen. Ved at ændre designet kan der desuden induceres en eksponentiel gradient (figur1c, i) eller flere lineære gradienter i en chip (figur 1c, II) samt en stabil gradient med kontinuerlig strømning (figur 1c, III).
Både i silicium (figur 2a, B, C) og in vitro (figur 2D, E, F) test viste dannelsen af en stabil lineær EGF-gradient på tværs af cellekultur området, som varede i ca. to dage uden at fylde» "kilde" og "dræn" reservoirer. Den tidsafhængige diffusion af proteinerne blev simuleret ved hjælp af en kommercialiseret multi fysik software. Den 3D geometri af kammeret konfiguration blev genfundet på softwaren og den gennemsnitlige koncentration i kammeret volumen blev fastlagt og plottet. Disse resultater tydede på, at EGF, et 6,4 kDa-protein, kan danne en stabil diffusions baseret gradient inden for den kollagen-gel, der er fremstillet som beskrevet ovenfor over en relativ kort tidsperiode. Vi har også besluttet, at lignende profiler af proteiner af 1, 10, og 150 kDa kunne dannes ved hjælp af denne metode.
Mammary organoider dannet flere grene i nærværelse af rumligt ensartet 2,5 nM EGF og filialen dannelse viste ingen retningsbestemt bias over 3 dage (figur 3a, D). Hvis EGF imidlertid blev tilsat i form af en lineær gradient på 0,5 nM/mm, udviste forgrenings dannelsen en signifikant retningsbestemt bias (figur 3B, E). Hvordan end, vi opdaget ikke sådan bias nemlig ugifte celler i den samme gradient. For at afgøre, om flercellede kommunikation var nødvendig for gradient respons, vi udforsket, hvis blokering intercellulære Gap kryds med forskellige inhibitorer ville forhindre den partiske gren formation. Gap Junction hæmmere faktisk undertrykt evne til organoider til at reagere på gradient (figur 3c, F). Som det undersøges mere udførligt i den oprindelige undersøgelse, der beskriver denne metode10, understøtter dette resultat hypotesen om, at kommunikationen gennem Gap-kryds er nødvendig for Globaliseringsfondens gradient respons i mælke organoider10.
Figur 1. Mesofluidic-enhed med defineret EGF-gradient. (A) 3D- visning af PDMS-chip: (i) ovenfra og (II) Forside af en skimmel (enhed: mm) (III) en matrix af forme (rød) fyldt med PDMS (gennemsigtig) (IV) PDMS kamre pilled fra formen (v) et skematisk diagram af en samlet anordning (vi) et reelt billede af anordningen fyld med kollagen gel og kulturmedium. (B) et skematisk diagram over det mesofluidiske kammer med organoider indlejret i en kollagen gel og reservoirer med høj (rød) og lav (rød) EGF-koncentration, der resulterer i EGF-stigninger (dette tal er blevet ændret fra10). C) potentielle udformninger til fremkaldelse af en eksponentiel gradient (i), fire forskellige lineære gradienter i en chip (II) og en stabil gradient med kontinuerlig strømning (III). Røde regioner angiver kilder eller dræn fyldt med kulturmedium og grå regioner angiver kamre fyldt med gel/celler blanding. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Evaluering af ligand gradienter på tværs af chip. (A) simulering af ligand koncentration på tværs af chippen viser gradient profiler. Simulerede gradient profiler af (B) 1 kDa-protein og (C) 70 kDa-protein. (D) billede af enheden med en lineær gradient på 10 kDa dextran Blue, der anvendes til at visualisere udbredelsen af EGF. Hexagonal stiplede linjer indikerer søjler ved siden af gel området. Eksperimentelle gradient profiler af 1, 10 og 150 kDa dextran på tværs af chippen (dette tal er blevet ændret fra Ellison et al. 201610) (E) efter 8 timer og (F) efter 48 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Cellulære respons på EGF-gradient. (A) ikke-retningsbestemt forgrenning af organoider i kollagen med en ensartet 2,5 nm EGF. (B) retningsbestemt forgrenning af organoider i kollagen med en lineær gradient på 0,5 nm/mm EGF. (C) ikke-retningsbestemt forgrening af organoider i en lineær gradient på 0,5 nm/mm EGF med en Gap Junction blocker. (D-F) Kantede histogrammer af organoid forgrenings retninger svarende til (A)-(C), hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremstillingen af PDMS forme blev udført ved hjælp af en kommerciel 3D trykning service, men kan også opnås ved en høj ende 3D printer in-House. Blandt forskellige 3D fabrikation metoder, stereolitografi anbefales til høj opløsning skimmeldannelse. Da PDMS-hærdning forekommer ved høj temperatur (80 °C), skal materialerne være tilstrækkeligt varmebestandige, hvilket udtrykkeligt bør specificeres, hvis udskrivningen er outsourcet. En termisk post-kur kan diskuteres med trykkeriet selskab til at øge den termiske modstand af den del. Oplysningerne om trykkeriet og materialerne er angivet i tabellen over materialer.
