Summary
Vi beskriver en metod för att konstruera enheter för 3D-kultur och experiment med celler och flercelliga organoider. Denna enhet möjliggör analys av cellulära svar på lösliga signaler i 3D mikromiljöer med definierade korrektiv gradienter. Organoider är bättre än enstaka celler vid detektering av svaga bullriga ingångar.
Abstract
Olika begränsningar av 2D cell kultur system har väckt intresse för 3D cell kultur och analysplattformar, som bättre skulle efterlikna den rumsliga och kemiska komplexiteten i levande vävnader och efterlikna in vivo vävnads funktioner. Den senaste tidens framsteg inom mikrofabrikation teknik har underlättat utvecklingen av 3D in vitro-miljöer där celler kan integreras i en väldefinierad extracellulär matris (ECM) och en definierad uppsättning lösliga eller matris associerade bio molekyler. Tekniska hinder har dock begränsat deras utbredda användning i forsknings laboratorier. Här beskriver vi en metod för att konstruera enkla enheter för 3D-kultur och experiment med celler och flercelliga organoider i 3D mikromiljöer med en definierad korrektiv lutning. Vi illustrerar användningen av denna plattform för analys av responsen från epitelceller och organoider till lutningar av tillväxtfaktorer, såsom Epidermal tillväxtfaktor (EGF). EGF lutningar var stabila i enheterna under flera dagar vilket ledde till riktad gren bildning i bröstorganoider. Denna analys tillät oss att dra satsen att kollektiv gradient avkänning av grupper av celler är känsligare kontra enstaka celler. Vi beskriver också tillverknings metoden, som inte kräver fotolitografianläggningar eller avancerade mjuka litografitekniker. Denna metod kommer att vara till hjälp för att studera 3D cellulära beteenden i samband med analys av utveckling och sjukdoms tillstånd, inklusive cancer.
Introduction
I fysiologisk miljö är cellerna inbäddade i en extracellulär matris (ECM) och exponeras för en uppsjö av bio molekyler. Interaktioner mellan celler och den omgivande mikromiljön reglerar intracellulära processer som styr olika fenotyper, inklusive migration, tillväxt, differentiering och överlevnad1,2. Mycket har lärt sig om cellulära beteenden i en konventionell 2D cell kultur. Men med tillkomsten av intravital avbildning och experimenterande med celler inbäddade i 3D hydrogels, viktiga skillnader i cell beteenden har erkänts i den förenklade 2D in vitro-kulturer kontra 3D vävnad-liknande miljöer. Medan cellerna interagerar med ECM-fibrer och känner deras mekaniska egenskaper inom 3D-matrisen, är den materiella styvheten hos gelen inte en helt oberoende variabel i ett 2D in vitro-system. Dimensionaliteten förändrar fokala vidhäftnings bildning, vilket resulterar i olika Cellmorfologi och beteende. Dessutom utsätts celler på en 2D-yta för färre signal signaler än celler som är öppna för alla riktningar i 3D.
Dessa begränsningar har ökat intresset för 3D-system som representerar den rumsliga och kemiska komplexiteten i levande vävnader och bättre förutsäga in vivo vävnads funktioner. De har utvecklats i många former från organoider som själv montering cellulära mikrostrukturer till celler slumpmässigt varvat i ECM3,4. De senaste framstegen inom mikrofabrikation Technologies har underlättat tillkomsten av olika typer av 3D kultur system5,6,7,8,9 för att studera fenotypiska förändringar och cellulära svar på lösliga signaler; tekniska hinder begränsar dock den utbredda användningen i forsknings laboratorier. I många fall kräver tillverknings processerna foto litografi tekniker och bakgrunds kunskaper för mjuk litografi. Dessutom måste olika faktorer kontrol leras för att framgångs rikt bygga en enhet och för att uppnå en optimal funktion av enheten under en lång tid.
