Summary
Traditionele cDNA gebaseerde overexpressie technieken hebben een beperkte toepasbaarheid voor de overexpressie van lang noncoding RNAs als gevolg van hun meerdere splice formulieren met potentiële functionaliteit. Dit overzicht meldt een protocol gebruiken CRISPR technologie om de overexpress van meerdere varianten van het splitsen van een lang noncoding RNA.
Abstract
Lang noncoding RNA (lncRNA) biologie is een nieuwe en spannende gebied van onderzoek, met het aantal publicaties uit dit veld groeien exponentieel sinds 2007. Deze studies hebben bevestigd dat de lncRNAs worden gewijzigd in bijna alle ziekten. Het blijft echter moeilijk te wijten aan het gebrek aan eiwitproducten weefsel-specifieke expressie, lage expressie niveaus, complexiteit in splice vormen, en van behoud onder soorten bestuderen van de functionele rollen voor lncRNAs in het kader van de ziekte. Gezien de soortspecifieke expressie, lncRNA studies zijn vaak beperkt tot menselijk onderzoek contexten bij de studie van ziekteprocessen. Aangezien lncRNAs op moleculair niveau functioneren, is een manier om te ontleden lncRNA biologie te verwijderen van de lncRNA of overexpress van de lncRNA en maatregel cellulaire gevolgen. In dit artikel, wordt een schriftelijke en gevisualiseerde protocol bij lncRNAs in vitro overexpress gepresenteerd. Als een representatieve experiment, is aangetoond dat een lncRNA geassocieerd met inflammatoire darmziekte, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), in een Jurkat T-cel-model worden overexpressie. Om dit te bereiken, wordt de activerende geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR)-techniek gebruikt om overexpressie op de endogene genomic loci. De activerende CRISPR techniek richt zich op een reeks van transcriptiefactoren op de site van transcriptionele start van een gen, waardoor een robuuste overexpressie van meerdere lncRNA splice vormen. Deze procedure zal worden opgesplitst in drie stappen, namelijk (i) gids RNA (gRNA) ontwerp en vector constructie, (ii) virus generatie en transductie en (iii) kolonie screening voor overexpressie. Voor dit representatieve experiment, een groter is dan de verhoging van de 20-fold in IFNG-AS1 in Jurkat T-cellen werd waargenomen.
Introduction
Terwijl de meest biomedisch onderzoek is gericht op eiwit-codeert transcripten, bestaat de meerderheid van de getranscribeerde genen eigenlijk uit noncoding RNAs (Ensembl versie 93). Huidige onderzoek begint te verkennen van dit gebied, met het aantal publicaties over lncRNAs in ziekteprocessen stijgt exponentieel tussen 2007 en 20171. Deze publicaties tonen aan dat veel lncRNAs geassocieerd met de ziekte zijn. De moleculaire mechanismen van deze lncRNAs zijn echter moeilijk te studeren als gevolg van hun verschillende functies in vergelijking met mRNAs. Compounding het probleem van het begrip van de rol van lncRNAs in ziekte, worden lncRNAs vaak uitgedrukt op lagere niveaus dan codering RNAs2. Bovendien zijn lncRNAs slecht bewaard, waardoor de functionele studies in de mens-cel-regel-gebaseerde technieken3beperkt. Eén methode om te studeren het mechanisme van deze nieuwe genen is endogeen overexpress hen in gekweekte cellen. Overexpressie studies kunnen belangrijke informatie verschaffen over de functie van specifieke genen en onderzoekers te ontleden belangrijke moleculaire pathways inschakelen.
