Summary
Nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires. Ce dispositif permet l’analyse des réponses cellulaires aux signaux solubles dans les microenvironnements 3D avec des gradients chimioattractant définis. Les organoïdes sont meilleurs que les cellules simples à la détection des faibles entrées bruyantes.
Abstract
Diverses limitations des systèmes de culture cellulaire 2D ont suscité l’intérêt pour la culture cellulaire 3D et les plateformes d’analyse, qui imiteraient mieux la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et imitent les fonctions tissulaires in vivo. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité le développement d’environnements in vitro en 3D dans lesquels les cellules peuvent être intégrées dans une matrice extracellulaire bien définie (ECM) et un ensemble défini de biomolécules solubles ou matricielles associées. Cependant, les barrières technologiques ont limité leur utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Ici, nous décrivons une méthode pour construire des dispositifs simples pour la culture 3D et l’expérimentation avec des cellules et des organoïdes multicellulaires dans des microenvironnements 3D avec un gradient chimioattractant défini. Nous illustrons l’utilisation de cette plate-forme pour l’analyse de la réponse des cellules épithéliales et des organoïdes aux gradients de facteurs de croissance, tels que le facteur de croissance épidermique (EGF). Les gradients du FEM étaient stables dans les dispositifs pendant plusieurs jours conduisant à la formation dirigée des branches dans les organoïdes du sein. Cette analyse nous a permis de conclure que la détection de gradient collectif par groupes de cellules est plus sensible par rapport aux cellules individuelles. Nous décrivons également la méthode de fabrication, qui ne nécessite pas d’installations de photolithographie ni de techniques de lithographies douces avancées. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D dans le contexte de l’analyse du développement et des états pathologiques, y compris le cancer.
Introduction
Dans l’environnement physiologique, les cellules sont incorporées dans une matrice extracellulaire (ECM) et exposées à une pléthore de biomolécules. Les interactions entre les cellules et le microenvironnement environnant régulent les processus intracellulaires contrôlant divers phénotypes, y compris la migration, la croissance, la différenciation et la survie1,2. Beaucoup a été appris sur les comportements cellulaires dans une culture de cellules 2D conventionnelles. Cependant, avec l’avènement de l’imagerie intravitale et l’expérimentation de cellules incorporées dans des hydrogels 3D, des différences importantes dans les comportements cellulaires ont été reconnues dans les cultures 2D in vitro simplifiées par rapport aux environnements de tissus 3D. Alors que les cellules interagissent avec les fibres ECM et sentent leurs propriétés mécaniques dans la matrice 3D, la rigidité matérielle du gel n’est pas une variable totalement indépendante dans un système in vitro 2D. La dimensionnalité modifie la formation d’adhérence focale, ce qui entraîne une morphologie et un comportement différents des cellules. En outre, les cellules sur une surface 2D sont exposées à moins de signaux de signalisation que les cellules ouvertes à toutes les directions en 3D.
Ces limitations ont accru les intérêts pour les systèmes 3D qui représentent la complexité spatiale et chimique des tissus vivants et mieux prédire les fonctions tissulaires in vivo. Ils ont été développés sous de nombreuses formes à partir d’organoïdes comme microstructures cellulaires auto-assemblées à des cellules aléatoirement intercalées dans ECM3,4. Les progrès récents dans les technologies de microfabrication ont facilité l’avènement de différents types de systèmes de culture 3D5,6,7,8,9 pour l’étude des changements phénotypiques et réponses cellulaires aux signaux solubles; Cependant, les barrières technologiques limitent l’utilisation généralisée dans les laboratoires de recherche. Dans de nombreux cas, les procédés de fabrication exigent des techniques de photolithographie et des connaissances de fond pour la lithographie douce. En outre, divers facteurs doivent être contrôlés pour construire avec succès un dispositif et pour obtenir une fonction optimale de l’appareil sur une longue période de temps.
Notre méthode décrit comment construire un dispositif 3D de RPDB pour incorporer des cellules et des organoïdes multicellulaires dans un microenvironnement 3D avec des gradients chimioattractant définis, puis analyser les réponses épithéliales au FEM10. Nos données révèlent que la capacité des organoïdes à réagir aux gradients de l’EGF peu profonds découle du couplage chimique intercellulaire par des jonctions d’interstices. Il suggère le potentiel des organoïdes pour la détection plus précise des intrants faibles et bruyants spatialement classés. Le processus de fabrication ne nécessite pas d’installation de salle blanche ni de techniques de photolithographie. Cependant, le dispositif 3D de la PDA comprend les facteurs nécessaires de l’environnement physiologique 3D. Cette méthode sera utile pour étudier les comportements cellulaires 3D et il a un grand potentiel de recherche avec différents types de cellules, chimioattractants, et les combinaisons ECM.
