Summary
Мы описываем метод для построения устройств для 3D-культуры и экспериментов с клетками и многоклеточных органоидов. Это устройство позволяет анализировать клеточные реакции на растворимые сигналы в 3D микросредах с определенными хемоаттрактантом градиентами. Органоиды лучше, чем одиночные клетки при обнаружении слабых шумных входов.
Abstract
Различные ограничения систем 2D клеток культуры вызвали интерес к 3D клеток культуры и анализа платформ, которые лучше имитируют пространственную и химическую сложность живых тканей и имитировать в естественных условиях ткани функций. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали развитию 3D-среды в пробирке, в которой клетки могут быть интегрированы в четко определенную внеклеточной матрице (ЕСМ) и определенный набор растворимых или матричных связанных биомолекул. Однако технологические барьеры ограничивают их широкое применение в исследовательских лабораториях. Здесь мы описываем метод построения простых устройств для 3D-культуры и экспериментирования с клетками и многоклеточных органоидов в 3D микросредах с определенным градиентом хемоаттрактанта. Мы проиллюстрируем использование этой платформы для анализа реакции эпителиальных клеток и органоидов на градиенты факторов роста, таких как фактор эпидермального роста (EGF). Градиенты EGF были стабильными в устройствах в течение нескольких дней, что привело к созданию направленной ветви в органоиды молочной железы. Этот анализ позволил нам заключить, что коллективный градиент зондирования группами ячеек более чувствителен против одиночных ячеек. Мы также описываем метод изготовления, который не требует фотолитографии объектов, ни передовые методы мягкой литографии. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения в контексте анализа развития и патологических состояний, включая рак.
Introduction
В физиологических условиях, клетки встроены в внеклеточной матрицы (ЕСГ) и подвергается множество биомолекул. Взаимодействия между клетками и окружающей микросредой регулируют внутриклеточные процессы, контролирующие различные фенотипы, включая миграцию, рост, дифференциацию и выживание1,2. Многое было изучено о клеточных поведениях в обычной культуре 2D клеток. Однако, с появлением внутриклеточной визуализации и экспериментов с клетками, встроенными в 3D-гидрогели, важные различия в поведении клеток были признаны в упрощенном 2D в пробирке культур против 3D-ткани, как сред. В то время как клетки взаимодействуют с ПОМЕХОГЕНЕРАТОРАМИ и чувствуют их механические свойства в 3D матрице, жесткость материала геля не является полностью независимой переменной в системе 2D в пробирке. Размерность изменяет формирование фокусной адгезии, что приводит к разной морфологии клеток и поведению. Кроме того, ячейки на 2D поверхности подвержены меньшему сигналу сигнализации, чем ячейки, открытые для всех направлений в 3D.
Эти ограничения увеличили интересы для 3D-систем, которые представляют пространственную и химическую сложность живых тканей и лучше предсказать в естественных условиях ткани функции. Они были разработаны во многих формах от органоидов как самостоятельной сборки клеточных микроструктур для клеток случайным чередовались в ЕСГ3,4. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали появлению различных типов систем 3D-культуры5,6,7,8,9 для изучения фенотипических изменений и Сотовые ответы на растворимые сигналы; Однако технологические барьеры ограничивают широкое применение в исследовательских лабораториях. Во многих случаях процессы изготовления требуют методов фотолитографии и фоновых знаний для мягкой литографии. Кроме того, необходимо контролировать различные факторы, чтобы успешно построить устройство и достичь оптимальной функции устройства в течение длительного периода времени.
Наш метод описывает, как построить 3D PDF-устройство для включения клеток и многоклеточных органоидов в трехмерную микросреду с определенными градиентами хемоаттрактанта, а затем проанализировать эпителиальные реакции на EGF10. Наши данные свидетельствуют о том, что способность органоидов реагировать на мелкие градиенты EGF обусловлена межклеточной химической связью через узлы разрыва. В нем предлагается потенциал органоидов для более точного выявления слабых и шумных, территориально дифференцированных входов. Процесс изготовления не требует чистых помещений или техники фотолитографии. Тем не менее, 3D PDF устройство включает в себя необходимые факторы 3D-физиологической среды. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения и имеет большой исследовательский потенциал с различными типами клеток, хемоаттрактанты, и ЕСМ комбинаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работы были проведены в соответствии с протоколами рассмотрены и утверждены институционального ухода за животными и Комитета по эксплуатации, Университет Джонса Хопкинса, школа медицины.