Een nieuwe methode voor het activeren van de transcriptie van lncRNA genen is gebaseerd op CRISPR technologieën ontwikkeld in eerste instantie door de Gersbach laboratorium4. Dit protocol is aangepast voor gebruik in de biologie van de lncRNA en voor de uitdrukking van deze genen in andere modelsystemen. In de CRISPR overexpressing techniek, kan vallen proteïnen aan genaamd CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) worden omgeleid naar een DNA-sequentie via een antisense gRNA die door Cas9 wordt herkend. Normaal, Cas9 zal het induceren van DNA splitsingsproducten; echter deactiveren mutaties in Cas9, eerder ontwikkeld voor de overexpressie techniek, deze stap5. Wanneer een transcriptionele activator is gesmolten tot een "dode" Cas9 (dCas9) en getransduceerde in cellijnen, de endogene overexpressie van lncRNAs kan worden bereikt4,6. De toevoeging van extra wijzigingen in de gRNA, waardoor extra transcriptionele factoren te binden aan de gRNA, steeg de werkzaamheid van de activeringssysteem van de dCas9-gen 10-fold7. Nog belangrijker is, het werd aangetoond dat transcriptionele activering nabijheid vereist (< 200 bp) naar de transcriptionele start site genen, waardoor een specifieke opregulatie in gen-rijke gebieden7. In tegenstelling tot CRISPR knock-out technologieën moeten dCas9 en gRNA cassettes worden geïntegreerd in het genoom te voorzien in cellen behouden een overexpressie over meerdere generaties. Een methode om dit te bereiken is het gebruik van lentivirussen te integreren van de dCas9 - en gRNA-bevattende cassettes. Na de integratie, kan de genexpressie lncRNA worden bepaald.
In dit artikel, zal een protocol voor lncRNA overexpressie in een Jurkat T-cel-model worden aangetoond. Een stapsgewijze procedure weergegeven en kan ook worden aangepast naar Adherente cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Het is belangrijk op te merken dat dit protocol wordt gebruikt voor replicatie-deficiënte lentivirussen. Virale behandeling slechts na juiste lab veiligheidstraining uitvoeren Bleekmiddel alle items en oppervlakken die in contact met levende virussen voor een minimum van 10 min na behandeling komen. Gebruik een wegwerp lab jas en gezicht/oog bescherming, alsmede dubbele handschoenen, te allen tijde. Virus werk uitvoeren in bioveiligheid niveau 2 + laboratoria met virale certificering. Weefselkweek kappen en starterscentra aan virale werk besteden.
1. vector Design en generatie
Opmerking: De beste manier om gRNA sequenties identificeren is het gebruik van online ontwerpprogramma's (bijvoorbeeld, http://crispr-era.stanford.edu) (aanvullende figuur 1: gRNA ontwerp). Voor de begeleidende representatieve experiment, een bedrijf ontworpen en gemaakt van de vectoren van de gRNA gebruikt in het representatieve experiment. De dCas9-plasmide werd ook online gekocht.
- De volgorde van de gRNA ligt stroomopwaarts van de nucleotide sequentie "NGG", waarbij "N" staat voor elk nucleotide, die ook binnen 100 base-paren van de site van transcriptionele start. Zoeken in genetische databases zoals BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) voor de opeenvolging van de gRNA, om ervoor te zorgen zijn er geen andere in het genoom met soortgelijke sequenties (aanvullende figuur 2: BLAT). Dit zal ervoor zorgen dat de volgorde van gRNA uniek voor het gen van belang (Indiase is).
- Opslaan van de gRNA en dCas9 plasmiden, die als bacteriële stubs, bij 4 ° C. komen Streak uit Escherichia coli op een Luria Bouillon (LB) agar plaat met ampicilline (aanvullende tabel 1) en groeien de bacteriën 's nachts bij 37 ° C.
- Kies een kolonie en groeien van de bacteriën in 5 mL LB met ampicilline (aanvullende tabel 1) 's nachts, krachtig schudden de plaat in een 37 ° C incubator. De volgende dag, voeg toe 2 mL 200 mL LB met ampicilline bacteriën groeien in een erlenmeyer van 2 L, krachtig schudden de kolf in een incubator 37 ° C's nachts.
- Draai de bacteriën bij 3,724 x g gedurende 20 min. verwijderen de media en plaats de buis met de bacteriën op ijs.
-
Zuiveren van bacteriële DNA met behulp van een plasmide zuivering kit per protocol van de fabrikant.
