Summary
Describimos un método para construir dispositivos para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares. Este dispositivo permite el análisis de las respuestas celulares a señales solubles en microambientes 3D con degradados de quimioattractant definidos. Los organoides son mejores que las células individuales en la detección de entradas ruidosas débiles.
Abstract
Varias limitaciones de los sistemas de cultivo celular 2D han despertado interés en las plataformas de análisis y cultivo celular 3D, que imitaría mejor la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y imitará las funciones de tejido in vivo. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el desarrollo de entornos 3D in vitro en los que las células pueden integrarse en una matriz extracelular bien definida (ECM) y un conjunto definido de biomoléculas solubles o asociadas a matrices. Sin embargo, las barreras tecnológicas han limitado su uso generalizado en los laboratorios de investigación. Aquí describimos un método para construir dispositivos simples para la cultura 3D y la experimentación con células y organoides multicelulares en microentornos 3D con un gradiente de quimioattractant definido. Ilustramos el uso de esta plataforma para el análisis de la respuesta de células epiteliales y organoides a gradientes de factores de crecimiento, como el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Los gradientes de EGF fueron estables en los dispositivos durante varios días, lo que condujo a la formación de ramas dirigidas en organoides mamarios. Este análisis nos permitió concluir que la detección de gradiente colectiva por grupos de células es más sensible frente a células individuales. También describimos el método de fabricación, que no requiere instalaciones de fotolitografía ni técnicas avanzadas de litografía blanda. Este método será útil para estudiar los comportamientos celulares en 3D en el contexto del análisis del desarrollo y los estados patológicos, incluyendo el cáncer.
Introduction
En el entorno fisiológico, las células se incrustan en una matriz extracelular (ECM) y se exponen a una plétora de biomoléculas. Las interacciones entre las células y el microentorno circundante regulan los procesos intracelulares que controlan diversos fenotipos, incluyendo la migración, el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia1,2. Se ha aprendido mucho acerca de los comportamientos celulares en un cultivo celular 2D convencional. Sin embargo, con el advenimiento de la imagen intravital y la experimentación con células incrustadas en los hidrogeles 3D, se han reconocido importantes diferencias en los comportamientos celulares en los cultivos 2D in vitro simplificados frente a los entornos de tejido 3D. Mientras que las células interactúan con las fibras de ECM y detectan sus propiedades mecánicas dentro de la matriz 3D, la rigidez del material del gel no es una variable totalmente independiente en un sistema 2D in vitro. La dimensionalidad altera la formación de adherencia focal, resultando en diferentes morfología y comportamiento de las células. Además, las celdas en una superficie 2D se exponen a menos señales de señalización que las celdas abiertas a todas las direcciones en 3D.
Estas limitaciones han incrementado los intereses de los sistemas 3D que representan la complejidad espacial y química de los tejidos vivos y predicen mejor las funciones de tejido in vivo. Se han desarrollado en muchas formas a partir de organoides como microestructuras celulares de auto-ensamblaje a las células intercaladas aleatoriamente en ECM3,4. Los recientes avances en las tecnologías de microfabricación han facilitado el advenimiento de varios tipos de sistemas de cultivo 3D5,6,7,8,9 para estudiar los cambios fenotíricos y respuestas celulares a señales solubles; sin embargo, las barreras tecnológicas limitan el uso generalizado en los laboratorios de investigación. En muchos casos, los procesos de fabricación requieren técnicas de fotolitografía y conocimientos de fondo para la litografía blanda. Por otra parte, varios factores deben ser controlados para construir con éxito un dispositivo y para lograr una función óptima del dispositivo durante un largo período de tiempo.
Nuestro método describe cómo construir un dispositivo PDMS 3D para incorporar células y organoides multicelulares en un microentorno 3D con gradientes de prenilado definidos y luego analizar las respuestas epiteliales al EGF10. Nuestros datos revelan que la capacidad de los organoides para responder a los degradados de EGF superficiales surge del acoplamiento químico intercelular a través de uniones de brecha. Sugiere el potencial de los organoides para una detección más precisa de entradas débiles y ruidosas espacialmente graduadas. El proceso de fabricación no requiere una instalación de sala limpia ni técnicas de fotolitografía. Sin embargo, el dispositivo PDMS 3D incluye los factores necesarios del entorno fisiológico 3D. Este método será útil para estudiar comportamientos celulares en 3D y tiene un gran potencial de investigación con diferentes tipos de células, quimioattractantes, y combinaciones de ECM.
