Summary
Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.
Abstract
2D hücre kültürü sistemlerinin çeşitli sınırlamaları, canlı dokuların uzamsal ve kimyasal karmaşıklığını daha iyi taklit eden ve in vivo doku fonksiyonlarını taklit etmek üzere 3D hücre kültürü ve analiz platformlarına ilgi uyandırdı. Mikrofabrikasyon teknolojilerinde son gelişmeler, hücrelerin iyi tanımlanmış bir ekstrasellüler matrisin (ECM) ve tanımlanan çözünür veya matris ilişkili biomolecules setine entegre edilebilir 3D in vitro ortamlarda gelişimini kolaylaştırmış. Ancak teknolojik engelleri araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlıdır. Burada, 3 boyutlu kültür ve hücre ile deney için basit cihazlar oluşturmak için bir yöntem tarif ve 3D mikro ortamlarda çok hücreli organoids tanımlı bir kemoçekici gradyan ile. Biz bu platformun epitelyal hücrelerin ve organoidlerin epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerinin degradelere tepkisini analiz etmek için kullanımını göstermektedir. EGF degradeler, meme organoidlerde yönlendirilmiş şube oluşumuna yol açan birkaç gün boyunca cihazlarda istikrarlı oldu. Bu analiz bize hücre grupları tarafından toplu degrade algılama daha hassas vs tek hücreler sonucuna izin verdi. Ayrıca fotolitografi tesisleri veya gelişmiş yumuşak litografi teknikleri gerektirmeyen imalat yöntemini de tarif ediyoruz. Bu yöntem, kanser dahil olmak üzere kalkınma ve patolojik devletlerin Analizi bağlamında 3D hücresel davranışları incelemek için yararlı olacaktır.
Introduction
Fizyolojik ortamda, hücreler, bir ekstrüle matrisine (ECM) gömülür ve bir bolluk biomolecules maruz kalır. Hücreler ve çevredeki mikroçevre arasındaki etkileşimler, göç, büyüme, farklılaşma ve hayatta kalma dahil olmak üzere farklı phenotypes kontrol hücre içi süreçleri düzenleyen1,2. Konvansiyonel 2D hücre kültüründe hücresel davranışlar hakkında çok şey öğrenildi. Ancak, 3D Hidrojeller gömülü hücreler ile intravital görüntüleme ve deneme gelişiyle, hücre davranışları önemli farklar Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürler vs 3D doku benzeri ortamlar tanınmıştır. Hücreler ECM lifleri ile etkileşime girirken ve 3D matriks içindeki mekanik özelliklerini hissederken, jelin malzeme sertliği 2D in vitro sistemde tam bağımsız bir değişken değildir. Ölçümlendirme, fokal yapışma oluşumunu değiştirir, farklı hücre morfolojisi ve davranışları ile sonuçlanır. Ayrıca, 2B yüzeydeki hücreler, 3B 'de tüm yönlere açık olan hücrelerden daha az sinyal verme ipuçları ortaya çıkar.
Bu sınırlamalar, yaşam dokularının uzamsal ve kimyasal karmaşıklığı temsil eden ve daha iyi in vivo doku fonksiyonları tahmin 3D sistemlerin çıkarlarını artmıştır. Bunlar, ECM3,4' te rasgele serpiştirilmiş hücrelere Self-montajı hücresel mikroyapıları olarak organoids birçok formda geliştirilmiştir. Microimalat teknolojileri son gelişmeler 3D kültür sistemleri5,6, 7,8,9 çeşitli türleri gelişlerini kolaylaştırmış fenotipik değişiklikler ve incelemek için çözünür sinyallere hücresel tepkiler; Ancak teknolojik bariyerler araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlandırmaktadır. Birçok durumda, imalat süreçleri fotolitografi teknikleri ve yumuşak litografi için arka plan bilgiler gerektirir. Dahası, bir cihaz inşa etmek ve uzun bir süre boyunca cihazın optimum fonksiyonunu elde etmek için çeşitli faktörler kontrol edilmelidir.