Vår metod beskriver hur man konstruerar en 3D PDMS-enhet för att införliva celler och multicellulära organoider i en 3D-mikromiljö med definierade kemoattractant lutningar och sedan analysera epiteliala svar på EGF10. Våra data avslöjar att kapaciteten hos organoider att reagera på grunda EGF-gradienter uppstår från intercellulära kemiska kopplingar genom gap korsningar. Det antyder potentialen av organoider för mer exakt detektering av svaga och bullriga rumsligt graderade ingångar. Tillverknings processen kräver inte en renrum anläggning eller Photolithography tekniker. 3D PDMS-enheten innehåller dock nödvändiga faktorer för 3D-fysiologisk miljö. Denna metod kommer att vara till hjälp för att studera 3D cellulära beteenden och det har stor forskningspotential med olika cell typer, kemoattractants, och ECM kombinationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Allt djur arbete utfördes i enlighet med protokoll som granskats och godkänts av den institutionella djur omsorg och användning kommittén, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. tillverkning av mesofluidic enheten
- Designa masken av formen för PDMS enhet med hjälp av en 3D CAD-program.
- Skriv ut formen med Stereolitografi utrustning med en termisk resistent harts.
Obs: procedurerna som beskrivs här utfördes av en kommersiell 3D-utskriftstjänst. - Blanda grundligt en PDMS monomer lösning med härdnings medlet i en 10:1 ratio. 3 mL PDMS-blandning krävdes för tillverkning av anordningen. Den totala volymen beror på antalet formar som ska tillverkas.
- Degas blandningen genom att tillämpa ett vakuum med hjälp av en intern laboratorie vakuum eller vakuum pump i en vakuum tork apparat i 1 timme.
- Sandskädda ytan av mögel med en tejp för att ta bort damm, och häll sedan PDMS blandningen till mögel. Om bubblor införs i processen, upprepa avgasning i vakuumexsickatorn. Bubblor fångade mellan pelarna i formen kan avlägsnas genom att peta dem med en vass nål.
Anmärkning: avgasnings processen vid rums temperatur bör göras inom 1 timme eller mindre. - Bota PDMS genom upphettning på 80 ° c i 2 timmar. Låt mögel svalna i rums temperatur.
- Skär gränsen mellan mögel och PDMS med ett blad och sedan dra av PDMS från mögel noggrant.
- Trimma PDMS-delen så att den passar till täckglasen på 22 mm x 22 mm och slå ett hål vid inloppet.
Obs: protokollet kan pausas här. - Rengör PDMS-delen och 22 mm x 22 mm täckglasen genom att torka ytorna med låg ludd vävnad och 70% etanol. Ta sedan bort stora damm partiklar genom att badda med en tejp.
- Sterilisera PDMS delen och täckglasen genom antingen autoklavering (121 ° c i 8 minuter våt, 15 minuter torr) eller exponering för UV-ljus i 1 timme.
- Behandla botten ytan av PDMS delen och täckglasen med Corona urladdning pistol för 5 min i vävnaden kultur huva och sedan binda ihop dem.
Varning: Lägg alla icke-ledande material såsom polystyren skum på botten och ta bort alla ledande material under denna process. Injicera kollagen i enheten omedelbart, inom 5 minuter, efter behandlingen för att öka bindningen mellan kollagen gel och glas täckglasen.
2. cell beredning: primär bröst organoid isolering
Obs: detaljerna i bröst organoid isolering kan hittas i ett tidigare arbete11. Varje form av enstaka cell eller organoid kan förberedas enligt sina egna isolerings/avlossning protokoll.
- Finhacka bröst körtel vävnaden hos mössen med en skalpell tills vävnaden slappnar av och skaka den i 30 min vid 37 ° c i 50 mL kollagenas/trypsinlösning (10 mL per mus) i DEME/F12 kompletterad med 0,1 g trypsin, 0,1 g kollagenas , 5 mL FBS, 250 μL 1 μg/mL insulin och 50 μL 50 μg/mL gentamicin.
- Centrifugera kollagenas/trypsinlösningen vid 1 250 x g i 10 min. avlägsna supernatanten genom aspiration. Skingra cellerna i 10 mL DMEM/F12 och centrifugera vid 1 250 x g i 10 min. Efter att du tagit bort DMEM/F12 genom aspiration, Återsuspendera cellerna i 4 mL DMEM/F12 kompletterat med 40 μL DNase (2 enheter/μL).
- Skaka DNase-lösningen för hand för 2-5 min och centrifugera sedan på 1 250 x g i 10 min.
- Separera organoider från enstaka celler genom fyra differential centrifugationer (puls till 1 250 x g och stoppa centrifugen 3-4 s när den når den avsedda hastigheten). Mellan varje puls, aspirera supernatanten och omsuspendera pelleten i 10 mL DMEM/F12.
