Summary
Techniques traditionnelles axées sur l’ARNC surexpression ont une portée limitée pour la surexpression de l’ARN long non codantes en raison de leurs multiples formes d’épissure avec fonctionnalité potentielle. Cette étude rapporte un protocole utilisant la technologie CRISPR pour surexprimer multiples variants d’épissage d’un ARN long non codant.
Abstract
Longtemps non codante biologie des ARN (lncRNA) est un domaine nouveau et passionnant de recherche, avec le nombre de publications de ce domaine en croissance exponentielle depuis 2007. Ces études ont confirmé que les lncRNAs soient modifiées dans presque toutes les maladies. Toutefois, il reste difficile en raison du manque de produits protéiques, expression tissu-spécifique, les niveaux d’expression faible complexité sous formes d’épissage et de la conservation des espèces d’étudier les rôles fonctionnels pour lncRNAs dans le contexte de la maladie. Compte tenu de l’expression spécifique à l’espèce, lncRNA études se limitent souvent aux contextes de recherche humaine lorsque l'on étudie les processus morbides. Étant donné que lncRNAs fonctionne au niveau moléculaire, disséquer la biologie lncRNA consiste à enlever la lncRNA ou surexpriment les effets cellulaires lncRNA et mesure. Dans cet article, un protocole écrit et visualisé de surexprimer lncRNAs in vitro est présenté. Comme une expérience représentative, une lncRNA associée à la maladie intestinale inflammatoire, l’interféron Gamma antisens 1 (IFNG-AS1), s’est avéré être surexprimé dans un modèle de cellules T Jurkat. Pour ce faire, la technique activateur de régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster est utilisée pour permettre à la surexpression dans les locus génomiques endogènes. La technique CRISPR activation vise un ensemble de facteurs de transcription sur le site de début de transcription d’un gène, qui permet une surexpression robuste de multiples formes d’épissure de lncRNA. Cette procédure va être décomposée en trois étapes, à savoir (i) guide RNA (gRNA) conception et vector construction, génération de virus (ii) et transduction et criblage de colonie (iii) pour la surexpression. Pour cette expérience représentative, a plus de 20 fois amélioration dans IFNG-AS1 dans les cellules T Jurkat a été observée.
Introduction
Alors que la recherche biomédicale plus a porté sur transcrits codant pour des protéines, la majorité des gènes transcrits se compose en réalité d’ARN non codants (Ensembl release 93). La recherche actuelle commence à explorer ce domaine, avec le nombre de publications sur lncRNAs dans le processus de la maladie augmente de façon exponentielle entre 2007 et 20171. Ces publications démontrent que de nombreux lncRNAs sont associés aux maladies. Cependant, les mécanismes moléculaires de ces lncRNAs sont difficiles à étudier en raison de leurs fonctions diverses de mRNA. Le problème de la compréhension du rôle de lncRNAs dans la maladie de mélange, lncRNAs s’expriment souvent à des niveaux inférieurs que coding RNAs2. En outre, lncRNAs sont mal conservées, qui limite les études fonctionnelles dans l’homme cellulaire-ligne-techniques basées sur3. Une méthode pour étudier le mécanisme de ces nouveaux gènes consiste à eux surexpriment endogène dans les cellules cultivées. Surexpression études peuvent fournir des renseignements essentiels quant à la fonction des gènes spécifiques et permettre aux chercheurs de disséquer les voies moléculaires clés.