Yöntemimiz, hücreleri ve çok hücreli organoidleri tanımlanan kemoçekici degradelerle 3B mikro ortama birleştirmek ve ardından EGF10' a epitelyal yanıtları analiz etmek IÇIN 3B PDMS cihazının nasıl oluşturulacağını açıklar. Verilerimiz, yüzeysel EGF degradelere yanıt vermek için organoidlerin kapasitesinin, hücre içi kimyasal bağlamanın Gap kavşakla ortaya çıkması anlamına gelmiştir. Zayıf ve gürültülü uzamsal olarak dereceli girişlerin daha kesin tespiti için organoidlerin potansiyelini göstermektedir. İmalat süreci temiz oda tesisi veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihaz 3D fizyolojik çevre gerekli faktörleri içerir. Bu yöntem 3D hücresel davranışlarını incelemek için yararlı olacaktır ve farklı hücre tipleri, kemoçekiciler ve ECM kombinasyonları ile büyük bir araştırma potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanan protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. mezofluidik cihazın imalatı
- 3D CAD yazılımı kullanarak PDMS cihazı için kalıp maskesini Tasarla.
- Isıl dirençli reçine ile stereolitografi ekipmanlarını kullanarak kalıbı yazdırın.
Not: burada açıklanan prosedürler ticari 3B baskı hizmeti tarafından gerçekleştirilmiştir. - 10:1 oranında kür ajanı ile bir PDMS monomer çözümünü iyice karıştırın. Cihazın imalatı için 3 mL PDMS karışımı gereklidir. Toplam hacim imal edilecek kalıplar sayısına bağlıdır.
- 1 saat boyunca bir vakum kurutucu içinde bir in-house laboratuvar vakum veya vakum pompası kullanımı ile bir vakum uygulayarak karışımı Degas.
- Toz kaldırmak için yapışkan bir bant ile kalıp yüzeyini DAB ve sonra kalıp PDMS karışımı dökün. Baloncuklar işlemde tanıtılırsa, vakum kurutucu içinde tekrar gaz giderme. Küf sütunlar arasında sıkışmış kabarcıklar keskin bir iğne ile onları alay tarafından kaldırılabilir.
Not: oda sıcaklığında gaz giderme işlemi 1 saat veya daha az içinde yapılmalıdır. - 80 °C ' de 2 saat ısıtarak PDMS 'ye tedavi yapın. Kalıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
- Bir bıçak ile kalıp ve PDMS arasındaki sınırı keser ve sonra dikkatle kalıp PDMS soyulmak.
- PDMS parçasını 22 mm x 22 mm kaplaması sığdırmak için kırpın ve girişe bir delik takın.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. - Düşük tüy dokusu ve% 70 etanol ile yüzeyleri silerek PDMS parçası ve 22 mm x 22 mm lamel magazini temizleyin. Sonra yapışkan bir bant ile dabbing büyük toz parçacıkları çıkarın.
- PDMS parçasını ve lamel magazini 'ı otoklavlama (121 °c ' de 8 dakika ıslak, 15 dakika kuru) veya 1 saat boyunca UV ışığa maruz kalma ile sterilize edin.
- Doku kültürü kaputu içinde 5 dakika boyunca korona deşarj tabancası ile PDMS parçası ve kapak kayma alt yüzeyi tedavi ve sonra onları bir araya bağ.
DIKKAT: alt kısmında Polistiren köpük gibi herhangi bir iletken olmayan malzeme koymak ve bu süreçte tüm iletken malzemeleri çıkarın. Kollajen jel ve cam coverslip arasında bağ artırmak için tedavi sonra, 5 dakika içinde, hemen cihaza kollajen enjekte.
2. hücre hazırlığı: primer meme nevuslardır yalıtım
Not: meme nevuslardır yalıtım detayları önceki çalışma bulunabilir11. Her türlü tek hücreli veya nevuslardır kendi izolasyon/dekolmanı protokollerine göre hazırlanabilir.
- Doku rahatlatır ve 37 °c ' de 50 ml kolajenaz/tripsin çözeltisi (fare başına 10 ml) içinde 30 dakika için sallamak kadar bir neşter ile farelerin meme bezi dokusu Mince/F12, 0,1 g tripsin, 0,1 g kolajenaz ile tamamlayıcı , 5 mL FBS, 250 μL 1 μg/mL insülin ve 50 μL, 50 μg/mL gentaminisin.