- Återsuspendera den sista pelleten i önskad mängd av DMEM/F12 med 1% penicillin/streptomycin och 1% insulin-transferrin-selen-X för beredning av kollagen.
3. beredning och injektion av kollagen
Obs: andra typer av ECM-geler kan förberedas enligt deras egna gelations protokoll.
- Förbered kollagen typ I lösning (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH lösning, normal odlings substrat på is.
Obs: Fortsätt på isen tills proceduren är avslutad. - Tillsätt 6 μL av 1 N NaOH-lösning, 200 μL odlings substrat och 50 μL 10x DMEM i ett förkylt mikrocentrifugerör och blanda lösningen noggrant.
- Tillsätt 425 μL kollagen i den förblandade lösningen och blanda grundligt med pipettering.
- Centrifugera kollagen blandningen kort (mindre än 5 sekunder) för att separera och avlägsna bubblor från blandningen.
- Håll den neutraliserade kollagen lösningen på is i 1 timme för att inducera fiber bildning.
- Tillsätt 50 μL cell SUS pension i kollagen blandningen och blanda noggrant.
Obs: den slutliga kollagen koncentrationen är 2 mg/mL. - Injicera lösningen med 200 μL Pipettera genom inloppet till PDMS-anordningen tills hela kammaren fylls i. Om kollagen blandningen svämmar över luckorna i pelarna, skära ut överskottet kollagen gel med vassa kirurgiska blad efter gelation.
- Förvara enheten i inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 under 1 timme för att inducera gelation.
- Fyll behållarna på båda sidor med odlings substrat och håll enheten i inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 tills konfokal avbildning utförs.
4.3D-avbildning och kvantifiering
- Installera en levande cell Imaging kultur kammare till en konfokal Mikroskop och förinställt temperaturen och CO2 till 37 ° c och 5%, respectively. För att få fukt upp, tillsätt vatten i reservoaren av kammaren och placera våtservetter i kammaren om det behövs.
- Placera PDMS-enheten i kammaren och Lägg till EGF i en av reservoaren som en "källa" för EGF i gradientbildningen. Den andra reservoaren kommer att tjäna en "diskbänk" som behövs för utveckling av den rumsligt graderade EGF-distributionen. 2,5 nM för EGF lades i diskhon för att göra lutningen på 0,5 nM/mm i denna studie.
- Ställ in omfånget av Z-stack som täcker volymen av organoider av intresse och starta Imaging.
Varning: för att undvika fototoxicitet, prova en lägre laser intensitet i konfokal Imaging eller använda multi-Photon Imaging tekniker. - Rekonstruera en 3D-bild från 2D-bildstackar med antingen kommersiell program vara eller ett skräddarsytt program. Mät längd och vinkel på grenar som sträcker sig från organoider eller migrering av enskilda celler. Här, utföra kvantifiering genom att rita en fri hands kontur runt organoid kroppen med ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF är en viktig regulator av förgrening morfogenes i bröst körtlar och en kritisk kemoattractant vägleda migration av bröst epitelceller i invasiv cancer tillväxt. Vi använde Mesoskopisk fluidiska anordningar som beskrivs ovan för att studera cellernas respons till definierade EGF-gradienter (figur 1a, B)10. Enheten ger ett kultur område som är 5 mm brett, 10 mm långt och 1 mm högt. Sidorna av kultur området avskiljs från öppna brunnar av sexkantiga pelare, som används för att fälla vätske ECM och cell blandningen inom cell kultur området till och med ytbehandlar spänning. Vi noterar att, med tanke på storleken på denna 3D-kultur, skulle det vara mycket svårt, dyrt, och tids krävande att konstruera en lämplig storlek mögel genom Photolithography10. Genom att använda en ny tillämpning av en standard teknik, stereolithography, vi snabbt och billigt producerade mögel. Genom att modifiera konstruktionen kan dessutom en exponentiell gradient (figur 1c, i) eller flera linjära gradienter i ett chip (figur 1c, II) induceras samt en stabil lutning med kontinuerligt flöde (figur 1c, III).