Opmerking: de plasmide reiniging kits bevatten merkgebonden resuspensie buffer, lysis-buffermengsel was buffer, evenwichtsinstelling buffer en buffer elutie.- Voeg 10 mL van resuspensie buffer uit de kit aan de bacteriën en Pipetteer de bacteriën in de oplossing. Dan, voeg toe 10 mL lysisbuffermengsel uit de kit aan de geresuspendeerde bacteriën en meng ze door het omkeren van de buis. Wacht 5 minuten om te lyse van de bacteriën; dan, voeg toe 10 mL ijskoud neutralisatie buffer uit de kit aan de lysed bacteriën en meng ze door het omkeren van de buis.
- Equilibreer de kolom DNA uit de kit met 10 mL van de evenwichtsinstelling buffer voor 5 min. Pour de monsters in de DNA-kolom filteren en laat de oplossing door de filter overgaan.
- Wassen van de monsters 2 x met 30 mL buffer wassen en Elueer vervolgens, het DNA met 30 mL elutie buffer in een conische tube van 15 mL. Langzaam laag 10,5 mL isopropanol bij kamertemperatuur op het eluted DNA, het omkeren van de buis en draai het onmiddellijk bij 16,200 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 mL 70% ethanol tot de DNA-pellet. Resuspendeer de pellet door flicking de buis. Draai het bij 16,200 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en een 200 μL pipet tip gebruiken voor het verwijderen van de meeste van de ethanol. Luchtdroog de pellet voor 5 min en resuspendeer het in 200 μL van water en het opslaan van het DNA bij-20 ° C. De verwachte concentratie zullen > 1 μg/μL.
2. virus generatie en Particle graaf
- Als u klaar bent om te maken van de dCAS9-bevattende lentivirus, jas 100 mm weefselkweek gerechten met 5 mL 0,01% poly-L-lysine (aanvullende tabel 1). Verwijderen van de overtollige vloeistof grondig uit de platen en laat ze aan voor een paar minuten in een kabinet bioveiligheid.
- Plaat 5 x 106 HEK 293T cellen per schotel in 10 mL van de volledige Dulbecco gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) (aanvullende tabel 1) en ze 's nachts Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2. De volgende dag, verwijder het medium van de HEK 293T schotels en voeg 10 mL van volledige DMEM.
- Mix-6.5 μg plasmide pMDLg/pRRE met de gag/pol (onderdelen van het virus), 3.5 μg van de plasmide-pMDG2.G met de VSV-G (een onderdeel van het virus), 2,5 µg van de plasmide pRSV-Rev bevattende Rev (een onderdeel van het virus), 10 μg van een lang terminal herhalen ( LTR)-bevattende gRNA vector of een LTR-bevattende dCas9 vector en voeg water toe tot een totaal volume van 450 μL. Filtreer het mengsel door een 0,2 µm filter tip gekoppeld aan een spuit.
- 50 µL van 2,5 M CaCl2 (aanvullende tabel 1) toevoegen aan elk monster van de transfectie van DNA en meng voorzichtig. Filtreer het mengsel van de calcium/DNA door middel van een tip van 0,2 µm filter gekoppeld aan een spuit. Pipetteer 500 µL van 2 x HBS (aanvullende tabel 1) in een polystyreen tube van 5 mL. Voeg de 500 µL DNA/CaCl2 mix dropwise en zachtjes vortex. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Voeg langzaam 1 mL van de DNA/CaCl2/HBS ophanging aan elk gerecht. Onmiddellijk swirl de gerechten om de inhoud te verdelen. Incubeer elk gerecht overnachting in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Op dag 3, langzaam verwijderen en verwijderen van de media van de gerechten. Grondig wassen de cellen 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 6 mL volledige DMEM aangevuld met 20 mM HEPES en 10 mM natrium butyraat. Incubeer de cellen gedurende 5-6 uur in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Wassen van de cellen 1 x met PBS en voeg 5 mL van de volledige DMEM met 20 mM HEPES naar het HEK 293T cellen. Incubeer gedurende 12 uur 's nachts in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Op dag 4, verzamelen de HEK 293T cel supernatant en de bovendrijvende vloeistof filteren. Bevriezen van 1 mL aliquots bij-80 ° C.
- Als u klaar bent om te gebruiken het virus, ontdooi een aliquoot gedeelte van het virale deeltje met geconditioneerde media (opgeslagen als beschreven in stap 2.8) op ijs. Breng alle reagentia op kamertemperatuur.