- 10 dakika boyunca 1.250 x g 'de collagenase/tripsin çözeltisi Santrifüjü aspirasyon ile süpernatant çıkarın. Hücreleri 10 mL DMEM/F12 'de dağıtın ve 1.250 x g 'de santrifüjler 10 dk. Aspirasyon ile DMEM/F12 kaldırdıktan sonra, 4 mL DMEM/F12 ile 40 μL DNase (2 ünite/μL) ile tamamlayıcı hücreleri yeniden askıya alın.
- 2-5 dakika boyunca DNase çözümünü el ile sallayın ve ardından 10 dakika boyunca 1.250 x g 'de santrifüjün.
- Dört diferansiyel santrifüjleri ile tek hücrelerden ayrı organoidler (Nabız 1.250 x g ve santrifüj 3-4 s durdurmak amaçlanan hıza ulaştığında). Her nabız arasında, süpernatant Aspire ve dmem/F12 10 ml Pelet pelletini.
- 1% penisilin/streptomisin ve 1% insülin-transferrin-Selenium-X kollajen hazırlama için dmem/F12 büyüme orta istenilen miktarda son Pelet yeniden askıya.
3. kollajen hazırlama ve enjeksiyon
Not: diğer ECM jelleri kendi jelleşme protokollerine göre hazırlanabilir.
- Hazırlamak kollajen tipi ı çözüm (3,78 mg/mL), 10X DMEM, 1 N NaOH çözüm, buz üzerinde normal büyüme ortamı.
Not: prosedür tamamlanana kadar buzda tutun. - 6 μL 1 N NaOH çözeltisi, 200 μL büyüme orta ve 50 μL 10 DMEM önceden soğutulmuş mikrosantrifüjle tüp içine ekleyin ve çözümü iyice karıştırın.
- Önceden karışık çözüme 425 μL kollajen ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
- Kollajen karışımı kısa bir süre Santrifüjü (daha az 5 saniye) ayırmak ve karışımı kabarcıkları kaldırmak için.
- Lif oluşumunu teşvik etmek için 1 saat boyunca buz üzerinde nötralize kollajen çözeltisi tutun.
- Kollajen karışımı içine hücre süspansiyon 50 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
Not: son kollajen konsantrasyonu 2 mg/mL 'dir. - Tüm oda doldurulana kadar PDMS cihazının girişinde 200 μL pipet kullanarak çözüm enjekte edilir. Kollajen karışımı sütunların boşlukları üzerinden taşırsa, jelleşme sonra keskin cerrahi bıçak ile aşırı kollajen jel kesip.
- Cihazı 37 °C ' de,% 5 CO2 ile 1 saat boyunca kuluçkunda tutun.
- Her iki tarafın rezervuarlarını büyüme ortamına doldurun ve cihazı 37 °C ' de kuluçta tutun,% 5 CO2 ile Konfokal görüntüleme gerçekleştirilene kadar.
4.3B görüntüleme ve miktar
- Bir Konfokal mikroskop ve Pre-set sıcaklık ve CO2 Için 37 °c ve% 5, sırasıyla canlı hücre görüntüleme kültürü odası yükleyin. Nem almak için, odanın rezervuar su ekleyin ve gerekirse odaya ıslak mendiller yerleştirin.
- PDMS cihazını Odaya yerleştirin ve EGF 'i gradyan oluşumunda EGF 'in ' kaynak ' olarak bir rezervuar olarak ekleyin. Diğer rezervuar, uzamsal olarak dereceli EGF dağıtımının geliştirilmesi için gerekli olan bir ' lavabo ' hizmet verecektir. 2,5 Bu çalışmada 0,5 nM/mm gradyan yapmak için lavaboya EGF nM eklendi.
- İlgi organoids hacmi kapsayan Z-yığını aralığını ayarlayın ve görüntüleme başlar.