Både i silico (figur 2A, B, C) och in vitro (figur 2D, E, F) visade testerna en stabil linjär EGF-gradient över cell odlings området som varade i ungefär två dagar utan påfyllning av " och "Sink"-reservoarer. Den tids beroende spridningen av proteinerna simulerades med hjälp av en kommersialiserad multifysikprogramvara. Den 3D-geometri av kammar konfigurationen återskapades på program varan och den genomsnittliga koncentrationen inom kammar volymen bestämdes och plottas. Dessa resultat tydde på att EGF, ett 6,4 kDa-protein, kan bilda en stabil diffusions-baserad gradient inom kollagen gelen som förberetts enligt beskrivningen ovan under en relativt kort tids period. Vi bestämde också att liknande profiler av proteiner av 1, 10, och 150 kDa kunde bildas med hjälp av denna metod.
Bröstorganoider bildade flera grenar i närvaro av rumsligt enhetliga 2,5 nM EGF och gren bildningen visade ingen riktad bias över 3 dagar (figur 3a, D). Om EGF lades till i form av en linjär lutning på 0,5 nM/mm, visade dock gren bildningen en betydande riktnings avvikelse (figur 3B, E). Vi upptäckte dock ingen sådan bias för enstaka celler i samma lutning. För att avgöra om multicellulär kommunikation var nödvändig för lutning svar, undersökte vi om blockering intercellulära gap korsningar med olika hämmare skulle förhindra partiska gren bildning. Gapet korsningen hämmare faktiskt undertryckt förmågan hos organoider att reagera på lutningen (figur 3c, F). Som utforskas mer utförligt i den ursprungliga studien som beskriver denna metod10, detta resultat stöder hypotesen att kommunikationen genom gap korsningar är nödvändig för EGF gradient svar i bröst organoider10.
I figur 1. Mesofluidic enhet med definierad EGF gradient. (A) 3D-vy av PDMS-chip: (i) uppifrån och (II) framifrån av en form (enhet: mm) (III) en matris av formar (röd) fyllda med PDMS (transparent) (IV) PDMS kammare pilled av från mögel (v) ett Schematiskt diagram över en monterad anordning (vi) en verklig bild av anordningen fylla med kollagen gel och odlings substrat. (B) ett Schematiskt diagram över den mesofluidiska kammaren med organoider inbäddade i en kollagen gel och reservoarer med hög (röd) och låg (röd) EGF-koncentration som leder till EGF-lutningar (denna siffra har ändrats från10). C) potentiella konstruktioner för att framkalla en exponentiell gradient (i), fyra olika linjära lutningar i ett chip (II) och en stabil lutning med kontinuerligt flöde (III). Röda regioner anger källor eller sänkor fyllda med odlings substrat och grå regioner anger kammare fyllda med gel/celler blandning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 2. Utvärdering av ligand gradienter över chippet. (A) simulering av ligand koncentration över chip som visar gradientprofiler. Simulerade gradientprofiler av (B) 1 kDa-protein och (c) 70 kDa-protein. (D) bild av anordningen med en linjär lutning på 10 kDa dextran Blue används för att visualisera spridningen av EGF. Hexagonala prickade linjer indikerar pelare vid sidan av gel området. Experimentella gradientprofiler på 1, 10 och 150 kDa dextran över chip (denna siffra har ändrats från Ellison et al. 201610) (E) efter 8 timmar och (F) efter 48 timmar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
I figur 3. Cellulär respons på EGF-gradient. (A) icke-riktad förgrening av organoider i kollagen med en enhetlig 2,5 NM EGF. (B) riktad förgrening av organoider i kollagen med en linjär lutning på 0,5 nM/mm av EGF. C) icke-riktad förgrening av organoider i en linjär lutning på 0,5 nM/mm av EGF med en spalt blockerare. (D-F) Kantiga histogram av organoid förgrening riktningar som motsvarar (A)-(C) respektive. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillverkningen av PDMS formar utfördes med hjälp av en kommersiell 3D-utskrift tjänst, men kan också åstadkommas genom en hög 3D-skrivare i huset. Bland olika 3D-metoder för tillverkning, Stereolitografi rekommenderas för hög upplösning mögel generation. Eftersom PDMS härdning sker vid en hög temperatur (80 ° c), bör materialen vara tillräckligt termiskt resistenta, vilket bör specificeras explicit, om utskriften är outsourcad. En termisk post-Cure kan diskuteras med tryckeriet företag för att öka den termiska motståndet av delen. Detaljerna i tryckeriet och materialen specificeras i material tabellen.