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Protocol
Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos revisados y aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales, Universidad Johns Hopkins, Facultad de medicina.
1. fabricación del dispositivo mesofluidic
- Diseñe la máscara del molde para el dispositivo PDMS utilizando un software CAD 3D.
- Imprima el molde con un equipo de estereolitografía con una resina resistente térmica.
Nota: los procedimientos descritos aquí fueron llevados a cabo por un servicio de impresión 3D comercial. - Mezclar minuciosamente una solución de monómero de PDMS con el agente de curado en una relación de 10:1. se requirió 3 mL de mezcla de PDMS para la fabricación del dispositivo. El volumen total depende del número de moldes que se fabrique.
- Degas la mezcla aplicando un vacío con el uso de una aspiradora de laboratorio o bomba de vacío en un desecador de vacío durante 1 hora.
- Frote la superficie del molde con una cinta adhesiva para eliminar el polvo y, a continuación, vierta la mezcla de PDMS en el molde. Si se introducen burbujas en el proceso, repita la desgasificación en el desecador de vacío. Las burbujas atrapadas entre los pilares del molde se pueden quitar al pintarlas con una aguja afilada.
Nota: el proceso de desgasificación a temperatura ambiente debe hacerse dentro de 1 hora o menos. - Curar el PDMS calentando a 80 ° c durante 2 horas. Deje enfriar el molde a temperatura ambiente.
- Corte el contorno entre el molde y el PDMS con una cuchilla y, a continuación, despegue el PDMS del molde con cuidado.
- Recorte la pieza PDMS para que encaje en el recubrimiento de 22 mm x 22 mm y golpee un orificio en la entrada.
Nota: el protocolo se puede pausar aquí. - Limpie la parte PDMS y la cobertura de 22 mm x 22 mm limpiando las superficies con tejidos de baja pelusa y etanol al 70%. A continuación, extraiga las partículas de polvo grandes con una cinta adhesiva.
- Esterilizar la parte PDMS y cubrirse con cualquier autoclave (121 ° c durante 8 minutos húmedos, 15 minutos secos) o la exposición a la luz UV durante 1 hora.
- Trate la superficie inferior de la parte PDMS y el resguardo de la tapa con la pistola de descarga corona durante 5 min en la campana de cultivo de tejido y luego juntarlos.
PRECAUCIÓN: Coloque cualquier material no conductora como espuma de poliestireno en la parte inferior y quite todos los materiales conductoras durante este proceso. Inyecte colágeno en el dispositivo inmediatamente, dentro de 5 minutos, después del tratamiento para aumentar la unión entre el gel de colágeno y el recubrimiento de vidrio.
2. preparación celular: aislamiento organoide mamario primario
Nota: los detalles del aislamiento organoide mamario se pueden encontrar en una obra anterior11. Cualquier tipo de célula única o organoide puede prepararse de acuerdo con sus propios protocolos de aislamiento/desprendimiento.
- Mince el tejido de las glándulas mamarias de los ratones con un bisturí hasta que el tejido se relaja y se agita durante 30 min a 37 ° c en 50 mL de solución de colagenasa/tripsina (10 mL por ratón) en DEME/F12 complementado con 0,1 g de tripsina, 0,1 g de colagenasa , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL de insulina, y 50 μL de 50 μg/mL de gentamicina.
- Centrifugar la solución de colagenasa/tripsina a 1.250 x g durante 10 min, retirar el sobrenadante por aspiración. Dispersar las células en 10 mL de DMEM/F12, y centrifugar a 1.250 x g durante 10 min. Después de eliminar DMEM/F12 por aspiración, vuelva a suspender las células en 4 mL de DMEM/F12 suplementadas con 40 μL de DNase (2 unidades/μL).
- Agitar la solución de DNase a mano durante 2-5 min y luego centrifugar a 1.250 x g durante 10 min.
- Separe los organoides de las células individuales a través de cuatro centrífugas diferenciales (pulse hasta 1.250 x g y detenga la centrifugadora 3-4 s después de que alcance la velocidad prevista). Entre cada pulso, aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 10 mL de DMEM/F12.
- Vuelva a suspender el pellet final en la cantidad deseada de medio de crecimiento de DMEM/F12 con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de insulina-transferrina-selenio-X para la preparación de colágeno.
3. preparación e inyección de colágeno
Nota: otros tipos de geles ECM se pueden preparar de acuerdo con sus propios protocolos de la gelificación.