Une nouvelle méthode pour activer la transcription des gènes de lncRNA repose sur les technologies CRISPR développés initialement par le laboratoire de Gersbach4. Ce protocole a été adapté pour une utilisation en biologie de la lncRNA et pour l’expression de ces gènes dans d’autres systèmes de modèle. Dans le CRISPR surexprimant la technique, une protéine appelée protéine associée à la CRISPR 9 (Cas9) peut être dirigée vers une séquence d’ADN via un gRNA antisens qui est reconnu par Cas9. Normalement, Cas9 induira de clivage de l’ADN ; Toutefois, des mutations Cas9, précédemment mis au point pour la technique de la surexpression, désactiver cette étape5. Quand un activateur de la transcription est fusionné à un Cas9 « morts » (dCas9) et transduites dans les lignées cellulaires, la surexpression endogène de lncRNAs peut être obtenu4,6. L’addition de modifications supplémentaires à la gRNA, permettant aux autres facteurs transcriptionnels lier à la gRNA, augmente l’efficacité du système d’activation gène dCas9 10 fois7. Ce qui est important, il a été démontré que l’activation de la transcription exige proximité (< 200 bp) demarre la transcription des gènes de site, ce qui permet une augmentation spécifique dans les zones riches en gènes7. Contrairement aux technologies de knockout CRISPR, dCas9 et gRNA cassettes doivent être intégrés dans le génome permettant aux cellules de conserver une surexpression sur plusieurs générations. Une méthode pour y parvenir consiste à utiliser des lentivirus pour intégrer les cassettes contenant dCas9 et gRNA. Après intégration, on peut déterminer l’expression du gène lncRNA.
Dans cet article, un protocole pour lncRNA surexpression dans un modèle de cellules T Jurkat sera démontré. Une procédure pas à pas apparaît et peut également être adaptée pour les cellules adhérentes.
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Protocol
Remarque : Il est important de noter que ce protocole utilise des lentivirus réplication déficient. Effectuer la manipulation virale qu’après la formation de sécurité de laboratoire appropriées. Eau de Javel tous les éléments et les surfaces qui entrent en contact avec des virus vivants pendant au moins 10 min après l’avoir manipulé. Utiliser une laboratoire jetables manteau et visage/lunettes de protection, ainsi que des gants doubles, à tout moment. Virus tâches en biosécurité niveau 2 + labs avec certification virale. Dédie hottes de culture de tissus et d’incubateurs à travail virale.
1. conception et production de vector
Remarque : La meilleure façon d’identifier les séquences gRNA consiste à utiliser des outils de conception en ligne (p. ex., http://crispr-era.stanford.edu) (la Figure 1 : conception gRNA). Pour l’expérience représentative qui l’accompagne, une société a conçu et créé les vecteurs gRNA utilisés dans l’expérience représentative. Le plasmide dCas9 a également été acheté en ligne.
- La séquence gRNA est située en amont de la séquence nucléotidique « NGG », où « N » est un nucléotide, qui relève également de 100 paires de bases du site début de transcription. Rechercher des bases de données génétiques par exemple BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) pour la séquence gRNA, pour s’assurer qu’aucun autre site dans le génome avec des séquences semblables (supplémentaire Figure 2 : BLAT). Cela garantira que la séquence gRNA est unique pour le gène d’intérêt (IgE).
- Stocker les plasmides gRNA et dCas9, qui viennent comme des souches bactériennes, à 4 ° C. Strie sur Escherichia coli sur un Luria agar bouillon (LB) sur plaque avec de l’ampicilline (Supplemental tableau 1) et se développer les bactéries pendant une nuit à 37 ° C.
- Prélever une colonie et se développer les bactéries dans 5 mL de LB avec l’ampicilline (Supplemental tableau1) pendant la nuit, secouant vigoureusement la plaque dans un incubateur à 37 ° C. Le lendemain, ajouter 2 mL de bactéries à 200 mL de LB avec l’ampicilline se former dans un flacon de 2 L, agiter vigoureusement le flacon du jour au lendemain dans un incubateur à 37 ° C.
- Tournez en bas les bactéries à 3 724 x g pendant 20 min. Retirez les médias et la place du tube contenant la bactérie sur la glace.
-
Purifier l’ADN d’une bactérie à l’aide d’un kit de purification de plasmide par protocole du fabricant.