1. Изготовление мезфлуидических устройств
- Дизайн маски прессформы для устройства PDF-файлов с использованием 3D CAD программного обеспечения.
- Печать формы с использованием стереолитографии оборудования с термической устойчивостью смолы.
Примечание: описанные здесь процедуры осуществлялись коммерческой службой 3D-печати. - Тщательно перемешать решение по мономера PDF с лечением агента в соотношении 10:1. для изготовления прибора требовалось 3 мл смеси PDF-файлов. Общий объем зависит от количества изготовленных форм.
- Дега смеси, применяя вакуум с использованием в доме лаборатории вакуума или вакуумного насоса в вакуумной сушки в течение 1 часа.
- Нанесите поверхность плесени клейкой лентой, чтобы удалить пыль, а затем вылейте смесь PDF-смеси в форму. Если пузырьки вводятся в процесс, повторите дегазации в вакуумной сушки. Пузырьки ловушке между колоннами формы могут быть удалены, тыкать их с острыми иглы.
Примечание: процесс дегазации при комнатной температуре должен быть сделан в течение 1 часа или меньше. - Вылечить PDF-файлы при нагревании при температуре 80 ° c в течение 2 часов. Дайте плесени остыть при комнатной температуре.
- Вырезать границу между плесенью и PDF-файлами с лезвием, а затем снимите PDF-файлы из формы тщательно.
- Обрезать часть PDF-файлы, чтобы соответствовать 22 мм х 22 мм комбинезон и пробить отверстие в входе.
Примечание: протокол может быть приостановлен здесь. - Очистите часть PDF-файлы и 22 мм х 22 мм комбинезон путем очистки поверхностей с низким содержанием волокна тканей и 70% этанола. Затем удалите большие частицы пыли, вытирая клейкой лентой.
- Стерилизовать PDF-часть и комбинезон либо аутоклюв (121 ° c в течение 8 минут мокрый, 15 минут сухой) или воздействия УФ-излучения в течение 1 часа.
- Лечить нижнюю поверхность части PDF-файлов и крышка скольжения с короной разряда пушки в течение 5 минут в ткани капот культуры, а затем связать их вместе.
Предосторежение: положите любой non-дирижируя материал как пена полистирола на дне и извлекайте все дирижируя материалы во время этого процесса. Впрыснуть коллаген в прибор немедленно, не познее 5 минут, после обработки для того чтобы увеличить скреплять между гелем коллагена и покрывным стеклом.
2. Приготовление клеток: первичная изолированность молочной оргаоида
Примечание: Подробная информация о изоляции молочной органоида можно найти в предыдущей работе11. Любой вид одиночной клетки или оргаоида можно подготовить согласно их собственному изоляции/протоколам отряда.
- Фарш молочной железы ткани мышей с скальпелем, пока ткань расслабляется и поколебать его в течение 30 минут при температуре 37 ° c в 50 мл коллагеназы/трипсина раствор (10 мл на мышь) в DEME/F12 дополнено 0,1 г трипсин, 0,1 г коллагеназы , 5 мл ФПС, 250 мкл 1 мкг/мл инсулина, и 50 мкл 50 мкг/мл гентатамин.
- Центрифуга раствор коллагеназы/трипсина на 1 250 x g в течение 10 мин. удалить супернатант по аспирации. Дисперсные ячейки в 10 мл ДМ/F12 и центрифуга на 1 250 x g в течение 10 мин. После удаления ДМЕМ/F12 путем аспирации, повторно приостановить ячейки в 4 мл ДМЕМ/F12 дополнено 40 мкл Дназы (2 единицы/мкл).
- Встряхните раствор дндаза вручную за 2-5 мин, а затем центрифугу на 1 250 x g в течение 10 мин.
- Отдельные органоиды из одиночных клеток через четыре дифференциальных центрифугирования (пульс 1 250 x g и остановить центрифугу 3-4 s после того, как он достигнет предполагаемой скорости). Между каждым пульсом, Асет супернатант и ресуспензируем гранулы в 10 мл ДМЕ/F12.
- Re-приостановить окончательный гранулы в нужное количество роста среды ДМ/F12 с 1% пенициллин/стрептомицин и 1% инсулина-трансферрин-селен-х для выработки коллагена.