-
Gebruik een p24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kit te kwantificeren van het aantal virale deeltjes per milliliter.
- Verdun het wassen concentraat uit de kit door 19 delen gedistilleerd gedeïoniseerd water toe te voegen. Verdun de positieve controle uit de kit aan 200 ng/mL, met behulp van RMPI 1640 als oplosmiddel en maken de verdunningen voor standaard curve in 1,5 mL tubes volgens de p24 ELISA verdunning tabel (aanvullende tabel 2).
- Toevoegen van 20 μL van 5% Triton X-100 aan alle putjes met uitzondering van het substraat leeg. Voeg toe 200 μL van RPMI 1640 aan de negatieve controle-putjes. Voeg toe 200 μL van elke norm (in tweevoud) aan de aangewezen putjes.
- Met een spectrofotometer, het meten van de concentratie van het virus binnen de monsters, met behulp van een standaard curve. Start de monsterverdunning op 1:1,000 en het volume zo nodig om te worden binnen het bereik van de standaard curve te wijzigen. Verdun de monsters met Triton X-100 aan een definitieve concentratie van 0,5% en voeg toe 200 μL van elk monster in RPMI 1640 aan aangewezen putjes. Afdichting van de plaat en het Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Wassen van de plaat 6 x met 300 μL van 1 x wassen buffer per putje. Verwijder alle overtollige vocht door de plaat omkeren en het onttrekken op een papieren handdoek. Breng 100 μl van detector antilichaam uit de kit in alle putjes met uitzondering van het substraat leeg. Afdichting van de plaat en het Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wassen van de plaat, en verwijder vervolgens alle overtollige vocht door de plaat omkeren en het onttrekken op een papieren handdoek.
- Voorbereiden om te meten de detector antilichaam, daar-mierikswortelperoxidase (SA-HRP) binnen 15 min van gebruik. Verdun de SA-HRP op 1:100 met SA-HRP verdunningsmiddel. De verdunde SA-HRP meng en voeg 100 μl toe aan alle putjes met uitzondering van de blanco. Seal en de plaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Wassen van de plaat met 1 x wassen buffer en tik op afstand alle overtollige vloeistof zoals in stap 2.10.4. Gebruik van ortho-fenyleendiamine (OPD) substraat oplossing, waarmee de peroxydase de nodige substraten voor de productie van Chemoluminescentie, binnen 15 min van voorbereiding. Gebruik een OPD tablet aan 11 mL verdunningsmiddel substraat voor elke plaat.
- Vortex de OPD-oplossing krachtig te ontbinden volledig beschermen tegen licht. Breng 100 μl van OPD substraat oplossing in alle putjes, met inbegrip van de blanco. Met behulp van een spectrofotometer, lees de absorptie bij 450 nm onmiddellijk, herhaal dit 10 x 1 s tussenpozen, en nemen de gemiddelde meting.
3. dCas9 -VP64 transductie
- Cultuur Jurkat T-cellen in de volledige DMEM in een maatkolf van T75 met een bevolkingsdichtheid van 2 x 106 cellen in 15 mL media. Cultuur van de cellen in een incubator 37 ° C met 5% CO2.
- Spin down de cellen gedurende 5 minuten op 233 x g en resuspendeer hen vervolgens in 10 mL verminderde serum media. De cellen met een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller tellen.
- Resuspendeer en 1 x 106 Jurkat cellen in 5 mL verminderde serum media plaat met polybrene (aanvullende tabel 1) in een maatkolf van T75. Voeg HEK 293T-geconditioneerd media met 1 x 106 dCas9-bevattende virale deeltjes. Het aantal virale deeltjes kan grofweg worden berekend uit de p24 ELISA omdat 1 μg/mL p24 is gelijk aan 1 x 107 virale deeltjes. Zet de kolven in 37 ° C incubator met 5% CO2.
4. selectie en kloon creatie
- Drie dagen na infectie, spin down de cellen bij 233 x g gedurende 5 min en resuspendeer hen in volledige DMEM met puromycin (aanvullende tabel 1) 10 mL. Plaat van de cellen in T75 kolven en cultuur hen bij 37 ° C met 5% CO2. Elke derde dag, voor een periode van 9 dagen, spin down de cellen bij 233 x g gedurende 5 min en vervang de media met complete DMEM met puromycin.