DIKKAT: fototoksisite önlemek Için, Konfokal görüntülemede daha düşük bir lazer yoğunluğu deneyin veya Multi-foton görüntüleme teknikleri kullanın. - Ticari yazılım veya özel yapılan bir program kullanarak 2B görüntü yığınlarından 3B görüntüyü yeniden oluşturun. Organoids veya bireysel hücrelerin göç uzanan dalları uzunluğunu ve açısını ölçmek. Burada, ımagej kullanarak orgoid gövdesinin etrafında bir serbest anahat çizerek miktar ölçümü gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF, meme bezlerinde morfojenin dallanma ve invaziv kanser büyümesinde memenin epitelyal hücrelerinin göçüne rehberlik eden kritik bir kemoçekicinin temel düzenleyicisidir. Yukarıda açıklanan mezoskopik fluidik cihazları, hücrelerin tanımlanabilen EGF degradeleri (Şekil 1a, B)10' a yanıtını incelemek için kullandık. Cihaz 5 mm genişliğinde, 10 mm uzunluğunda ve 1 mm boyunda bir kültür alanı verir. Kültür alanının kenarları, yüzey gerilimi ile hücre kültürü alanında sıvı ECM ve hücre karışımını yakalamak için kullanılan altıgen sütunlar tarafından açık kuyulardan ayrılır. Biz, bu 3D kültürün boyutu verilen, çok zor, pahalı ve zaman alıcı fotolitografi10tarafından uygun boyutta bir kalıp oluşturmak için olduğunu unutmayın. Standart bir teknik, stereolitografi, yeni bir uygulama kullanarak, hızlı ve ucuza kalıp üretti. Ayrıca, tasarımı değiştirerek, bir üstel gradyan (Şekil 1C, i) veya bir çipte birden çok doğrusal degradeler (Şekil 1C, II) indüklenmiş ve sürekli akış ile istikrarlı bir gradyan (Şekil 1C, iii) olabilir.
Hem silico (Şekil 2a, B, C) ve In vitro (Şekil 2D, E, F) testler, yaklaşık iki gün boyunca süren hücre kültürü alanında istikrarlı bir doğrusal EGF degradesi oluşumu gösterdi ' Kaynak ' ve ' lavabo ' rezervuar. Proteinlerin zaman bağımlı difüzyon ticizleştirilmiş bir Multiphysics yazılım kullanılarak simüle edildi. Oda konfigürasyonunun 3B geometrisi yazılım üzerinde yeniden oluşturuldu ve Oda hacmi içindeki ortalama konsantrasyon belirlendi ve çizilir. Bu sonuçlar, EGF, bir 6,4 kDa protein, nispeten kısa bir süre içinde yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan kollajen jel içinde istikrarlı bir difüzyon tabanlı degrade oluşturabilir önerdi. Ayrıca bu yöntem kullanılarak 1, 10 ve 150 kDa proteinlerinin benzer profillerinin oluşturulabileceğini tespit ettik.
Mammary organoids, mil EGF 2,5 ve şube oluşumu 3 gün (Şekil 3A, D) üzerinde yön önyargı gösterilmeyen, dağınık şekilde üniformalı bir yerde birden fazla şube oluşturdu. Ancak, EGF 0,5 nM/mm doğrusal gradyan şeklinde eklenirse, şube oluşumu önemli bir yönlü önyargı gösterilir (Şekil 3B, E). Ancak, aynı gradyan içinde tek hücreler için böyle bir önyargı tespit. Degrade tepkisi için çok hücreli iletişimin gerekli olup olmadığını belirlemek için, çeşitli inhibitörlerle hücre içi boşluk kavşağını engellemenin önyargılı şube oluşumunu önlediğini araştırdık. Gap kavşak inhibitörleri gerçekten organoidlerin gradyan yanıt yeteneğini bastırdı (Şekil 3c, F). Bu yöntem10' ı açıklayan orijinal çalışmada daha kapsamlı olarak keşfedildiğinden, bu sonuç, meme organoids10' da EGF gradyan tepkisi için Gap kavşaktaki iletişimin gerekli olduğu hipotezi destekler.