Remarque : les kits de purification de plasmides contiennent des propriétaires resuspension tampon, tampon de lyse, tampon de lavage, tampon d’équilibration et tampon d’élution.- Ajouter 10 mL de solution tampon de resuspension du kit pour les bactéries et la pipette les bactéries dans la solution. Puis, ajouter 10 mL de tampon de lyse du kit à la bactérie resuspendue et mélangez-les en renversant le tube. Attendre 5 min pour la lyse de la bactérie ; puis, ajouter 10 mL de tampon de neutralisation glacée du kit pour les bactéries lysées et mélangez-les en renversant le tube.
- Equilibrer la colonne de l’ADN de la trousse avec 10 mL de tampon d’équilibration pendant 5 min. Pour les échantillons dans la colonne de l’ADN du filtre et laissez la solution passent par le filtre.
- Laver les échantillons 2 x avec 30 mL de tampon de lavage et, éluer ensuite, l’ADN avec 30 mL de tampon d’élution dans un tube conique de 15 mL. Lentement la couche 10,5 mL d’isopropanol à température ambiante sur l’ADN éluée, inverser le tube et tourner immédiatement à 16 200 x g pendant 30 min à 4 ° C.
- Retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % dans le granule d’ADN. Resuspendre le culot en effleurant le tube. Pivoter à 16 200 x g pendant 10 min à 4 ° C et utiliser un embout 200 μL pour enlever la plupart de l’éthanol. Sécher le culot pendant 5 min et il resuspendre dans 200 μL d’eau et stocker l’ADN à-20 ° C. La concentration attendue sera > 1 μg/μL.
2. virus génération et particules comte
- Lorsque vous êtes prêt à créer le lentivirus contenant dCAS9, enduire les plats de vitroplants de 100 mm avec 5 mL de 0,01 % poly-L-lysine (Supplemental tableau 1). Enlevez l’excès de liquide complètement des plaques et laissez-les sécher à l’air pendant quelques minutes dans une armoire de sécurité biologique.
- Plaque 5 x 106 cellules HEK 293 t cellules par plat dans 10 mL de Dulbecco complète l’aigle modifié (DMEM) (Supplemental tableau 1) et les incuber une nuit à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Le lendemain, retirez le support de la vaisselle de 293 t HEK et ajouter 10 mL de DMEM complet.
- 6.5 mix μg de plasmide pMDLg/pRRE contenant le gag/pol (composants du virus), 3,5 μg de la pMDG2.G de plasmide contenant le VSV-G (un composant du virus), 2,5 µg le plasmide pRSV-Rev contenant du Rev (un composant du virus), 10 μg d’un terminal long (répéter LTR)-contenant le vecteur gRNA ou un dCas9 contenant LTR vector et ajouter de l’eau pour un volume total de 450 μL. Filtrer le mélange à travers un embout de filtre de 0,2 µm attaché à une seringue.
- Ajouter 50 µL de 2,5 M CaCl2 (Supplemental tableau 1) pour chaque échantillon de transfection d’ADN et mélanger doucement. Filtrer le mélange calcium/ADN grâce à une extrémité du filtre de 0,2 µm attaché à une seringue. Pipeter 500 µL de 2 x HBS (Supplemental tableau 1) dans un tube de polystyrène de 5 mL. Ajoutez les 500 µL ADN/CaCl2 mix goutte à goutte et doucement vortex. Incuber à température ambiante pendant 3 min.
- Lentement, ajouter 1 mL de la suspension /HBS ADN/CaCl2à chaque plat. Immédiatement agiter les plats pour répartir le contenu. Incuber à chaque plat du jour au lendemain dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C.
- Le jour 3, retirer doucement et jeter les médias de la vaisselle. Se laver soigneusement les cellules 1 x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 6 mL de DMEM complet additionné de 20 mM HEPES et le butyrate de sodium 10 mM. Incuber les cellules pendant 5 à 6 h dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
- Laver les cellules 1 x avec du PBS et ajouter 5 mL de DMEM complet avec 20 mM HEPES aux cellules HEK 293 t. Incuber pendant 12 heures du jour au lendemain dans une étuve à2 CO 5 % à 37 ° C.