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Protocol
Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux, Université Johns Hopkins, école de médecine.
1. fabrication du dispositif méofluidique
- Concevez le masque du moule pour le dispositif de PDA à l’aide d’un logiciel de CAO 3D.
- Imprimez le moule à l’aide d’un équipement de stéréolithographie avec une résine résistante à la chaleur.
Remarque: les procédures décrites ici ont été effectuées par un service commercial d’impression 3D. - Mélanger soigneusement une solution monomère de la RPDB avec l’agent de durcissement dans un ratio de 10:1. 3 mL de mélange de RPDB était nécessaire pour la fabrication de l’appareil. Le volume total dépend du nombre de moules à fabriquer.
- Dégazer le mélange en appliquant un aspirateur à l’aide d’un aspirateur de laboratoire interne ou d’une pompe à vide dans un dessiccateur à vide pendant 1 heure.
- Tamponnez la surface du moule avec un ruban adhésif pour enlever la poussière, puis versez le mélange de RPDB dans le moule. Si des bulles sont introduites dans le processus, répéter le dégazage dans le dessiccateur sous vide. Les bulles piégées entre les piliers du moule peuvent être enlevées en les faisant piquer avec une aiguille pointue.
Remarque: le processus de dégazage à température ambiante doit être effectué en moins d’une heure. - Guérir le RPDB en chauffant à 80 ° c pendant 2 heures. Laisser refroidir le moule à température ambiante.
- Coupez la limite entre le moule et le RPDB avec une lame, puis épluchez soigneusement le RPDB du moule.
- Coupez la partie de la RPDB pour qu’elle s’adapte à la lèvre de 22 mm x 22 mm et percez un trou à l’entrée.
Remarque: le protocole peut être suspendu ici. - Nettoyez la partie du RPDB et la bavette de 22 mm x 22 mm en essuyant les surfaces à l’aide de tissus à faible charpie et de 70% d’éthanol. Enlevez ensuite les grosses particules de poussière en tamponnant avec un ruban adhésif.
- Stériliser la partie de la RPDB et la lamelle soit par autoclavage (121 ° c pendant 8 minutes humides, 15 minutes sèches) ou par exposition à la lumière UV pendant 1 heure.
- Traitez la surface inférieure de la partie de la RPDB et le feuillet de recouvrement avec le pistolet de décharge corona pendant 5 min dans le capot de culture de tissu et puis les liant ensemble.
ATTENTION: posez tout matériau non conducteur tel que la mousse de polystyrène sur le fond et enlevez tous les matériaux de conduite pendant ce processus. Injecter du collagène dans l’appareil immédiatement, dans les 5 minutes, après le traitement pour augmenter la liaison entre le gel de collagène et la Coverslip de verre.
2. préparation des cellules: isolement mammaire primaire organoïde
NOTE: les détails de l’isolement mammaire organoïde peuvent être trouvés dans un travail précédent11. Tout type de cellule unique ou organoïde peut être préparé selon leurs propres protocoles d’isolement/détachement.
- Hachez le tissu de la glande mammaire des souris avec un scalpel jusqu’à ce que le tissu se détend et le secouer pendant 30 min à 37 ° c dans 50 mL de solution de collagénase/trypsine (10 mL par souris) dans DEME/F12 additionné de 0,1 g de trypsine, 0,1 g de collagénase , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL d’insuline et 50 μL de 50 μg/mL de gentamicine.
- Centrifuger la solution de collagénase/trypsine à 1 250 x g pendant 10 min. Enlever le surnageant par aspiration. Disperser les cellules dans 10 mL de DMEM/F12 et centrifuger à 1 250 x g pendant 10 min. Après avoir enlevé le DMEM/F12 par aspiration, Resuspendre les cellules dans 4 mL de DMEM/F12 supplémentés avec 40 μL de DNase (2 unités/μL).
- Agiter la solution DNase à la main pendant 2-5 min, puis centrifuger à 1 250 x g pendant 10 min.
- Séparer les organoïdes des cellules individuelles par quatre centrifugations différentielles (impulsion à 1 250 x g et arrêter la centrifugeuse 3-4 s après avoir atteint la vitesse prévue). Entre chaque impulsion, aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de DMEM/F12.
- Re-suspendre le culot final dans la quantité désirée de milieu de croissance de DMEM/F12 avec 1% de pénicilline/streptomycine et 1% d’insuline-transferrine-sélénium-X pour la préparation de collagène.