Şekil 1. Tanımlanmış EGF gradyan ile mesofluidik cihaz. (A) PDMS yongasının 3B görünümü: (i) üst görünüm ve (ii) bir kalıp (ünite: mm) ön görünümü (iii) PDMS (şeffaf) (iv) PDMS Chambers ile dolu bir dizi kalıp (kırmızı) (v) montajlı bir cihazın Şematik diyagramı (vi) cihazın dolgu gerçek bir resmi kollajen jel ve kültür orta ile Ed. (B) EGF degradeleri ile sonuçlanan bir kollajen jel ve yüksek (kırmızı) ve düşük (kırmızı) EGF konsantrasyonu rezervuar gömülü organoidler ile mezofluidik odanın Şematik diyagramı (Bu rakam10değiştirildi). (C) bir üstel gradyan (i), bir çipte dört farklı doğrusal gradyan (ii) ve sürekli akışlı istikrarlı degradeyi (iii) İndükleme için potansiyel tasarımlar. Kırmızı bölgeler, kültür orta ve gri bölgeler ile dolu kaynakları veya havuzlarını jel/hücreler karışımı ile dolu odaları gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. Çip boyunca ligand degradelerin değerlendirilmesi. (A) degrade profillerini gösteren çip genelinde ligand konsantrasyonunun simülasyonu. (B) 1 kDa protein ve (C) 70 kDa proteini simüle gradyan profilleri. (D) EGF difüzyonu görselleştirmek için kullanılan 10 kDa dextran Blue doğrusal gradyan ile cihazın görüntü. Altıgen noktalı çizgiler jel alanının tarafında sütunlar gösterir. Chip genelinde 1, 10 ve 150 kDa dekstran deneysel gradyan profilleri (Bu rakam Ellison ve al. 201610) (E) sonra 8 saat ve (F) sonra 48 saat güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3. EGF degradeye hücresel yanıt. (A) bir üniforma 2,5 ile kollajen organoids Yönsüz dallanma nm EGF. (B) egf 0,5 Nm/mm doğrusal gradyan ile kollajen organoidlerin yönlü dallanma. (C) Aralık kavşak engelleyici Ile 0,5 Nm/mm 'lik doğrusal degradeyle organoidlerin yönlü olmayan dallanma. (D-F) Sırasıyla (A)-(C) ' ye karşılık gelen nevuslardır dallanma yönlerinin açısal histogramları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDMS kalıpları imalat ticari bir 3D baskı hizmeti kullanılarak yapılmıştır, ama aynı zamanda yüksek uç 3D yazıcı-ev tarafından gerçekleştirilebilir. Çeşitli 3D imalat yöntemleri arasında, stereolitografi yüksek çözünürlüklü kalıp üretimi için tavsiye edilir. PDMS kür yüksek sıcaklıkta oluştukları için (80 °C), malzemelerin yeterli sıcaklığa dayanıklı olması, hangi açıkça belirtilmelidir, baskı dış kaynaklı ise. Bir termal Post-Cure parçanın termal direnci artırmak için baskı hizmeti şirketi ile tartışılabilir. Baskı hizmeti ve malzemelerin detayları malzeme tablosundabelirtilir.
Tedavi edilen PDMS 'nin mekanik özelliği kür sıcaklığına bağlıdır. PDMS karışımı bir fırında kür önce uzun süre oda sıcaklığında tutulur, tam kür sonra bile çok elastik olur. Böylece, oda sıcaklığında gaz giderme işlemi 1 saat veya daha az içinde yapılmalıdır. Gaz giderme PDMS içinde herhangi bir mikro kabarcıkları kaldırmak yardımcı olabilir vakum döngüsel bir uygulama anlamına gelir.
Kollajen çözeltisi pH sadece jelleşme için değil, aynı zamanda hücre viability için de önemlidir. Kollajen hücrelerle karıştırmadan önce nötralize değilse, hücre canlılığı düşük olacaktır. Kollajen karışımı nötralize etmek için 1 N NaOH çözeltisi miktarı orijinal kollajen çözeltisi pH bağlıdır ve teorik olarak hesaplanabilir. Ancak, bu kademeli olarak kollajen çözeltisi NaOH çözüm eklemek için tavsiye edilir, fenol kırmızı göstergesi veya pH test bantları kullanarak orta pH okumaları kontrol.