- Met behulp van een hemocytometer of een teller geautomatiseerde cel cellen te tellen. Op een 96-wells-plaat met Weefselkweek behandeld, de 10.000 cellen van de plaat in 100 μl van complete DMEM met puromycin in de eerste goed en serieel verdund 1:1 de inhoud van de volgende putjes met complete DMEM met puromycin. Uitvoeren van 24 verdunningen en herhaal deze 4 x per plaat om ervoor te zorgen dat er een voldoende aantal cellen per putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Vouw klonale cellen in twee 24-Wells-platen, dan in een 6-well plaat, en uiteindelijk in een maatkolf van T75. Om te richten op drie van de klonen, plaat 2 x 106 cellen per putje van de plaat van een 6-well voor drie van de klonen. Plaat van de andere drie putten met nontransduced Jurkat cellen als besturingselementen. Zet de cellen in een cel cultuur incubator's nachts.
- Voor RNA extractie, een commercieel beschikbare RNA isolatie kit gebruiken. Spin down de cellen bij 233 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het medium. Gebruik een 1 mL pipet tip om resuspendeer de cellen in 350 μL van lysis buffer. 350 μL van 70% ethanol toevoegen aan de lysed cellen, meng met een pipet 1 mL en overbrengen van het monster naar de RNA-kolom.
- Draai de lysates bij 10.000 x g gedurende 1 minuut, verwijderen de doorstroming en 700 μL van lage-striktheid was buffer uit de kit aan de kolom toevoegen. Draai de lysates bij 10.000 x g gedurende 1 minuut, verwijderen de doorstroming en voeg 80 µL van DNase ik oplossing uit de kit aan de kolom; Laat de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Draai de lysates bij 10.000 x g gedurende 1 minuut, verwijderen de doorstroming en 700 µL van hoge-striktheid was buffer uit de kit aan de kolom toevoegen. Draai de lysates bij 10.000 x g gedurende 1 minuut, verwijderen de doorstroming en 700 µL van lage-striktheid was buffer toevoegen aan de kolom.
- Verwijder de kolom uit de collectie buis en overbrengen naar een nieuwe collectie buis. Spin de lysates bij 10.000 x g gedurende 1 min en vervolgens de kolom RNA overbrengen in een 1,5 mL-buis. Voeg toe 50 µL van water aan de kolom en de spin bij 10.000 x g gedurende 1 min.
- Het gebruik van een spectrofotometer te kwantificeren van de concentratie van RNA. Verwacht dat de concentratie tussen 100-500 ng/µL, met een 260/280 extinctie tussen 1.9-2.1. Winkel de RNA bij-80 ° C.
- Buizen, voeg 1 µg van RNA, 4 µL van complementaire DNA (cDNA) synthese buffer, 1 µL van reverse-transcriptase in 250 µL en water tot een eindvolume van 20 µL. geen reverse-transcriptase-besturingselementen bevatten. Synthetiseren in een thermische cycler, cDNA bij 42 ° C gedurende 30 minuten en bij 95 ° C gedurende 5 min naar de inactivering van de reverse-transcriptase. Verdun de cDNA met 60 µL van water na de synthese.
- Polymerase kettingreactie (PCRs) met 5 µL van groene SYBR, 4 µL van cDNA, 0,5 µL voorste primer (10 µM) en 0,5 µL van omgekeerde primer (10 µM) voor te bereiden. Uitvoeren van PCR als volgt: stap 1 = 95 ° C gedurende 3 min, stap 2 = 95 ° C gedurende 10 s, stap 3 = 60 ° C gedurende 10 s, en vervolgens, herhaal stappen 2 en 3 voor 30 x.
Opmerking: De volgorde voor de dCas9 naar voren primer is 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA en de volgorde voor de dCas9 reverse primer is 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. De voorwaartse primer voor Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) is 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT en de omgekeerde primer is 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA signaaltransductie, selectie, kloon , creëren, en Screening
- Retransduce de gevalideerde cellen van de Jurkat-dCas9 met gRNA-bevattende virussen zoals uiteengezet in sectie 3. Selecteer de cellen in de DMEM met hygromycin (aanvullende tabel 1) voor 10 dagen. Spin down de cellen en wijzigt de media om de 3 dagen.
