Summary
Traditionelle cDNA-baserede overekspression teknikker har en begrænset anvendelighed for overekspression af lange noncoding RNA'er på grund af deres flere splice formularer med potentielle funktionalitet. Denne revision rapporterer en protokol, ved hjælp af CRISPR teknologi til overexpress flere splice varianter af en længe noncoding RNA.
Abstract
Længe noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nyt og spændende forskningsfelt, med antallet af publikationer fra feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse undersøgelser har bekræftet, at lncRNAs er ændret i næsten alle sygdomme. Men at studere de funktionelle roller for lncRNAs i forbindelse med sygdom fortsat vanskelig på grund af den manglende proteinprodukter, væv-specifikke udtryk, lavt udtryk niveauer, kompleksiteten i splice former, og af bevarelse blandt arter. Givet den artsspecifikke udtryk, er lncRNA undersøgelser ofte begrænset til menneskelige forskning sammenhænge når man studerer sygdomsprocesser. Da lncRNAs funktion på molekylært niveau, er en måde at dissekere lncRNA biologi enten fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og foranstaltning cellulære virkningerne. I denne artikel præsenteres en skriftlig og visualiseret protokol til overexpress lncRNAs in vitro. Som en repræsentant eksperiment, er en lncRNA, der er associeret med inflammatorisk tarmsygdom, Interferon Gamma antisensstoffer 1 (IFNG-AS1), vist sig at være overexpressed i en Jurkat T-celle model. For at opnå dette, bruges den aktiverende grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) teknik til at aktivere overekspression på de endogene genomisk loci. Den aktiverende CRISPR teknik mål et sæt af transkriptionsfaktorer til webstedet transcriptional start af et gen, muliggør en robust overekspression af flere lncRNA splice formularer. Denne procedure vil blive opdelt i tre trin, nemlig a guide RNA (gRNA) design og vektor konstruktion, (ii) virus generation og transduktion, og (iii) koloni screening for overekspression. For denne repræsentant eksperiment, en større end 20-fold forbedring i IFNG-AS1 i Jurkat T-celler blev observeret.
Introduction
Mens mest biomedicinsk forskning har fokuseret på protein-kodning afskrifter, består fleste af transskriberede gener faktisk af noncoding RNA'er (Ensembl release 93). Aktuel forskning er begyndt at udforske dette område med antallet af publikationer om lncRNAs i sygdomsprocesser stiger eksponentielt mellem 2007 og 20171. Disse publikationer viser, at mange lncRNAs er forbundet med sygdommen. De molekylære mekanismer af disse lncRNAs er dog svært at studere på grund af deres forskellige funktioner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med oplysninger om betydningen af lncRNAs i sygdom, udtrykkes lncRNAs ofte på et lavere niveau end kodning RNA'er2. Derudover er lncRNAs dårligt bevaret, hvilket begrænser de funktionelle undersøgelser i human-celle-linje-baserede teknikker3. En metode til at studere mekanismen i disse roman gener er at endogent overexpress dem i kulturperler celler. Overekspression undersøgelser kan indeholde vigtige oplysninger om funktionen af specifikke gener og aktiverer forskere at dissekere centrale molekylære veje.
En ny metode til at aktivere omskrivning af lncRNA gener er baseret på CRISPR teknologi udviklet i starten af Gersbach laboratorium4. Denne protokol er blevet tilpasset til brug i lncRNA biologi og til udtryk for disse gener i andre modelsystemer. I CRISPR overekspression teknik, kan et protein kaldet CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) være rettet mod en DNA sekvens via en antisense gRNA, der genkendes af Cas9. Normalt, vil Cas9 fremkalde DNA kavalergang; men mutationer i Cas9, tidligere udviklet til overekspression teknik, deaktivere dette trin5. Når en transcriptional aktivator er sammenvoksede til en "død" Cas9 (dCas9) og transduced i cellelinjer, den endogene overekspression af lncRNAs kan være opnåede4,6. Tilføjelse af yderligere ændringer til gRNA, muliggør yderligere transcriptional faktorer til at binde til gRNA, øget effektivitet af dCas9 gen aktivisering ordning 10-fold7. Vigtigere, blev det påvist, at transcriptional aktivering kræver nærhed (< 200 bp) at det transkriptionel starte site gener, gør det muligt for en specifik Opregulering i gen-rige områder7. I modsætning til CRISPR knockout teknologier skal dCas9 og gRNA kassetter integreres i genom til cellerne til at bevare en overekspression over flere generationer. En metode til at opnå dette er at bruge lentiviruses til at integrere der indeholder dCas9 og gRNA kassetter. Efter integrationen, kan lncRNA Gen-ekspression bestemmes.