3. préparation et injection de collagène
Remarque: d’autres types de gels ECM peuvent être préparés selon leurs propres protocoles de gélification.
- Préparer la solution de collagène de type I (3,78 mg/mL), 10x DMEM, solution de NaOH 1 N, milieu de croissance normal sur glace.
Remarque: conserver sur la glace jusqu’à la fin de la procédure. - Ajouter 6 μL de solution de NaOH à 1 N, 200 μL de milieu de croissance et 50 μL de 10x DMEM dans un tube de microcentrifugation préréfrigérée et mélanger soigneusement la solution.
- Ajouter 425 μL de collagène dans la solution prémélangée et mélanger soigneusement par pipetage.
- Centrifugez brièvement le mélange de collagène (moins de 5 secondes) pour séparer et retirer les bulles du mélange.
- Maintenez la solution de collagène neutralisée sur la glace pendant 1 heure pour induire la formation de fibres.
- Ajouter 50 μL de suspension cellulaire dans le mélange de collagène et mélanger soigneusement.
NOTE: la concentration finale de collagène est de 2 mg/mL. - Injecter la solution à l’aide de 200 μL de pipettage à travers l’entrée du dispositif de RPDB jusqu’à ce que toute la chambre soit remplie. Si le mélange de collagène déborde dans les interstices des piliers, découpez l’excès de gel de collagène avec une lame chirurgicale pointue après gelation.
- Maintenir l’appareil dans l’incubateur à 37 ° c avec 5% de CO2 pendant 1 heure pour induire la gelation.
- Remplissez les réservoirs des deux côtés avec un milieu de croissance et conservez l’appareil dans l’incubateur à 37 ° c avec 5% de CO2 jusqu’à ce que l’imagerie confocale soit exécutée.
4. imagerie 3D et quantification
- Installer une chambre de culture d’imagerie à cellules vivantes sur un microscope confocale et prérégler la température et le CO2 à 37 ° c et 5%, respectivement. Pour obtenir de l’humidité, ajouter de l’eau dans le réservoir de la chambre et placer les lingettes humides dans la chambre si nécessaire.
- Placer le dispositif de la RPDB dans la chambre et ajouter le FEM à l’un des réservoirs en tant que «source» du FEM dans la formation de gradient. L’autre réservoir servira un «évier» nécessaire au développement de la distribution du FEM classée spatialement. 2,5 nM de FEM a été ajouté dans l’évier pour faire le gradient de 0,5 nM/mm dans cette étude.
- Définissez la plage de Z-Stack couvrant le volume des organoïdes d’intérêt et démarrez l’imagerie.
ATTENTION: pour éviter la phototoxicité, essayez une intensité laser plus faible en imagerie confocale ou utilisez des techniques d’imagerie multi-photons. - Reconstruire une image 3D à partir de piles d’images 2D en utilisant soit un logiciel commercial ou un programme sur mesure. Mesurez la longueur et l’angle des branches s’étendant des organoïdes ou la migration des cellules individuelles. Ici, effectuer la quantification en dessinant un contour à main levée autour du corps organoïde en utilisant ImageJ.
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Representative Results
Le FEM est un régulateur essentiel de la morphogenèse ramification dans les glandes mammaires et un chimioattractant critique guidant la migration des cellules épithéliales du sein dans la croissance invasive du cancer. Nous avons utilisé les dispositifs fluidiques mésoscopiques décrits ci-dessus pour étudier la réponse des cellules aux gradients de FEM définis (figure 1a, B)10. L’appareil produit une zone de culture de 5 mm de large, 10 mm de long et 1 mm de hauteur. Les côtés de la zone de culture sont séparés des puits ouverts par des piliers hexagonaux, qui sont utilisés pour piéger l’ECM liquide et le mélange de cellules dans la zone de culture cellulaire à travers la tension de surface. Nous notons que, compte tenu de la taille de cette culture 3D, il serait très difficile, coûteux et chronophage pour construire un moule de taille appropriée par photolithographie10. En utilisant une nouvelle application d’une technique standard, la stéréolithographie, nous avons rapidement et à peu de frais produit le moule. En outre, en modifiant la conception, un gradient exponentiel (figure 1c, i) ou plusieurs gradients linéaires dans une puce (figure 1c, II) peuvent être induits ainsi qu’un gradient stable avec écoulement continu (figure 1c, III).