- Uitvoeren van een seriële verdunning van cellen (zoals beschreven in stap 4.2) en afzonderlijke kolonies uit te breiden (zoals beschreven in stap 4.3). Zuiveren van RNA uit de koloniën precies zoals beschreven in stap 4,5 en cDNA synthese zoals beschreven in stap 4.9 uit te voeren. Uitvoeren van PCR in real time tegen de Indiase overheid en HPRT1 of een passende huishouden-gen, op dezelfde manier aan de PCR beschreven in stap 4.10, behalve in dit geval afbeelding die de putten van elke cyclus na stap 3.
- De vergelijkende cyclus drempel (Ct) methode gebruiken om te bepalen van de verandering van de vouw in de Indiase overheid8. In het kort de volgende vergelijking gebruiken om te berekenen de relatieve transcript niveaus (RTLs): 2-(gemiddelde Ct van de Indiase overheid-gemiddelde Ct van huishouding gen). Vervolgens berekenen van de gemiddelde RTL van de controles en alle RTL waarden delen door het gemiddelde besturingselement RTL voor het genereren van een verandering van de vouw in vergelijking met de controlemonsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een systeem van de dubbele vector te overexpress de lncRNA IFNG-AS1
De voorbeeld-experiment in dit manuscript is de overexpressie van een Jurkat T-cel modelsysteem uiting geven aan de lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 is een geassocieerd met inflammatoire darmziekte, die heeft gezien voor het regelen van Interferon Gamma10lncRNA. Het IFNG-AS1 gen bevat drie splice varianten waarmee alle dezelfde transcriptionele start site (figuur 1A). Daarom, gRNA sequenties die werden 10 en 100 bp uit de buurt van de site van transcriptionele start en had een "NGG" volgorde stroomopwaarts werden gebruikt voor het activeren van het Cas9 complex de transcriptionele locus van IFNG-AS1 (figuur 1A). Een twee-plasmide-systeem werd gebruikt om transduce of dCas9 of gRNAs/versterkers in cellen als een enkele plasmide alleen maakt virale deeltjes generatie moeilijk vanwege de grootte van de plasmide (figuur 1B). Opdat de celselectie dubbel-getransduceerde, de dCas9-vector bevatte een gen van de weerstand puromycin (aminonucleoside), en de gRNA-bevattende plasmide bevatte een gen van de weerstand hygromycin (aminoglycoside). gRNAs waren gesmolten in een MS2 steiger reeks waardoor het MS2 steiger eiwit te binden aan de gRNAs. Gesmolten tot de MS2 eiwit zijn extra transcriptionele activators ter verbetering van de overexpressie van IFNG-AS17. Met behulp van deze vectoren, kunnen virale deeltjes worden gemaakt om te transduce dit overexpressie systeem in de meeste menselijke cellijnen.
Virale titering en kolonie screening
Na het genereren van de dCas9 - en gRNA-bevattende plasmiden, plasmide zuivering werden uitgevoerd en lentivirussen werden gemaakt. Zoals hun cassettes lentivirussen willekeurig in het genoom integreren, een kwantificering van het aantal virale deeltjes kan het minst aantal integraties mogelijk. Om dit te bereiken, geconditioneerd-media-bevattende virussen werden gemeten met een p24 ELISA-kit, zodat voor de berekening van het aantal virionen per milliliter. Na het meten had zowel virale supernatant bijna 1 µg/mL p24, waardoor het gebruik van 100 µL van het virus op het transduce van de Jurkat cellen. Na signaaltransductie, antibioticum geselecteerde cellen werden serieel verdund en klonen werden uitgebreid. Cas9 expressie werd vervolgens geanalyseerd door PCR in real time en agarose gel electroforese (figuur 2B). Beide klonen geselecteerd waren positief voor Cas9 expressie. Om te bevestigen mRNA uitdrukking, werd reverse-transcriptase weggelaten uit de reactie van cDNA (figuur 2B). Inleidingen tegen HPRT1 werden gebruikt om de aanwezigheid van RNA in de nontransduced cellen bevestigen.