I denne artikel, vil blive demonstreret en protokol for lncRNA overekspression i en Jurkat T-celle model. En trinvis procedure er vist og kan også tilpasses vedhængende celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol bruger replikation-mangelfuld lentiviruses. Udføre viral håndtering kun efter passende lab sikkerhedsuddannelse. Bleach alle genstande og overflader, der kommer i kontakt med levende vira i mindst 10 min efter håndtering. Brug en engangs lab coat og ansigt/øjne beskyttelse, samt dobbelt handsker på alle tidspunkter. Udføre virus arbejde i biosikkerhed niveau 2 + labs med viral certificering. Dedikere vævskultur hætter og inkubatorer til viral arbejde.
1. vektor Design og Generation
Bemærk: Den bedste måde at identificere gRNA sekvenser er at bruge online designværktøjer (f.eks. http://crispr-era.stanford.edu) (supplerende figur 1: gRNA design). For den ledsagende repræsentative eksperiment, et selskab designet og skabt gRNA vektorer bruges i de repræsentative eksperiment. DCas9 plasmid blev også købt online.
- GRNA sekvens er beliggende opstrøms af nucleotidsekvensen "NGG", hvor "N" er enhver nukleotid, som også er inden for 100 basepar af transcriptional startsted. Søg genetiske databaser såsom BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) for gRNA sekvens, at sørge for der er ingen andre steder i genomet med lignende sekvenser (supplerende figur 2: BLAT). Dette vil sikre, at gRNA sekvens er unikke for gen af interesse (GOI).
- Gemme de gRNA og dCas9 plasmider, som kommer som bakteriel stubbe, ved 4 ° C. Streak ud Escherichia coli på en Luria bouillon (LB) agar plade med ampicillin (supplerende tabel 1) og vokse bakterier natten over ved 37 ° C.
- Vælge en koloni og vokse bakterier i 5 mL af LB med ampicillin (supplerende tabel 1) natten over, energisk ryster pladen i et 37 ° C inkubator. Den næste dag, tilsættes 2 mL af bakterier til 200 mL af LB med ampicillin vokse i en 2 L målekolbe, energisk ryste kolben natten over i et 37 ° C inkubator.
- Spin ned bakterier ved 3,724 x g i 20 min. Fjern medierne og sted rør indeholdende bakterier på is.
-
Rense bakteriel DNA ved hjælp af et plasmid rensning kit per producentens protokol.
Bemærk: plasmid rensning Materialepakkerne indeholder proprietære resuspension buffer, lysisbuffer, wash buffer, ækvilibrering buffer og eluering buffer.- Tilsættes 10 mL af resuspension buffer fra kit til bakterier og afpipetteres bakterier i løsning. Derefter tilsættes 10 mL af lysisbuffer fra kit til de resuspenderede bakterier og bland dem ved at vende røret. Vent 5 min. for at lyse bakterier; derefter tilsættes 10 mL iskold neutralisering buffer fra kit for lysed bakterier og bland dem ved at vende røret.
- Blandingen henstår kolonnen DNA fra kit med 10 mL af ækvilibrering buffer i 5 min. Hæld prøver til DNA kolonnen filtreres og lad opløsningen passerer gennem filteret.
- Vaske prøver 2 x med 30 mL vaske buffer og derefter elueres DNA med 30 mL eluering buffer i en 15 mL konisk slange. Langsomt lag 10,5 mL isopropanol ved stuetemperatur på de eluted DNA, vend røret og straks spinde det ved 16.200 x g i 30 min. ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten og tilsæt 1 mL af 70% ethanol til DNA pellet. Resuspenderes ved at bladre til røret. Spinde det ved 16.200 x g i 10 min. ved 4 ° C, og bruge en 200 μl afpipetteres tip til at fjerne det meste af ethanol. Resuspend det i 200 μl vand lufttørre pellet i 5 min, og gemme DNA ved-20 ° C. Den forventede koncentration vil være > 1 μg/μL.