Les essais in silico (figure 2a, B, C) et in vitro (figure 2D, E, F) ont démontré la formation d’un gradient d’EGF linéaire stable à travers la zone de culture cellulaire qui a duré environ deux jours sans reconstituer le « réservoirs «source» et «évier». La diffusion dépendante du temps des protéines a été simulée à l’aide d’un logiciel de multiphysique commercialisé. La géométrie 3D de la configuration de la chambre a été recréée sur le logiciel et la concentration moyenne dans le volume de la chambre a été déterminée et tracée. Ces résultats suggèrent que le FEM, une protéine de 6,4 kDa, peut former un gradient à base de diffusion stable dans le gel de collagène préparé comme décrit ci-dessus sur une période relativement courte. Nous avons également déterminé que des profils similaires de protéines de 1, 10 et 150 kDa pouvaient être formés à l’aide de cette méthode.
Les organoïdes mammaires ont formé plusieurs branches en présence d’un EGF de 2,5 nM dans l’espace et la formation de la branche n’a montré aucun biais directionnel sur 3 jours (figure 3A, D). Toutefois, si le FEM a été ajouté sous la forme d’un gradient linéaire de 0,5 nM/mm, la formation de branches affichait un biais directionnel significatif (figure 3b, E). Cependant, nous n’avons détecté aucun biais de ce type pour les cellules individuelles dans le même gradient. Afin de déterminer si la communication multicellulaire était nécessaire pour la réponse de gradient, nous avons exploré si le blocage des jonctions intercellulaires avec divers inhibiteurs empêcherait la formation de branche biaisée. Les inhibiteurs de jonction d’écart ont en effet supprimé la capacité des organoïdes de réagir au gradient (figure 3C, F). Comme on l’a exploré plus en détail dans l’étude originale décrivant cette méthode10, ce résultat confirme l’hypothèse que la communication par des jonctions d’interstices est nécessaire pour la réponse de gradient d’EGF dans les organoïdes mammaires10.
La figure 1. Périphérique méso-luidique avec gradient EGF défini. (A) vue 3D de la puce du PDA: (i) vue de dessus et (II) vue de face d’un moule (unité: mm) (III) un tableau de moules (rouge) remplis de RPDB (transparent) (IV) chambres de RPDB pillées du moule (v) schéma schématique d’un dispositif assemblé (VI) une image réelle du remplissage avec un gel de collagène et un milieu de culture. (B) un schéma schématique de la chambre méso-idique avec des organoïdes incorporés dans un gel de collagène et des réservoirs de concentration élevée (rouge) et faible (rouge) du FEM, entraînant des gradients du FEM (ce chiffre a été modifié à partir de10). (C) les conceptions potentielles pour induire un gradient exponentiel (i), quatre gradients linéaires différents dans une puce (II), et un gradient stable avec écoulement continu (III). Les régions rouges indiquent des sources ou des éviers remplis de milieu de culture et les régions grises indiquent les chambres remplies de mélange de gel/cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2. Évaluation des gradients de ligand à travers la puce. (A) simulation de la concentration du ligand sur la puce montrant des profils de gradient. Profils de gradient simulés de (B) protéine de 1 kDa et (C) protéine de 70 kDa. (D) image de l’appareil avec un gradient linéaire de 10 kDa dextran Blue utilisé pour visualiser la diffusion du FEM. Les lignes hexagonales en pointillés indiquent les piliers sur le côté de la zone de gel. Profils de gradient expérimentaux de 1, 10 et 150 kDa dextran à travers la puce (ce chiffre a été modifié à partir de Ellison et al. 201610) (E) après 8 heures et (F) après 48 heures. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 3. Réponse cellulaire au gradient EGF. (A) ramification non directionnelle d’organoïdes dans le collagène avec un FEM uniforme de 2,5 nm. (B) ramification directionnelle d’organoïdes dans le collagène avec un gradient linéaire de 0,5 nm/mm de FEM. C ramification non directionnelle d’organoïdes dans un gradient linéaire de 0,5 nm/mm de FEM avec un bloqueur de jonction d’interstice. (D-F) Histogrammes angulaires des directions de ramification organoïde correspondant à (A)-(C), respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La fabrication de moules de PDA a été réalisée à l’aide d’un service commercial d’impression 3D, mais peut également être réalisée par une imprimante 3D haut de gamme en interne. Parmi les différentes méthodes de fabrication 3D, la stéréolithographie est recommandée pour la génération de moules haute résolution. Étant donné que la polymérisation du RPDB se produit à une température élevée (80 ° c), les matériaux doivent être suffisamment résistants thermiquement, ce qui devrait être explicitement spécifié, si l’impression est externalisée. Un post-cure thermique peut être discuté avec la société de service d’impression pour augmenter la résistance thermique de la pièce. Les détails du service d’impression et des matériaux sont spécifiés dans le tableau des matériaux.