- Jour 4, recueillir les surnageants de cellules HEK 293 t et filtrer le liquide surnageant. Congeler des portions de 1 mL à-80 ° C.
- Lorsque vous êtes prêt à utiliser le virus, décongeler une partie aliquote de la particule virale contenant des milieux conditionnés (stockés comme décrit dans étape 2.8) sur la glace. Ramener tous les réactifs à température ambiante.
-
Un kit d’enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) p24 permet de quantifier le nombre de particules virales par millilitre.
- Diluer le concentré de lavage de la trousse en ajoutant 19 parties d’eau distillée désionisée. Diluer le contrôle positif de la trousse à 200 ng/mL, avec IPMB 1640 comme diluant et faire les dilutions pour la courbe d’étalonnage en 1,5 mL tubes selon le p24 tableau de dilution ELISA (Supplemental tableau 2).
- Ajouter 20 μL de 5 % Triton X-100 à tous les puits sauf le substrat blanc. Ajouter 200 μl de milieu RPMI 1640 sur les puits de contrôle négatif. Ajouter 200 μl de chaque norme (en double) dans les puits désignés.
- À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la concentration du virus dans les échantillons, à l’aide d’une courbe d’étalonnage. Démarrez la dilution de l’échantillon à 1 : 1 000 et modifier le volume comme nécessaire pour se situer dans la plage de la courbe standard. Diluer les échantillons avec Triton X-100 à une concentration finale de 0,5 % et ajoutez 200 μL de chaque échantillon RPMI 1640 à puits désignés. Sceller la plaque et il incuber pendant 2 h à 37 ° C.
- Laver la plaque 6 x avec 300 μL de 1 x tampon de lavage par puits. Enlever tout excès de liquide en inversant la plaque et tapant sur une serviette en papier. Ajouter 100 μL d’anticorps détecteur du kit pour tous les puits sauf le substrat blanc. Sceller la plaque et il incuber pendant 1 heure à 37 ° C. Laver la plaque et, ensuite, retirez tout excès de liquide en inversant la plaque et en tapant sur une serviette en papier.
- Afin de mesurer les anticorps du détecteur, préparer la peroxydase de raifort streptavidine (SA-HRP) moins de 15 min d’utilisation. Diluer le SA-HRP au 1/100 avec le diluant SA-HRP. Bien mélanger le dilué SA-HRP et ajouter 100 μL de tous les puits sauf le blanc. Sceller et incuber la plaque pendant 30 min à température ambiante.
- Laver la plaque avec 1 x tampon de lavage et taper loin tout le liquide en excès comme à l’étape 2.10.4. Utiliser la solution de substrat d’ortho-phénylènediamine (PPO), qui fournit la peroxydase, les substrats nécessaires pour produire la chimiluminescence, moins de 15 min de préparation. Utiliser un comprimé de DPO à 11 mL de substrat diluant pour chaque plaque.
- Vortex la solution OPD vigoureusement pour dissoudre complètement et protéger de la lumière. Ajouter 100 μL de solution de substrat de DPO dans toutes les loges, y compris le blanc. À l’aide d’un spectrophotomètre, lire l’absorbance à 450 nm immédiatement, répétez ce x 10 à intervalles de 1 s et de prendre la mesure moyenne.
3. dCas9 -VP64 Transduction
- Cellules T Jurkat culture DMEM complet dans une fiole de T75 avec une densité de 2 x 106 cellules dans 15 mL de médias. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
- Tournez en bas les cellules pendant 5 min à 233 x g et, ensuite, les remettre en suspension dans 10 mL de médias de sérum réduit. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées.