2. virus Generation og partikel Count
- Når du er klar til at oprette dCAS9-holdige lentivirus, pels 100 mm vævskultur retter med 5 mL 0,01% poly-L-lysin (supplerende tabel 1). Fjern den overskydende væske grundigt fra pladerne og lad dem lufttørre i et par minutter i en biosikkerhed kabinet.
- Plade 5 x 106 HEK 293T celler pr. parabol i 10 mL af komplet Dulbecco ændret Eagle's medium (DMEM) (supplerende tabel 1) og inkuberes dem natten over ved 37 ° C med 5% CO2. Den næste dag, fjerne medium fra HEK 293T retter og der tilsættes 10 mL af komplet DMEM.
- Mix 6.5 μg af plasmidet pMDLg/pRRE indeholdende gag/pol (komponenter af virus), 3,5 μg af plasmidet pMDG2.G indeholdende VSV-G (en komponent i virussen), 2,5 µg af plasmidet pRSV-Rev indeholdende Rev (en komponent i virussen), 10 μg af en længe terminal Gentag ( LTR)-indeholdende gRNA vektor eller en LTR-holdige dCas9 vektor og tilsæt vand til en samlet maengde paa 450 μL. Blandingen filtreres gennem en 0,2 µm filter tip knyttet til en sprøjte.
- Tilsæt 50 µL af 2,5 M CaCl2 (supplerende tabel 1) hver Transfektion prøve af DNA og bland forsigtigt. Calcium/DNA blandingen filtreres gennem en 0,2 µm filter tip knyttet til en sprøjte. Med pipette overfoeres 500 µL af 2 x HBS (supplerende tabel 1) ind i et 5 mL polystyren rør. Tilsæt 500 µL DNA/CaCl2 mix dråbevis og forsigtigt vortex. Inkuber ved stuetemperatur i 3 min.
- Langsomt tilsættes 1 mL af DNA/CaCl2/HBS suspension til hvert fad. Straks swirl retter for at distribuere indholdet jævnt. Inkuber hvert fad natten over i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- På dag 3, langsomt Fjern og kassér medier fra retterne. Forsigtigt vaske cellerne 1 x med fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Tilføj 6 mL af komplet DMEM suppleret med 20 mM HEPES og 10 mM natrium butyrat. Inkuber celler i 5-6 timer i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Vaske cellerne 1 x med PBS og tilsættes 5 mL af komplet DMEM med 20 mM HEPES til HEK 293T celler. Inkuber i 12 timer natten over i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Dag 4, indsamle HEK 293T celle analysere og filtrere supernatanten. Fryse 1 mL alikvoter ved-80 ° C.
- Når du er klar til at bruge virussen, tø en alikvot af viral partiklen der indeholder konditioneret medier (gemt som beskrevet i trin 2.8) på is. Bringe alle reagenser til stuetemperatur.
-
Brug en p24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit til at kvantificere antallet af viruspartikler pr. milliliter.
- Fortynd wash koncentrat fra sættet ved at tilføje 19 dele destilleret deioniseret vand. Fortynd den positive kontrol fra kit til 200 ng/mL, ved hjælp af RMPI 1640 som fortyndingsmiddel, og gøre fortyndinger til standardkurven i 1,5 mL rør efter p24 ELISA fortynding tabel (supplerende tabel 2).
- Tilsæt 20 μL af 5% Triton X-100 i alle pladens huller, undtagen substrat tom. Tilføje 200 μl af RPMI 1640 negativ kontrol brønde. Tilføje 200 μl af hver standard (i duplikat) til de udpegede brønde.
- Bruger et spektrofotometer, mål koncentrationen af virus i prøver, ved hjælp af en standardkurve. Start prøveopløsning på 1:1,000 og ændre en diskenhed som nødvendigt for at være inden for rækkevidde af standardkurven. Fortynd prøver med Triton X-100 til en endelig koncentration på 0,5% og tilføje 200 μl af hver prøve i RPMI 1640 udpegede brønde. Forsegle pladen og der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
- Vaske plade 6 x med 300 μL 1 x vaskebuffer pr. brønd. Fjern eventuelle overskydende væske ved at invertere pladen og trykke det på et stykke køkkenrulle. Tilsæt 100 μL af detektor antistof fra kit i alle pladens huller, undtagen substrat tom. Forsegle pladen og Inkuber i 1 time ved 37 ° C. Vaske pladen, og fjern derefter eventuelle overskydende væske ved at invertere pladen og trykke det på et stykke køkkenrulle.