3. Подготовка и инъекция коллагена
Примечание: другие типы гелей могут быть подготовлены в соответствии с их собственными протоколами Желирование.
- Приготовьте коллаген типа I (3,78 мг/мл), 10x ДМЭМ, 1 N NaOH раствор, нормальный рост среды на льду.
Примечание: Держите лед до завершения процедуры. - Добавьте 6 мкл 1 N NaOH раствор, 200 мкл роста среды и 50 мкл 10x ДМЭМ в предварительно охлажденной микроцентрифуге трубки и тщательно перемешать раствор.
- Добавить 425 мкл коллагена в предварительно смешанном растворе и тщательно перемешать, петтинг.
- Центрифуга смесь коллагена кратко (менее 5 секунд), чтобы отделить и удалить пузырьки из смеси.
- Держите нейтрализованного раствора коллагена на льду в течение 1 часа, чтобы побудить образование волокна.
- Добавить 50 мкл клеточной суспензии в смесь коллагена и тщательно перемешать.
Примечание: окончательная концентрация коллагена составляет 2 мг/мл. - Впрыснуть раствор с помощью 200 мкл пипетки через входе устройства PDF-файлов до тех пор, пока вся камера заполнена. Если коллагеновая смесь переливается через щели столбов, вырезать избыток коллагена гель с острым хирургическим лезвием после gelation.
- Держите устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO2 в течение 1 часа, чтобы вызвать gelation.
- Заполните резервуары с обеих сторон с ростом среды и держать устройство в инкубаторе при температуре 37 ° c с 5% CO2 до конфокальной визуализации выполняется.
4.3D визуализация и количественная оценка
- Установите живую клетку изображения культуры камеры в Конфокальный микроскоп и предварительно установить температуру и CO2 до 37 ° c и 5%, соответственно. Для того чтобы получить влажность вверх, добавьте воду в резервуаре камеры и положите влажные салфетки в камере если необходимо.
- Поместите устройство PDF-файлов в камеру и добавьте EGF в один из резервуаров в качестве «источника» EGF в формировании градиента. Другое водохранилище будет служить «раковине», необходимой для развития распределительного распределения по территориально-пространству. 2,5 Нм EGF был добавлен в раковину для изготовления градиента 0,5 Нм/mm в этом исследовании.
- Установите диапазон Z-стека, охватывающий объем органоидов, представляющих интерес, и запустите изображение.
Осторожно: чтобы избежать фототоксичности, попробуйте более низкую лазерную интенсивность в конфокальной визуализации или используйте методы мультифотонных изображений. - Реконструировать 3D-изображение из 2D-изображений, используя коммерческое программное обеспечение или программу, изготовную на заказ. Измерение длины и угла ветвей, простирающихся от органоидов или миграции отдельных клеток. Здесь, выполните квантификации, опираясь от руки контур вокруг органаид тела с помощью Iiiej.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF является важнейшим регулятором ветвления морфогенеза в молочных железах и критическим химиотерагоаттрактантом, направляющим миграцию эпителиальных клеток молочной железы при инвазивной опухоли. Мы использовали месоскопик устройства, описанные выше, для изучения реакции клеток на определенные градиенты EGF (рис. 1A, B)10. Устройство дает площадь культуры 5 мм шириной, 10 мм в длину и 1 мм высотой. Стороны области культуры отделены от открытых скважин шестиугольными колоннами, которые используются для улавливать жидкостную и клеточную смесь в пределах клеточной культуры через поверхностное натяжение. Мы отмечаем, что, учитывая размеры этой 3D-культуры, было бы очень трудно, дорого, и много времени, чтобы построить надлежащим образом размера плесень на фотолитографии10. С помощью нового применения стандартной методики, стереолитографии, мы быстро и недорого произвели прессформу. Кроме того, изменяя конструкцию, может быть вызван экспоненциальный градиент (Диаграмма 1C, i) или несколько линейных градиентов в чипе (Рисунок 1C, II), а также стабильный градиент с непрерывным потоком (Рисунок 1C, III).