Het meten van de genexpressie IFNG-AS1
Met behulp van de dCas9 klonen als een cellijn van de ouderlijke, getransduceerde cellen werden met ofwel een nontargeting gRNA-bevattende of een virus met gRNAs tegen IFNG-AS1. Na gRNA signaaltransductie, selectie en kloon creatie analoog aan dCas9 cel lijn creatie, werd de IFNG-AS1 expressie gemeten om te controleren of overexpressie. IFNG-AS1 produceert drie splice varianten, die elk kan individueel worden gedetecteerd met transcript-specifieke primers (rood) of tegen alle bekende afschriften van de IFNG-AS1 (blauw) (figuur 3A). Alle fluorescentie krommen werden exponentiële HPRT1 bereiken die de exponentiële fase (of Ct) binnen een half cyclus tussen controle- en IFNG-AS1-gRNA-uiting geven aan cellen (figuur 3BC). Inleidingen tegen alle bekende afschriften van de IFNG-AS1 waren de meest aantoonbaar tussen experimenten met metingen van 20-fold stijgingen van IFNG-AS1 (figuur 3B). Terwijl inleidingen tegen afschriften tegen 1 en 2 versterkt met succes in perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), waren deze afschriften niet aantoonbaar in Jurkat cellen (gegevens niet worden weergegeven). Echter, toen het derde transcript van IFNG-AS1 in geconcentreerde RNA worden opgespoord, een vijf-tot tienvoudige aanzienlijke toename IFNG-AS1 niveaus werd gezien. Deze gegevens stellen voor beide alternatieve splicing van IFNG-AS1 in Jurkat cellen bestaan ten opzichte van primaire cellen. Inleidingen tegen IFNG-AS1 gedetecteerd grote stijgingen in dit gen, waardoor het valideren van de activerende CRISPR overexpressie systeem.
Figuur 1: een systeem van de dubbele vector te overexpress de lncRNA IFNG-AS1. (A) A schema van de IFNG-AS1 gene structuur en de relatie tussen bandplaatsen gids-RNA (gRNA) en de site van transcriptionele start (TSS). (B) de kenmerken van de vectoren gRNA en dCAS9. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: virale titering en kolonie screening. (A) een voorbeeld p24 ELISA standaard curve voor lentivirus-bevattende, geconditioneerde media. De zwarte stippen vertegenwoordigen standaard monsters en de rode stippen onbekende monsters. (B) na transducing, selecteren, en het genereren van de kolonies, PCR in real time en de Elektroforese van het gel tegen dCas9 werden uitgevoerd op de RNA van beide nontransduced Jurkat cellen (ouderschapsverlof) of dCas9-getransduceerde klonen. Geen reverse-transcriptase (RT No) controles werden uitgevoerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: het meten van de genexpressie IFNG-AS1. (A) A diagram van de relatie tussen primer sets en transcript varianten. De rode pijlen vertegenwoordigen transcript-specifieke primers, terwijl de blauwe pijlen de inleidingen tegen alle bekende afschriften geven. (B en C) representatieve gemiddelde PCR krommen en vouw-change ondermeer voor controle- en IFNG-AS1-overexpressing cellen. RFU = relatieve fluorescentie eenheden. N = 3 monsters per groep. Bedoel ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. Een Student t-test werd gebruikt voor het berekenen van de p-waarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: gRNA ontwerp Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: BLAT Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: oplossingen Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2: ELISA verdunningen Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript presenteert een protocol voor het gebruik van het activeren van CRISPR voor overexpress lncRNAs in vitro. Dit is een bijzonder belangrijk techniek bij de studie van lange noncoding RNAs zoals het transcriptomic product de functionele eenheid is. Na overexpressie, de onderzoeker, dan kunt deze cellen te verhogen van de signaal-/ ruisverhouding bij de studie van bindende partners en zelfs het meten van de cellulaire gevolgen van lncRNAs wordt verbeterd. Daarnaast zoals lncRNAs vaak over cis-genen handelen, maakt deze techniek endogene overexpressie deze gebeurtenissen bestudeerde11,12.