- For at måle detektor-antistof, forberede streptavidin-peberrodsperoxidase (SA-HRP) indenfor 15 min af brug. Fortynd SA-HRP på 1: 100 med SA-HRP fortyndingsmiddel. Bland den fortyndede SA-HRP grundigt og tilsættes 100 μl i alle pladens huller, undtagen tom. Forsegle og Ruger på pladen i 30 min ved stuetemperatur.
- Vaske plade med 1 x vaskebuffer og tryk væk overskydende væske som i trin 2.10.4. Bruge ortho-phenylendiamin (OPD) substratopløsning, som indeholder peroxidase de nødvendige substrater for at producere kemiluminescens, indenfor 15 min forberedelse. Bruge en OPD tablet til 11 mL af substratet fortyndingsmiddel for hver plade.
- Vortex OPD løsning energisk at opløse det helt og beskytter den mod lyset. Tilsæt 100 μL af OPD substratopløsning alle brønde, herunder tom. Bruger et spektrofotometer, læse absorbans ved 450 nm straks, Gentag denne 10 x 1 s mellemrum, og tage den gennemsnitlige måling.
3. dCas9 -VP64 transduktion
- Kultur Jurkat T-celler i komplet DMEM i en T75 kolben med en massefylde på 2 x 106 celler i 15 mL af medier. Kultur cellerne i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
- Spin ned celler i 5 min på 233 x g , og derefter, resuspend dem i 10 mL af reducerede serum medier. Tælle celler med en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
- Resuspend og plade 1 x 106 Jurkat celler i 5 mL af reducerede serum media med polybrene (supplerende tabel 1) i en T75 kolbe. Tilføje HEK 293T-aircondition medier indeholdende 1 x 106 dCas9-holdige viruspartikler. Antallet af virale partikler kan beregnes ca fra p24 ELISA fordi 1 μg/mL p24 er lig med 1 x 107 virale partikler. Sætte kolberne i 37 ° C kuvøse med 5% CO2.
4. udvælgelse og klon skabelse
- Tre dage efter infektionen, spin ned celler ved 233 x g i 5 min og resuspend dem i 10 mL af komplet DMEM med puromycin (supplerende tabel 1). Plade celler i T75 kolber og kultur dem ved 37 ° C med 5% CO2. Hver tredje dag, for en periode på 9 dage, spin ned celler ved 233 x g i 5 min og erstatte medierne med komplet DMEM med puromycin.
- Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter. På en 96-brønd plade behandlet med vævskultur, plade 10.000 celler i 100 μL af komplet DMEM med puromycin i først godt og seriefremstillede fortyndes 1:1 indholdet af følgende brøndene med komplet DMEM med puromycin. Udføre 24 fortyndinger og Gentag denne 4 x pr. plade for at sikre, at der er et tilstrækkeligt antal celler pr. brønd. Inkuber celler ved 37 ° C med 5% CO2.
- Udvid klonede celler i to 24-godt plader, så ind i en 6-godt plade, og til sidst i en kolbe på T75. For at fokusere på tre af kloner, plade 2 x 106 celler pr. brønd af et 6-godt plade for tre af kloner. Plade, de tre andre brønde med nontransduced Jurkat celler som kontrol. Sat cellerne i en celle kultur inkubator natten.
- RNA udvinding, bruge en kommercielt tilgængelig RNA isolering kit. Spin ned celler ved 233 x g i 5 min. ved stuetemperatur og fjerne medier. Bruge en 1 mL pipette tip til resuspend celler i 350 μL lysisbuffer. Tilføje 350 μl af 70% ethanol til de lysed celler, blandes grundigt med en 1 mL pipette og overføre prøven til kolonnen RNA.
- Spin lysates på 10.000 x g i 1 minut, fjerne gennemstrømnings- og tilføje 700 μL af lav-strenghed vaskebuffer fra kit til kolonnen. Spin lysates på 10.000 x g i 1 minut, fjerne gennemstrømnings- og tilsættes 80 µL af DNase jeg løsning fra kit til kolonnen. Lad prøverne inkuberes i 15 min ved stuetemperatur.
- Spin lysates på 10.000 x g i 1 minut, fjerne gennemstrømnings- og tilføje 700 µL af høj-strenghed vaskebuffer fra kit til kolonnen. Spin lysates på 10.000 x g i 1 minut, fjerne gennemstrømnings- og tilføje 700 µL af lav-strenghed wash buffer til kolonnen.