Jel gaz giderme tüm süreç boyunca önemlidir. Kollajen karışımı cihaza enjekte edildikten sonra jelleşme sırasında kabarcıklar formu varsa, onlar da 10 dakika veya daha fazla buz üzerinde cihaz yerleştirerek kaldırılabilir. Sıcaklığı düşürerek, kabarcıkların büyüklüğü azalır ve boşluklar sonunda jel karışımı tarafından işgal edilir. Aynı yöntem, balon rezervuarlara kültür orta ekledikten sonra sütunlar arasında sıkışıp kaldığınızda kullanılabilir.
Bu teknolojiyi, büyük multi-Cellular yapıların fizyolojik olarak ilgili bir hücre dışı matris ortamına katıştırmasına izin veren ve onu büyüme faktörlerinin tanımlanmış degradeleri ile entegre eden ve diğer çözünebilen biyoaktif moleküller. Yüksek çözünürlüklü stereolitografi bize yüksek kaliteli, düşük maliyetli kalıplar üretmemize izin verdi. İmalat süreci temiz oda tesisleri ve fotolitografi teknikleri gerektirmez, ve böylece hücre kültürü ve deneme için bir 3D ortamın basit ama etkili nesil sağlar, hangi vs geleneksel 2D birden fazla avantajı vardır Deneme. Burada gösterilen cihaz, 5 mm genişliğinde, 10 mm uzunluğunda ve 1 mm boyunda bir kültür alanına sahip olmak üzere tasarlanmıştır. Kalın yüksekliğe sahip nispeten büyük kültür alanı, onlarca ila yüzlerce mikrometre arasında değişen mesoscopically büyük organoidler veya küroidlerin büyümesine izin verir. Ayrıca dallı epitelyal morfojeninin analizine izin verir ve 3B ortamda toplu ve tek hücreli göç analizini sağlar. Cihazın kenarları, genellikle ana mikrofluidik cihazlar için kullanılan sıvı kontrol cihazları ile karmaşık arabirim gerek kalmadan medya değiştirmek veya ilaç eklemek için standart pipetlerin kullanımına izin açık kuyular vardır. Ayrıca, bir PDMS odasının basit konfigürasyonu ve altta bulunan bir kapak camı, çeşitli mikroskobik sistemlerle evrensel olarak uyumludur. Cihazların kullanımı normal meme dokusunda morfojenin önyargılı dallanma yönünü gösterdi, cihazın kullanımı için bir temsilci örnek olarak empoze EGF gradyan yanıt olarak. Ancak, bu kullanım aynı zamanda farklı dokulara Genişletilebilir, hücre kaynakları, kemoçekiciller, ve 3D hücre/doku davranışı analizi için ilaçlar. Kullanım aynı zamanda daha gerçekçi doku modelleme karşılamak için Genişletilebilir, hangi diğer hücre türlerinin birleşmesiyle birlikte jel içinde bireysel hücrelerden vasküler ağ oluşumu barındıracak, mezenkimal stromal ve bağışıklık bileşenleri dahil ve çeşitli epitelyal hücre türleri.
Stereolitografi 3D baskı teknikleri arasında en iyi çözünürlüğü sunar rağmen, Minimum özellik boyutu hala mikrometre birkaç onlarca sınırlıdır. Bu nedenle, bu protokol birkaç mikrometre ölçekte imalatı kalıpları fotolitografi değiştirmek için yeterli değildir. Bu protokolün bir başka sınırlaması, geleneksel mikroskobik kullanarak görüntüleme dokusu ölçekli yapıların doğal bir sorunu olan x-y yönüne kıyasla z yönünde nispeten düşük yüksek kalitede görüntüleme derinliğidir. Ancak, bu sınırlamalar bile, açıklanan Yöntem üretebilmek ve kullanmak kolay güçlü ve esnek bir analiz platformu sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, AJE 'ye hibe (NSF PD-11-7246, meme kanseri Araştırma Vakfı (BCRF-17-048) ve NCı U54 CA210173) ve AL (U54CA209992) tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al.
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E.
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