La propriété mécanique du RPDB guéri dépend de la température de durcissement. Si le mélange de RPDB est maintenu à température ambiante pendant une longue période avant de le guérir dans un four, il devient trop élastique même après le durcissement complet. Ainsi, le processus de dégazage à température ambiante doit être effectué en moins d’une heure. Le dégazage fait référence à une application cyclique de vide qui peut aider à éliminer les micro-bulles au sein de la MSPP.
Le pH de la solution de collagène est critique non seulement pour la gélification mais aussi pour la viabilité cellulaire. Si le collagène n’est pas neutralisé avant de mélanger avec les cellules, la viabilité de la cellule sera faible. La quantité de solution de NaOH 1 N pour neutraliser le mélange de collagène dépend du pH de la solution originale de collagène et peut être calculée théoriquement. Cependant, il est recommandé d’ajouter graduellement la solution de NaOH à la solution de collagène, en vérifiant les lectures de pH du milieu à l’aide d’un indicateur rouge de phénol ou en utilisant des bandes d’essai de pH.
Le dégazage du gel est important pendant tout le processus. Si des bulles se forment pendant la gélification après que le mélange de collagène est injecté dans l’appareil, ils peuvent être également enlevés en plaçant l’appareil sur la glace pendant 10 min ou plus. En diminuant la température, la taille des bulles diminue et les vides sont finalement occupés par le mélange de gel. La même méthode peut être utilisée lorsque des bulles sont piégées entre les piliers après avoir ajouté un milieu de culture aux réservoirs.
Nous avons utilisé cette technologie pour créer des dispositifs méso-idiques qui permettent l’incorporation de grandes constructions multicellulaires dans un environnement de matrice extracellulaire pertinent physiologiquement et l’intégrant avec des gradients définis de facteurs de croissance et d’autres molécules bioactives. La stéréolithographie haute résolution nous a permis de produire des moules de haute qualité et à faible coût. Le processus de fabrication ne nécessite pas les installations de salle blanche ni les techniques de photolithographie, et permet ainsi une génération simple mais efficace d’un environnement 3D pour la culture et l’expérimentation cellulaires, qui a de multiples avantages par rapport à la 2D traditionnelle Expérimentation. L’appareil illustré ici a été conçu pour avoir une zone de culture de 5 mm de large, 10 mm de long et 1 mm de hauteur. La zone de culture relativement grande avec une hauteur plus épaisse permet la croissance d’organoïdes ou de sphéroïdes de grande taille, allant de dizaines à des centaines de micromètres. Il permet également l’analyse de la morphogenèse épithéliale ramifiée, et l’analyse de la migration collective et unicellulaire dans l’environnement 3D. Les côtés de l’appareil sont des puits ouverts qui permettent l’utilisation de pipettes standard pour changer de média ou pour ajouter des médicaments sans avoir besoin d’interfaçage compliqué avec les dispositifs de contrôle du liquide, généralement utilisés pour les dispositifs microfluidiques courants. En outre, la configuration simple d’une chambre de RPDB et d’un verre de couverture au fond est universellement compatible avec divers systèmes microscopiques. L’utilisation des dispositifs a montré la direction de ramification biaisée de la morphogenèse dans le tissu mammaire normal, en réponse au gradient imposé d’EGF comme exemple représentatif pour l’utilisation de l’appareil. Cependant, cette utilisation peut également être étendue à différents tissus, sources cellulaires, chimioattractants, et médicaments pour l’analyse du comportement des cellules/tissus en 3D. L’utilisation peut également être prolongée pour accommoder la modélisation tissulaire plus réaliste, qui permettrait la formation de réseau vasculaire de cellules individuelles dans le gel ainsi que l’incorporation d’autres types de cellules, y compris les composants stromales et immunitaire méso-chymateuses et divers types de cellules épithéliales.
Bien que la stéréolithographie offre la meilleure résolution parmi les techniques d’impression 3D, la taille minimale de l’entité est encore limitée à plusieurs dizaines de micromètres. Par conséquent, ce protocole n’est pas suffisant pour remplacer la photolithographie dans la fabrication de moules à une échelle de plusieurs micromètres. Une autre limitation de ce protocole est la profondeur relativement faible de l’imagerie de haute qualité dans la direction z par rapport à la direction x-y, qui est un problème inhérent de l’imagerie des constructions à l’échelle tissulaire, en utilisant la microscopie conventionnelle. Cependant, même avec ces limitations, la méthode décrite peut fournir une plate-forme d’analyse puissante et flexible qui est facile à fabriquer et à utiliser.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par des subventions à l’AJE (NSF DP-11-7246, Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-17-048), et NCI U54 CA210173) et AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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