- Fjern kolonnen fra collection tube og overføre det til en ny collection tube. Spin lysates på 10.000 x g i 1 minut, og derefter overføre kolonnen RNA til en 1,5 mL tube. Tilsæt 50 µL vand til kolonne og spin på 10.000 x g i 1 minut.
- Brug et spektrofotometer til at kvantificere koncentrationen af RNA. Forvent koncentration skal være mellem 100-500 ng/µL, med en 260/280 absorbans mellem 1,9-2,1. Gemme RNA ved-80 ° C.
- I 250 µL rør, tilføje 1 µg RNA, 4 µL af supplerende DNA (cDNA) syntese buffer, 1 µL af reverse transkriptase og vand til en endelige mængden af 20 µL. omfatter ikke reverse transkriptase kontrolelementer. I en termisk cycler, syntetisere cDNA på 42 ° C i 30 min og ved 95 ° C i 5 min til at inaktivere reverse transkriptase. Fortynd cDNA med 60 µL vand efter syntese.
- Forberede polymerase kædereaktion (PCR'er) indeholdende 5 µL af SYBR green, 4 µL cDNA, 0,5 µL af fremad primer (10 µM), og 0,5 µL af reverse primer (10 µM). Køre PCR som følger: trin 1 = 95 ° C i 3 min, trin 2 = 95 ° C til 10 s, trin 3 = 60 ° C i 10 s og derefter, gentages trin 2 og 3 for 30 x.
Bemærk: Rækkefølgen af dCas9 fremad primer er 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA og rækkefølgen for dCas9 modsatte primer er 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Den forreste primer for Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) er 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT og den omvendte primer er 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA transduktion, udvælgelse, klon skabelse, og Screening
- Retransduce de validerede Jurkat-dCas9 celler med gRNA-holdige vira, som skitseret i afsnit 3. Marker celler i DMEM med hygromycin (supplerende tabel 1) for 10 dage. Spin ned celler og ændre medierne hver 3 dage.
- Udføre en seriel fortynding af celler (som beskrevet i trin 4.2) og udvide enkelte kolonier (som beskrevet i trin 4.3). Rense RNA fra kolonierne præcis som beskrevet i trin 4.5 og udføre cDNA syntese som beskrevet i trin 4.9. Udfør real-time PCR mod den indiske regering og HPRT1 eller en passende husholdning gen, ligeledes til PCR beskrevet taktfast 4.10, undtagen i dette tilfælde billede brønde hver cyklus efter trin 3.
- Bruge sammenlignende cyklus tærskel (Ct) metode til at bestemme fold ændring i den indiske regering8. Kort, bruge følgende ligning for at beregne relative udskrift niveauer (RTLs): 2-(gennemsnitlig Ct af GOI-gennemsnitlig Ct af husholdning gen). Derefter beregner den gennemsnitlige RTL kontrol og opdele alle RTL værdierne af kontrolelementet gennemsnitlige RTL til at generere en fold ændring i forhold til kontrolprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En dobbelt vektorsystem til overexpress lncRNA IFNG-AS1
Eksempel eksperiment i dette håndskrift er overekspression af en Jurkat T-celle modelsystem at udtrykke lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 er en lncRNA, der er associeret med inflammatorisk tarmsygdom, der er blevet set, at regulere Interferon Gamma10. IFNG-AS1 gen indeholder tre splice varianter, alle bruger det samme transcriptional startstedet (figur 1A). Derfor blev gRNA sekvenser, der var 10 og 100 bp fra transcriptional startsted og havde en "NGG" sekvens opstrøms brugt til at lede Cas9-aktivering komplekset til det transkriptionel locus af IFNG-AS1 (figur 1A). En to-plasmid system blev brugt til at transduce enten dCas9 eller gRNAs/smagsforstærkere i cellerne som en enkelt plasmid alene gør viral partikel generation vanskelig på grund af plasmid størrelse (figur 1B). For at aktivere markering af dobbelt-transduced celler, dCas9 vektor indeholdt en puromycin (aminonucleoside) resistens-genet, og den gRNA-holdige plasmid indeholdt en hygromycin (aminoglykosid) resistens gen. gRNAs var smeltet til en MS2 stillads sekvens, der aktiveret MS2 stillads proteinet bindes til gRNAs. Smeltet til MS2 protein er yderligere transcriptional aktivatorer til at forbedre overekspression af IFNG-AS17. Ved hjælp af disse vektorer, kan virale partikler oprettes for at transduce denne overekspression system i de fleste menneskelige cellelinjer.