И в кремнио (рис. 2A, B, C) и в пробирке (Диаграмма 2A, E, F) тесты продемонстрировали формирование стабильного линейного EGF градиента через область клеточной культуры, которая длилась около двух дней без пополнения ' источника ' и ' раковина ' водохранилищ. Время-зависимое диффузия белков моделируется с использованием коммерциализированной мультифизики программного обеспечения. 3D-геометрия камеры конфигурации была воссоздана на программное обеспечение и средняя концентрация в пределах камеры объем был определен и построены. Эти результаты предположили, что EGF, белок 6,4 kDa, может сформировать стабильный градиент на основе диффузии в Коллагеновый гель, подготовленный как описано выше, в течение относительно короткого периода времени. Мы также определили, что похожие профили белков 1, 10, и 150 kDa могут быть сформированы с помощью этого метода.
Молочные органоиды сформировали несколько ветвей в присутствии территориально равномерного 2,5 Нм EGF и формирование филиала не отображается направленного смещения в течение 3 дней (Рисунок 3A, D). Однако, если EGF был добавлен в виде линейного градиента 0,5 Нм/mm, формирование ветви отображается значительный направленный уклон (рисунок 3B, E). Тем не менее, мы не обнаружили такого смещения для одиночных ячеек в одном и том же градиенте. Для того, чтобы определить, если многоклеточной связи было необходимо для ответа градиента, мы исследовали, если блокирование межклеточных соединений разрыв с различными ингибиторами бы предотвратить предвзятое формирование филиала. Ингибиторы разрыва соединения действительно подавляли способность органоидов реагировать на градиент (Рисунок 3C, F). Как изучены более подробно в оригинальном исследовании, описывающем этот метод10, этот результат поддерживает гипотезу о том, что связь через разрыв соединений необходимо для реакции градиент EGF в молочной органоиды10.
На рисунке 1. Мезфлуидический прибор с определенным градиентом EGF. (A) 3D вид ЧИПА PDF-файлов: (i) вид сверху и (II) вид спереди прессформы (единица: mm) (III) массив форм (красный), НАПОЛНЕННЫЙ PDF-файлами (прозрачный) (IV) дммс камеры отпилили от плесени (v) схематическая схема собранного устройства (VI) реальную картину устройства заполнить ED с гелем коллагена и культуры среды. (B) схематическая схема мезфлуиевой камеры с органоидами, встроенными в Коллагеновый гель и резервуары высокой (красной) и низкой (красной) концентрации EGF, приводящее к ГРАДИЕНТАМ EGF (эта цифра была изменена с10). (C) потенциальные конструкции для индуцирования экспоненциального градиента (i), четырех различных линейных градиентов в чипе (II) и стабильного градиента с непрерывным потоком (III). Красные регионы указывают источники или раковины, наполненные культурой средних и серых зон, обозначают камеры, заполненные смесью геля/клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 2. Оценка лигаи градиентов через чип. (A) моделирование лигаи концентрации через чип, показывающий градиент профилей. Смоделированные градиентные профили (B) 1 kDa белка и (C) 70 kDa белка. (D) изображение устройства с линейным градиентом 10 кДа Декстрона синий используется для визуализации диффузии EGF. Гексагональные пунктирные линии обозначают столбы сбоку области геля. Экспериментальные градиентные профили 1, 10 и 150 kDa декна через чип (эта цифра была изменена с Эллисон et al. 201610) (E) после 8 часов и (F) после 48 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунке 3. Клеточный ответ на градиент EGF. (A) ненаправленного разветвления органоидов в коллагене с равномерным 2,5 Нм EGF. (B) направленное разветвление органоидов в коллагене с линейным градиентом 0,5 Нм/mm EGF. C) ненаправленного ветвления органоидов в линейном градиенте 0,5 Нм/mm EGF с блокировщиком узла разрыва. (D-F) Угловые гистограммы из оргадоидных ветвления направлений, соответствующих (а)-(с), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изготовление форм PDF-формы было выполнено с использованием коммерческой 3D-печати, но также может быть выполнена на высоком конце 3D принтера в доме. Среди различных 3D методы изготовления, стереолитографии рекомендуется для высокого разрешения поколения плесени. Поскольку лечение ипрс происходит при высокой температуре (80 ° с), материалы должны быть достаточно термически устойчивыми, что должно быть четко указано, если печать осуществляется на внешний подряд. Тепловой пост-лечение можно обсудить с компанией, полиграфической службы увеличить тепловое сопротивление части. Детали типографских услуг и материалов указаны в таблице материалов.