Den mekaniske egenskab af hærdet PDMS afhænger af hærdnings temperaturen. Hvis PDMS blandingen holdes ved stuetemperatur i lang tid før hærdning i en ovn, bliver det for elastisk selv efter fuldstændig hærdning. Således afgasnings processen ved stuetemperatur bør ske inden for 1 time eller mindre. Afgasning refererer til en cyklisk anvendelse af vakuum, der kan hjælpe med at fjerne eventuelle mikro-bobler i PDMS.
PH af kollagenopløsningen er kritisk, ikke kun for gelering, men også for cellernes levedygtighed. Hvis kollagen ikke neutraliseres før blanding med celler, vil cellernes levedygtighed være lav. Mængden af 1 N NaOH opløsning til neutralisering af kollagenblandingen afhænger af pH i den oprindelige kollagenopløsning, og den kan beregnes teoretisk. Det anbefales dog at tilføje NaOH-opløsningen til kollagenopløsningen gradvist, kontrollere pH-aflæsninger af mediet ved hjælp af phenolrød indikator eller ved hjælp af pH-Test bånd.
Afgasning af gelen er vigtig gennem hele processen. Hvis bobler form under gelering efter kollagen blandingen injiceres i enheden, kan de også fjernes ved at placere enheden på is i 10 min eller mere. Ved at droppe temperaturen, størrelsen af bobler reducerer og hulrum er til sidst besat af gel blandingen. Den samme metode kan anvendes, når bobler er fanget mellem søjler efter tilsætning af kulturmedium til reservoirer.
Vi brugte denne teknologi til at skabe mesofluidic enheder, der tillader indlejring af store multi cellulære konstruktioner i et fysiologisk relevant ekstracellulær matrix miljø og integrere det med definerede gradienter af vækstfaktorer og andre opløselige bioaktive molekyler. Stereolithografi i høj opløsning gav os mulighed for at producere lavomkostnings forme af høj kvalitet. Fremstillingsprocessen kræver ikke renrum faciliteter eller photolitografi teknikker, og dermed giver mulighed for en enkel, men effektiv generation af et 3D-miljø for cellekultur og eksperimenter, som har flere fordele vs. den traditionelle 2D Eksperimenter. Enheden illustreret her er designet til at have et kultur område på 5 mm bred, 10 mm lang, og 1 mm høj. Den relativt store kultur område med tykkere højde tillader vækst af mesoskopisk store organoider eller sfæroider, der spænder i størrelse fra snesevis til hundredvis af mikrometer. Det giver også mulighed for analyse af forgrenede epitelial morfogenese, og analyse af kollektiv og enkelt celle migration i 3D-miljø. Siderne af enheden er åbne brønde, der tillader brug af standard pipetter til at skifte medie eller til at tilføje stoffer uden behov for komplicerede samspil med de flydende kontrolanordninger, der normalt anvendes til mainstream mikrofluidisk kapllærelektroforese enheder. Desuden er den enkle konfiguration af et PDMS kammer og et dækglas i bunden universelt kompatibelt med forskellige mikroskopiske systemer. Brugen af enhederne viste partisk forgrening retning morfogenese i normal brystvæv, som svar på den indførte EGF gradient som et repræsentativt eksempel for brugen af enheden. Men, denne skik kan også udvides til forskellige væv, celle kilder, chemoattraktanter, og lægemidler til analyse af celle/væv opførsel i 3D. Brugen kan også udvides til at rumme mere realistisk vævs modellering, som ville rumme vaskulære netværk dannelse fra individuelle celler i gel sammen med indarbejde andre celletyper, herunder mesenkymale stromale og immun komponenter og forskellige epiteliale celletyper.
Selvom stereolithografi tilbyder den fineste opløsning blandt 3D-udskrivnings teknikker, er den minimale funktions størrelse stadig begrænset til flere snesevis af mikrometer. Derfor er denne protokol ikke tilstrækkelig til at erstatte photolitografi i fabriskende forme i en skala af flere mikrometer. En anden begrænsning af denne protokol er den relativt lave dybde af høj kvalitet Imaging i z retning i forhold til x-y retning, som er et iboende spørgsmål af Imaging væv-skala konstruktioner, ved hjælp af konventionel mikroskopi. Men selv med disse begrænsninger, den beskrevne metode kan give en kraftfuld og fleksibel analyseplatform, der er let at fabrikere og bruge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til AJE (NSF PD-11-7246, brystkræft forskningsfonden (BCRF-17-048) og NIC U54 CA210173) og AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al.
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