Viral titering og koloni screening
Efter skaber der indeholder dCas9 og gRNA plasmider, plasmid purifications blev udført og lentiviruses blev oprettet. Som lentiviruses tilfældigt integrere deres kassetter i genomet, en kvantificering af antallet af viruspartikler giver mindst antal af integrationer muligt. For at opnå dette, aircondition-media-indeholdende virus blev målt med en p24 ELISA kit, giver mulighed for beregning af antallet af virioner pr. milliliter. Efter måling havde begge viral analysere næsten 1 µg/mL af p24, som tillod brug af 100 µL af virus til transduce Jurkat celler. Efter transduktion, antibiotikum-udvalgte celler blev seriefremstillede fortyndet og kloner blev udvidet. Cas9 udtryk blev derefter analyseret af real-time PCR og Agarosen gelelektroforese (figur 2B). Begge kloner udvalgt var positive for Cas9 udtryk. For at bekræfte mRNA udtryk, blev reverse transkriptase udeladt fra cDNA reaktion (figur 2B). Primere mod HPRT1 blev brugt til at bekræfte tilstedeværelsen af RNA i nontransduced celler.
Måling af IFNG-AS1 genekspression
Ved hjælp af dCas9-kloner som en parental cellelinie, celler blev transduced med enten en nontargeting gRNA indeholdende virus eller en virus, der indeholder gRNAs mod IFNG-AS1. Efter gRNA transduktion, udvælgelse og klon oprettelsen svarer til dCas9 celle linje oprettelse, blev IFNG-AS1 udtryk målt til at kontrollere overekspression. IFNG-AS1 producerer tre splice varianter, hvoraf hver kan påvises individuelt med udskrift-specifikke primere (rød) eller mod alle kendte IFNG-AS1 udskrifter (blå) (figur 3A). Alle fluorescens kurver var eksponentiel med HPRT1 at nå den eksponentielle fase (eller Ct) inden for en halv cyklus mellem kontrol og IFNG-AS1-gRNA-udtrykker celler (figur 3BC). Primere mod alle kendte IFNG-AS1 afskrifter blev den mest påviselige mellem eksperimenter med målinger af 20-fold stigninger i IFNG-AS1 (figur 3B). Mens primere mod udskrifter mod 1 og 2 forstærket med succes i perifert blod mononukleære celler (PBMC), var disse udskrifter ikke påviselig i Jurkat celler (data ikke vist). Men når den tredje udskrift af IFNG-AS1 var påvises i koncentreret RNA, en fem-tifold betydelig stigning i IFNG-AS1 niveauer blev set. Disse data tyder på enten alternativ splicing i IFNG-AS1 i Jurkat celler findes i forhold til primærelementer. Primere mod IFNG-AS1 opdaget store stigninger i dette gen, dermed validerer den aktiverende CRISPR overekspression system.
Figur 1: en dobbelt vektorsystem til overexpress lncRNA IFNG-AS1. (A) A skematisk IFNG-AS1 gen struktur og forholdet mellem guide RNA (gRNA) bindingssteder og transcriptional startsted (TSS). (B) funktioner gRNA og dCAS9 vektorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: koloni screening og Viral titering. (A) et eksempel p24 ELISA Standardkurven for lentivirus-holdige, konditioneret medier. De sorte prikker repræsenterer standardprøverne og røde prikker ukendte prøver. (B) efter transducing, vælge og generere kolonier, real-time PCR og gelelektroforese mod dCas9 blev udført på RNA fra enten nontransduced Jurkat celler (forældreorlov) eller dCas9-transduced kloner. Ingen reverse transkriptase (No RT) kontrollen blev udført. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: måling af IFNG-AS1 genekspression. (A) A diagram over forholdet mellem primer sæt og udskrift varianter. De røde pile repræsenterer udskrift-specifikke primere, mens de blå pile angiver primere mod alle kendte udskrifter. (B og C) repræsentative gennemsnitlige PCR kurver og fold-change kvantificeringer for kontrol og IFNG-AS1-overekspression celler. RFU = relativ fluorescens enheder. N = 3 prøver pr. gruppe. Betyde ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. En Student's t-test anvendtes til at beregne p-værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: gRNA design Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: BLAT Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: løsninger Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: ELISA fortyndinger Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript præsenterer en protokol for at bruge aktivering CRISPR til overexpress lncRNAs in vitro. Dette er en specielt vigtig teknik, når man studerer længe noncoding RNA'er som transkriptom produkt er den funktionelle enhed. Efter overekspression, kan forskeren derefter bruge disse celler at øge signal / støj-forhold, når man studerer bindende partnere og endda måle cellulære konsekvenserne af øget niveauer af lncRNAs. Derudover som lncRNAs ofte handle på cis-gener, muliggør denne endogene overekspression teknik disse begivenheder skal studerede11,12.