Механическое свойство вылечить PDF-файлы зависит от температуры отверждения. Если смесь PDF-файлов хранится при комнатной температуре в течение длительного времени, прежде чем лечить в духовке, она становится слишком упругой даже после полного отверждения. Таким образом, процесс дегазации при комнатной температуре должен быть сделан в течение 1 часа или менее. Дегазация ссылается на циклическое применение вакуума, который может помочь удалить любые микро-пузыри в рамках ПРМ.
РН раствора коллагена имеет решающее значение не только для гелляции, но и для жизнеспособности клеток. Если коллаген не нейтрализован перед смешиванием с клетками, жизнеспособность ячейки будет низкой. Количество 1 N NaOH решение для нейтрализации коллагена смеси зависит от рН исходного раствора коллагена и он может быть вычислен теоретически. Тем не менее, рекомендуется добавлять раствор NaOH к коллагеновым раствором постепенно, проверяя показания рН среды с помощью индикатора фенола красный или с помощью рН Тестирование ленты.
Дегазации гель имеет важное значение на протяжении всего процесса. Если пузыри образуются во время гелации после того, как коллагеновая смесь вводится в устройство, они могут быть также удалены, поместив устройство на лед в течение 10 минут или более. При понижая температуру, размер пузырьков уменьшается и пустоты в конечном итоге занимают гель смеси. Тот же метод может быть использован, когда пузырьки оказались в ловушке между колоннами после добавления культуры среды в резервуары.
Мы использовали эту технологию, чтобы создавать мезфлуидические устройства, которые позволяют встраивать крупные мульти-клеточные конструкции в физиологически соответствующую межклеточной матричной среде и интегрировать ее с определенными градиентами факторов роста и других растворимых биоактивными молекулами. Стереолитография с высоким разрешением позволила нам производить высококачественные, Недорогие формы. Процесс изготовления не требует установки чистых помещений, ни техники фотолитографии, и таким образом позволяет простое, но эффективное поколение 3D-среды для клеточной культуры и экспериментов, которая имеет несколько преимуществ против традиционного 2D Экспериментов. Устройство, иллюстрированное здесь, было спроектировано так, чтобы иметь зону культуры шириной 5 мм, длину 10 мм и высоту 1 мм. Относительно большая зона культуры с более толстой высотой позволяет рост мезоскопически больших органоидов или сфероидов, размером от десятков до сотен микрометров. Он также допускает анализ разветвленных эпителиальных морфогенеза и анализ миграции коллективных и одиночных клеток в 3D-среде. Стороны устройства открытые скважины, которые позволяют использовать стандартные пипетки для изменения средств массовой информации или добавлять наркотики без необходимости сложного взаимодействия с жидкими устройствами управления, как правило, используется для основных микрофлюидных устройств. Кроме того, простая конфигурация камеры PDF-файлов и крышки стекла внизу универсально совместимы с разнообразными микроскопическими системами. Использование устройств показало предвзятое направление ответвления морфогенеза в нормальной ткани молочной железы, в ответ на введенные EGF градиент в качестве репрезентативного примера для использования устройства. Однако, это использование также может быть распространено на различные ткани, источники клеток, хемоаттрактанты, и препараты для анализа поведения клеток/тканей в 3D. Использование также может быть расширен для размещения более реалистичного моделирования ткани, которая будет разместить формирование сосудистой сети из отдельных клеток в гель наряду с включением других типов клеток, в том числе Мезенхимальные стромальные и иммунных компонентов и разнообразных типов эпителиальных клеток.
Хотя стереолитография предлагает лучшее разрешение среди методов 3D печати, минимальный размер объекта по-прежнему ограничен несколькими десятками микрометров. Таким образом, этот протокол не является достаточным для замены фотолитографии в изготовлении пресс-форм в масштабе нескольких микрометров. Еще одним ограничением этого протокола является относительно низкая глубина высокого качества изображения в направлении z по сравнению с x-y направлении, что является неотъемлемым вопросом визуализации ткани масштаба конструкций, с использованием обычной микроскопии. Однако, даже с этими ограничениями, описанный метод может обеспечить мощную и гибкую платформу анализа, которую легко изготовить и использовать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами АДС (НДП-11-7246, Фонд исследований рака молочной железы (БОФД-17-048) и НИР U54 CA210173) и AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