- Prepare la solución de colágeno tipo I (3,78 mg/mL), 10X DMEM, 1 N NaOH solución, medio de crecimiento normal en hielo.
Nota: Mantenga el hielo hasta que se complete el procedimiento. - Añadir 6 μL de 1 N NaOH solución, 200 μL de medio de crecimiento y 50 μL de 10x DMEM en un tubo de microcentrífuga pre-enfriado y mezclar la solución a fondo.
- Añadir 425 μL de colágeno en la solución premezclada y mezclar bien mediante pipeteo.
- Centrifugar la mezcla de colágeno brevemente (menos de 5 segundos) para separar y eliminar las burbujas de la mezcla.
- Mantenga la solución de colágeno neutralizado en hielo durante 1 hora para inducir la formación de fibras.
- Añadir 50 μL de suspensión celular a la mezcla de colágeno y mezclar bien.
Nota: la concentración final de colágeno es de 2 mg/mL. - Inyecte la solución utilizando 200 μL de Pipet a través de la entrada del dispositivo PDMS hasta que se llene toda la cámara. Si la mezcla de colágeno se desborda a través de los huecos de los pilares, cortar el exceso de colágeno gel con cuchilla quirúrgica aguda después de la gelation.
- Mantener el dispositivo en la incubadora a 37 ° c con 5% de CO2 durante 1 hora para inducir la gelación.
- Llene los embalses en ambos lados con medio de crecimiento y mantenga el dispositivo en la incubadora a 37 ° c con 5% de CO2 hasta que se realice la imagen confocal.
4. imágenes y cuantificación 3D
- Instale una cámara de cultivo de imágenes de células vivas en un microscopio confocal y ajuste previamente la temperatura y el CO2 a 37 ° c y el 5%, respectivamente. Para obtener humedad, agregue agua en el depósito de la cámara y coloque toallitas húmedas en la cámara si es necesario.
- Colocar el dispositivo PDMS en la cámara y añadir EGF a uno de los reservorios como una ' fuente ' del EGF en la formación de gradiente. El otro reservorio servirá un "fregadero" necesario para el desarrollo de la distribución de EGF nivelalmente calificada. 2,5 nM de EGF se añadió en el fregadero para hacer el gradiente de 0,5 nM/mm en este estudio.
- Establezca el rango de la pila Z cubriendo el volumen de organoides de interés e inicie la toma de imágenes.
PRECAUCIÓN: para evitar la fototoxicidad, pruebe una menor intensidad del láser en las imágenes confocales o utilice técnicas de imagen multifotónicas. - Reconstruya una imagen 3D a partir de pilas de imágenes 2D utilizando software comercial o un programa hecho a medida. Mida la longitud y el ángulo de las ramas que se extienden desde los organoides o la migración de las células individuales. Aquí, realice la cuantificación dibujando un contorno a mano alzada alrededor del cuerpo organoide usando ImageJ.
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Representative Results
El EGF es un regulador esencial de la morfogénesis ramificada en las glándulas mamarias y un quimioattractante crítico que guía la migración de las células epiteliales del seno en el crecimiento invasivo del cáncer. Se utilizaron los dispositivos fluídico mesoscópicos descritos anteriormente para estudiar la respuesta de las células a los gradientes definidos de EGF (figura 1A, B)10. El dispositivo produce un área de cultivo de 5 mm de ancho, 10 mm de largo y 1 mm de alto. Los lados de la zona de cultivo están separados de los pozos abiertos por pilares hexagonales, que se utilizan para atrapar el ECM líquido y la mezcla celular dentro del área de cultivo celular a través de la tensión superficial. Observamos que, dado el tamaño de esta cultura 3D, sería muy difícil, costoso y laborioso construir un molde de tamaño adecuado por Fotolitografía10. Mediante el uso de una nueva aplicación de una técnica estándar, estereolitografía, rápidamente y de forma económica produjeron el molde. Además, modificando el diseño, se puede inducir un gradiente exponencial (figura 1C, i) o múltiples gradientes lineales en un chip (figura 1C, II) así como un gradiente estable con flujo continuo (figura 1C, III).