Dette manuskript fremhæver en generaliseret protokol for gRNA skabelse og lentivirus generation, transduktion og valg, og et repræsentativt eksempel på lncRNA overekspression i et perifert blod T-cellelinje blev skitseret. Desuden, har denne teknik allerede vist sig at være vellykket i knogle-marv-afledte immunceller13, neuroner7, mus embryonale stamceller14og nyre epitelceller4. Mens denne protokol er generelt gældende for de fleste cellelinjer, kan celler, der er svært at transduce kræve individuelle titers muligt højere smittespredningen. Desuden er det vigtigt at udføre antibiotika dræber kurver, når du bruger nye cellelinjer, som denne protokol udnytter en positiv markering strategi.
Bemærk har denne protokol flere tekniske aspekter, der kræver særlig opmærksomhed. Reproducerbare og konsekvent pipettering for real-time PCR er afgørende at etablere reproducerbare resultater. Selv små forskelle i mængder vil medføre meget varierende værdier, hvorved fortolkning vanskelig. Ud over en passende kvantitativ PCR primer design er kontrol, herunder ingen reverse transkriptase kontrol for de real-time PCR primere, kritisk, da de bekræfter, at den RNA bliver kvantificeret ikke er genomisk DNA. Udvalg af husholdning gener for real-time PCR er også vigtigt for at kunne passende udføre disse eksperimenter. Mens HPRT1 blev valgt i denne protokol, kan andre gener af interesser målrettet med denne teknik ændrer HPRT115. En omhyggelig udvælgelse af husholdning gener baseret på disse faktorer bør tages i betragtning.
Der er et par ulemper at aktivere CRISPR og særlige aspekter af denne protokol. En potentiel begrænsning er udtryk for udskrifter i stærkt gen-rige regioner som andre nærliggende gener kunne være tændt. Det er muligt, at tilstødende gener i umiddelbar nærhed kan aktiveres og kontrol skal udføres for at vurdere dette. Derudover omfatter andre begrænsninger manglen på bindende for særlige gRNAs til en given DNA-sekvens. Valg af flere gRNAs kan være nødvendigt at identificere de relevante gRNA at drive udtryk. En anden advarsel til systemet er, at celle af interesse, har kapacitet til at drive initiativtagerne i kassetter for at drive et udtryk for gRNAs og dCas9. For de undersøgelser, der er fremlagt her, kunnet Jurkat T-celle model drive udtryk for disse komponenter til en vellykket overekspression system.
Ideelt set bør protokollen beskrevet her kombineres med andre underbyggende oplysninger, såsom enkelt udskrift overekspression data og funktionelle virkninger fra knockdown eller knockout undersøgelser, at afstive tilfældet for nogen af de efterfølgende resultater. Denne teknik byder på en robust måde at overekspression alle gen i en bestemt celletype. Givet begrænsningerne af lncRNA biologi, såsom dårlig arter bevarelse, er teknikker som beskrevet her afgørende for at udforske deres funktion i relevante celletyper. Denne undersøgelse fokuserer på en lncRNA, der har været impliceret i inflammatoriske tarm sygdom Patofysiologi, men fungerer som en model for at studere funktionen af andre lncRNAs i menneskelige sygdomme biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
C.P. understøttes af RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. understøttes af en Crohns & Colitis Foundation (CCFA) karriere udvikling award, kur: fordøjelsessystemet sygdomme Research Center (Morsø) DK41301, og UCLA klinisk og translationel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi core blev finansieret af Center for AIDS Research (CFAR) give 5P 30 AI028697. Den UCLA integreret Molekylær teknologier core blev støttet af kur/P30 give DK041301. Dette arbejde blev også støttet af UCLA AIDS Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