Den mekaniska egenskapen hos botade PDMS beror på härdnings temperaturen. Om PDMS blandningen hålls i rums temperatur under en lång tid innan härdning i en ugn, blir det för elastisk även efter fullständig härdning. Således bör avgasnings processen vid rums temperatur göras inom 1 timme eller mindre. Avgasning hänvisar till en cyklisk tillämpning av vakuum som kan hjälpa till att avlägsna alla mikro-bubblor inom PDMS.
Kollagen lösningens pH är kritisk inte bara för gelation utan även för cellernas livs kraft. Om kollagen inte neutraliseras före blandning med celler, kommer cellernas livs kraft vara låg. Mängden 1 N NaOH lösning för neutralisering av kollagen blandningen beror på pH i den ursprungliga kollagen lösningen och det kan beräknas teoretiskt. Emellertid, det rekommenderas att lägga till NaOH lösningen på kollagen lösningen gradvis, kontrol lera pH avläsningar av mediet med fenol röd indikator eller med hjälp av pH-test band.
Avgasning gelen är viktigt under hela processen. Om bubblor bildas under gelation efter kollagen blandningen injiceras i enheten, kan de också avlägsnas genom att placera enheten på is i 10 min eller mer. Genom att släppa temperaturen minskar storleken på bubblor och håligheter så småningom upptas av gel blandningen. Samma metod kan användas när bubblor fastnar mellan pelarna efter tillsats av odlings substrat till reservoarerna.
Vi använde denna teknik för att skapa mesofluidic enheter som tillåter inbäddning av stora flercelliga konstruktioner i en fysiologiskt relevant extracellulär matris miljö och integrera den med definierade lutningar av tillväxtfaktorer och andra lösliga bioaktiva molekyler. Hög upplöst Stereolitografi tillät oss att producera högkvalitativa, låg kostnad formar. Tillverknings processen kräver inte renrum anläggningar eller Photolithography tekniker, och därmed möjliggör en enkel men effektiv generation av en 3D-miljö för cell kultur och experiment, som har flera fördelar jämfört med den traditionella 2D Experiment. Enheten som illustreras här har utformats för att ha en kultur yta på 5 mm bred, 10 mm lång och 1 mm hög. Det relativt stora kultur området med tjockare höjd tillåter tillväxt av mesoscopically stora organoider eller sfäroider, som varierar i storlek från tiotals till hundratals mikrometer. Det tillåter också analys av förgrenad epitelial morfogenes, och analys av kollektiv och enda cell migration i 3D-miljö. Sidorna på enheten är öppna brunnar som gör det möjligt att använda standard Pipetter för att byta media eller att lägga till droger utan att behöva komplicerade gränssnitt med vätske kontroll enheter, som vanligt vis används för mainstream mikroflödessystem enheter. Dessutom är den enkla konfigurationen av en PDMS-kammare och ett täckglas i botten universellt kompatibel med olika mikroskopiska system. Användningen av enheterna visade den vinklade förgrening riktning morfogenes i normal bröst vävnad, som svar på den påtvingade EGF gradient som ett representativt exempel för användning av anordningen. Emellertid, denna användning kan också utvidgas till olika vävnader, cell källor, chemoattractants, och droger för analys av cell/vävnad beteende i 3D. Användningen kan också utvidgas till att rymma mer realistiska vävnads modellering, som skulle rymma vaskulär nätverk formation från enskilda celler inom gelen tillsammans med inkorporering av andra cell typer, inklusive mesenkymala stromaceller och immun komponenter och olika epiteliala cell typer.
Även Stereolitografi erbjuder den finaste upplösningen bland 3D-utskriftstekniker, är den minsta funktions storleken fortfarande begränsad till flera tiotals mikrometer. Därför är detta protokoll inte tillräckligt för att ersätta fotolitografi i fabricera formar på en skala av flera mikrometer. En annan begränsning av detta protokoll är det relativt låga djupet av hög kvalitet avbildning i z-riktning jämfört med x-y riktning, vilket är en inneboende fråga om Imaging vävnad skala konstruktioner, med hjälp av konventionella mikroskopi. Men även med dessa begränsningar, den beskrivna metoden kan ge en kraftfull och flexibel analys plattform som är lätt att fabricera och använda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag till AJE (NSF PD-11-7246, bröst Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), och NCI U54 CA210173) och AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al.
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