Tanto en silico (figura 2A, B, C) como in vitro (Figura 2D, E, F), las pruebas demostraron la formación de un gradiente estable de EGF lineal a través del área de cultivo celular que duró aproximadamente dos días sin reponer el ' depósitos de origen y de sumidero. La difusión dependiente del tiempo de las proteínas se simuló utilizando un software multifísica comercializado. La geometría 3D de la configuración de la cámara se recreó en el software y se determinó y trazó la concentración media dentro del volumen de la cámara. Estos resultados sugieren que EGF, una proteína 6,4 kDa, puede formar un gradiente basado en la difusión estable dentro del gel de colágeno preparado como se describió anteriormente durante un período relativamente corto de tiempo. También determinamos que se podrían formar perfiles similares de proteínas de 1, 10 y 150 kDa utilizando este método.
Los organoides mamarios formaron múltiples ramas en presencia de EGF espacialmente uniforme 2,5 nM y la formación de la rama no muestra ningún sesgo direccional durante 3 días (figura 3a, D). Sin embargo, si se agregó EGF en forma de un degradado lineal de 0,5 nM/mm, la formación de ramas muestra un sesgo direccional significativo (figura 3B, E). Sin embargo, no detectamos tal sesgo para las celdas individuales en el mismo gradiente. Con el fin de determinar si la comunicación multicelular era necesaria para la respuesta de gradiente, exploramos si el bloqueo de uniones de brecha intercelulares con varios inhibidores impediría la formación de ramas sesgadas. Los inhibidores de la Unión de huecos de hecho suprimieron la capacidad de los organoides para responder al gradiente (Figura 3C, F). Como se exploró más extensamente en el estudio original que describe este método10, este resultado respalda la hipótesis de que la comunicación a través de uniones por brecha es necesaria para la respuesta del gradiente de EGF en los organoides mamarios10.
Figura 1. Dispositivo mesofluidic con gradiente EGF definido. (A) vista 3D del chip PDMS: (i) vista superior y (II) vista frontal de un molde (unidad: mm) (III) una matriz de moldes (rojo) llenos de PDMS (transparente) (IV) cámaras PDMS arrancada del molde (v) un diagrama esquemático de un dispositivo montado (VI) una imagen real del llenado del dispositivo con gel de colágeno y medio de cultivo. (B) un diagrama esquemático de la cámara mesofluidic con organoides incrustados en un gel de colágeno y embalses de alta (rojo) y baja (rojo) concentración de EGF que se traduce en gradientes de EGF (esta cifra se ha modificado a partir de10). (C) posibles diseños para inducir un gradiente exponencial (i), cuatro gradientes lineales diferentes en un chip (II) y un gradiente estable con flujo continuo (III). Las regiones rojas indican que las fuentes o sumideros llenos de cultivo medio y regiones grises indican cámaras llenas de mezcla de gel/células. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Evaluación de los gradientes de ligando del a través del chip. (A) simulación de la concentración de ligando del a través del chip mostrando perfiles de gradiente. Perfiles de gradiente simulados de (B) 1 proteína kDa y (C) 70 proteína kDa. (D) imagen del dispositivo con un gradiente lineal de 10 kDa dextran azul utilizado para visualizar la difusión de EGF. Las líneas de puntos hexagonales indican pilares en el lado del área del gel. Perfiles experimentales de gradiente de 1, 10 y 150 kDa dextrano a través del chip (esta figura ha sido modificada de Ellison et al. 201610) (E) después de 8 horas y (F) después de 48 horas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Respuesta celular al gradiente de EGF. (A) ramificación no direccional de organoides en colágeno con un EGF uniforme de 2,5 Nm. (B) ramificación direccional de organoides en colágeno con un gradiente lineal de 0,5 Nm/mm de EGF. (C) ramificación no direccional de organoides en un gradiente lineal de 0,5 Nm/mm de EGF con un bloqueador de uniones de separación. (D-F) Histogramas angulares de las direcciones de ramificación organoides correspondientes a (a)-(C), respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La fabricación de moldes PDMS se realizó utilizando un servicio de impresión 3D comercial, pero también puede ser logrado por una impresora 3D de alta gama en la casa. Entre los diversos métodos de fabricación 3D, la estereolitografía se recomienda para la generación de moldes de alta resolución. Debido a que el curado PDMS se produce a una temperatura alta (80 ° c), los materiales deben ser suficientemente resistentes térmicamente, lo que debe especificarse explícitamente, si la impresión es externalizada. Un post-curado térmico se puede tratar con la empresa de servicios de impresión para aumentar la resistencia térmica de la pieza. Los detalles del servicio de impresión y los materiales se especifican en la tabla de materiales.