Dit manuscript belicht een veralgemeende protocol voor gRNA maken en lentivirus generatie, transductie en selectie, en een representatief voorbeeld van lncRNA overexpressie in een perifeer bloed T cellijn werd geschetst. Deze techniek is bovendien al gebleken succesvol te zijn in het bot-merg-afgeleide immuuncellen13, neuronen7, muis embryonale stamcellen14en nier epitheliale cellen4. Terwijl dit protocol algemeen toepasbaar voor meeste cellijnen is, wellicht cellen die moeilijk te transduce individuele titers dat hogere tarieven van de infectie. Daarnaast is het belangrijk om uit te voeren van antibiotica doden krommen bij het gebruik van nieuwe cellijnen, zoals dit protocol maakt gebruik van een positieve selectie strategie.
Van de nota heeft dit protocol verschillende technische aspecten die speciale aandacht behoeven. Reproduceerbaar en consistente pipetteren voor PCR in real time is cruciaal om reproduceerbare resultaten. Zelfs kleine verschillen in volumes zal veroorzaken zeer variabele waarden, waardoor de interpretatie lastig. Naast een goede kwantitatieve PCR primer design zijn besturingselementen, met inbegrip van het neen-reverse-transcriptase-besturingselement voor de real-time PCR primers, kritisch als ze bevestigen dat het RNA wordt gekwantificeerd niet genomic DNA. De selectie van huishouding genen voor PCR in real time is ook belangrijk om het adequaat uitvoeren van deze experimenten. Terwijl HPRT1 werd gekozen in dit protocol, kan HPRT115kunnen worden gewijzigd door andere genen van belangen gericht door deze techniek. Een zorgvuldige selectie van huishouding genen op basis van deze factoren moet in aanmerking worden genomen.
Er zijn een paar nadelen aan het activeren van CRISPR en bepaalde aspecten van dit protocol. Een mogelijke beperking is de uitdrukking van afschriften in zeer gen-rijke regio's, zoals andere naburige genen kunnen worden ingeschakeld. Het is mogelijk dat naburige genen in de nabijheid kan worden geactiveerd en controles moeten worden uitgevoerd om dit te beoordelen. Bovendien omvatten andere beperkingen het gebrek aan bindende voor bepaalde gRNAs aan een bepaalde DNA-sequentie. De selectie van meerdere gRNAs kan worden verplicht te vermelden van de juiste gRNA op station expressie. Een ander voorbehoud voor het systeem is dat de cel van belang hebben de capaciteit om te rijden de initiatiefnemers in de cassettes moet om de uitdrukking van de gRNAs en de dCas9. Voor de studies die hier gepresenteerd, werd de Jurkat T-cel-model kunnen rijden de uitdrukking van deze componenten voor een succesvolle overexpressie systeem.
In het ideale geval moet het protocol hier beschreven gekoppeld worden aan andere bevestigende informatie, zoals één afschrift overexpressie gegevens en functionele gevolgen van vechtpartij of afvalrace studies, om te ondersteunen bij een van de volgende bevindingen. Deze techniek biedt een robuuste manier van elk gen in een bepaalde celtype overexpressing. Gezien de beperkingen van de biologie van de lncRNA, zoals slechte soorten behoud, zijn technieken zoals hier beschreven cruciaal voor het verkennen van hun functie in relevante celtypes. Deze studie concentreerde zich op een lncRNA dat is betrokken bij ontstoken darm ziekte pathofysiologie maar dient als een model voor het bestuderen van de functie van andere lncRNAs in de biologie van ziekten bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
C.P. wordt ondersteund door RO1 DK60729 en P30 DK 41301-26. D.P. wordt ondersteund door een ziekte van Crohn & Colitis Foundation (CCFA) carrière ontwikkeling award, CURE: spijsvertering ziekten Research Center (DDRC) DK41301, en UCLA klinisch en translationeel Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. De kern van de virologie UCLA werd gefinancierd door het centrum van AIDS onderzoek (BVERRE) 5P 30 AI028697 verlenen. De UCLA geïntegreerde moleculaire technologieën kern werd gesteund door CURE/P30 verlenen DK041301. Dit werk werd ook ondersteund door het AIDS-Instituut van UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