La propiedad mecánica del PDMS curado depende de la temperatura de curado. Si la mezcla de PDMS se mantiene a temperatura ambiente durante mucho tiempo antes de curar en un horno, se vuelve demasiado elástica incluso después del curado completo. Por lo tanto, el proceso de desgasificación a temperatura ambiente debe hacerse dentro de 1 hora o menos. La desgasificación se refiere a una aplicación cíclica de vacío que puede ayudar a eliminar cualquier micro-burbuja dentro del PDMS.
El pH de la solución de colágeno es crítico no sólo para la Gelación, sino también para la viabilidad celular. Si el colágeno no se neutraliza antes de mezclarse con las células, la viabilidad de la célula será baja. La cantidad de 1 N NaOH solución para neutralizar la mezcla de colágeno depende del pH de la solución de colágeno original y se puede calcular teóricamente. Sin embargo, se recomienda añadir la solución de NaOH a la solución de colágeno gradualmente, comprobando las lecturas de pH del medio utilizando el indicador rojo de fenol o utilizando cintas de prueba de pH.
Desgasificación del gel es importante a lo largo de todo el proceso. Si se forman burbujas durante la gelación después de inyectar la mezcla de colágeno en el dispositivo, también se pueden eliminar colocando el dispositivo sobre hielo durante 10 minutos o más. Al dejar caer la temperatura, el tamaño de las burbujas se reduce y los huecos son eventualmente ocupados por la mezcla de gel. El mismo método se puede utilizar cuando las burbujas están atrapadas entre los pilares después de añadir medio de cultivo a los embalses.
Utilizamos esta tecnología para crear dispositivos mesofluidicos que permiten incrustar grandes construcciones multicelulares en un entorno fisiológicamente relevante de matriz extracelular e integrarlo con gradientes definidos de factores de crecimiento y otros moléculas bioactivas. La estereolitografía de alta resolución nos permitió producir moldes de alta calidad y bajo costo. El proceso de fabricación no requiere instalaciones de sala limpia ni técnicas de fotolitografía, y por lo tanto permite una generación simple pero efectiva de un entorno 3D para el cultivo celular y la experimentación, que tiene múltiples ventajas frente a la tradicional 2D Experimentación. El dispositivo ilustrado aquí fue diseñado para tener un área de cultivo de 5 mm de ancho, 10 mm de largo, y 1 mm de alto. El área de cultivo relativamente grande con una altura más gruesa permite el crecimiento de organoides o esferoides mesoscópicamente grandes, que varían en tamaño de decenas a cientos de micrómetros. También permite el análisis de la morfogénesis epitelial ramificada, y el análisis de la migración colectiva y de célula única dentro del entorno 3D. Los lados del dispositivo son pozos abiertos que permiten el uso de pipetas estándar para cambiar los medios o para añadir fármacos sin la necesidad de interfaz complicada con los dispositivos de control de líquidos, generalmente se utiliza para los dispositivos de microfluidos convencionales. Por otra parte, la simple configuración de una cámara PDMS y un vidrio de cubierta en la parte inferior es universalmente compatible con diversos sistemas microscópicos. El uso de los dispositivos mostró la dirección de ramificación sesgada de la morfogénesis en el tejido mamario normal, en respuesta al gradiente de EGF impuesto como un ejemplo representativo para el uso del dispositivo. Sin embargo, este uso también se puede extender a diferentes tejidos, fuentes celulares, quimioatrayentes, y fármacos para el análisis del comportamiento celular/tejido en 3D. El uso también se puede extender para acomodar el modelado de tejidos más realistas, que permitiría la formación de redes vasculares de células individuales dentro del gel junto con la incorporación de otros tipos de células, incluyendo los componentes del estríbulo mesenquimales y el inmune y diversos tipos de células epiteliales.
Aunque la estereolitografía ofrece la mejor resolución entre las técnicas de impresión 3D, el tamaño mínimo de las características todavía se limita a varias decenas de micrómetros. Por lo tanto, este Protocolo no es suficiente para sustituir la fotolitografía en la fabricación de moldes a una escala de varios micrómetros. Otra limitación de este protocolo es la profundidad relativamente baja de la imagen de alta calidad en la dirección z en comparación con la dirección x-y, que es un problema inherente de las construcciones a escala de tejido de imagen, utilizando microscopía convencional. Sin embargo, incluso con estas limitaciones, el método descrito puede proporcionar una plataforma de análisis potente y flexible que es fácil de fabricar y usar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por donaciones a AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), y NCI U54 CA210173) y AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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