- Resuspendre et blanc sur plaque de 1 x 106 cellules Jurkat 5 mL de médias de sérum réduit avec polybrene (Supplemental tableau1) dans une fiole de T75. Ajouter des éléments HEK 293 t-conditionné multimédias contenant 1 x 106 dCas9 contenant des particules virales. Le nombre de particules virales peut être calculé approximativement de la p24 ELISA parce que 1 μg/mL p24 est égal à 1 x 107 particules virales. Placer les flacons dans incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
4. sélection du Clone et création
- Trois jours après l’infection, tournez en bas les cellules à 233 x g pendant 5 min et les remettre en suspension dans 10 mL de DMEM complet avec la puromycine (Supplemental tableau 1). Les cellules dans des flacons de T75 sur plaque et leur culture à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Tous les trois jours, pour une période de 9 jours, tournez en bas les cellules à 233 x g pendant 5 min et remplacez les médias DMEM complet avec la puromycine.
- Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisées. Sur une plaque à 96 puits traitée par culture de tissus, cellules 10 000 plaque de 100 μL de DMEM complet avec la puromycine dans le premier en série et bien diluent 1:1 le contenu des puits suivants avec DMEM complet avec la puromycine. Effectuer des 24 dilutions et répétez ce x 4 par plaque afin de s’assurer qu’il y a un nombre suffisant de cellules par puits. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2.
- Développez les cellules clonales dans deux plaques 24 puits, puis dans une assiette de 6 puits et finalement dans une fiole de T75. Afin de se concentrer sur trois des clones, plaque 2 x 106 cellules / puits d’une plaque de 6 puits pour trois des clones. Plaque de trois autres puits avec des cellules Jurkat nontransduced comme témoins. Mettre les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.
- Pour l’extraction de l’ARN, utiliser un kit d’isolation d’ARN disponible dans le commerce. Tournez en bas les cellules à 233 x g pendant 5 min à température ambiante et retirez le support. Utiliser un embout de pipette 1 mL pour remettre en suspension les cellules dans le 350 μL de tampon de lyse. Ajouter 350 μL d’éthanol à 70 % pour les cellules lysées, bien mélanger avec une pipette de 1 mL et transférer l’échantillon dans la colonne de RNA.
- Filer les lysats à 10 000 x g pendant 1 min, retirez le cheminement et ajouter 700 μL de tampon de lavage basse-rigueur du kit à la colonne. Filer les lysats à 10 000 x g pendant 1 min, retirez le cheminement et ajouter 80 µL de DNase I solution du kit à la colonne ; laisser les échantillons à incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Filer les lysats à 10 000 x g pendant 1 min, retirez le cheminement et ajouter 700 µL de tampon de lavage haute-rigueur du kit à la colonne. Filer les lysats à 10 000 x g pendant 1 min, retirez le cheminement et ajouter 700 µL de tampon de lavage basse-rigueur à la colonne.
- Retirer le tube de prélèvement de la colonne et le transférer à un nouveau tube de prélèvement. Faites tourner les lysats à 10 000 x g pendant 1 min et, ensuite, transférer la colonne RNA dans un tube de 1,5 mL. Ajouter 50 µL d’eau dans la colonne et un essorage à 10 000 x g pendant 1 min.
- Un spectrophotomètre permet de quantifier la concentration de l’ARN. Attendre la concentration entre 100 et 500 ng/µL, avec une absorbance de 260/280 entre 1,9 et 2,1. Magasin l’ARN à-80 ° C.
- Dans 250 µL tubes, ajoutez 1 µg d’ARN, 4 µL de tampon de synthèse ADN (cDNA) complémentaire, 1 µL de la transcriptase inverse et l’eau pour un volume final de 20 µL. n’inclure aucun contrôle de la transcriptase inverse. Dans un thermocycleur, faire la synthèse de cDNA à 42 ° C pendant 30 min et à 95 ° C pendant 5 min inactiver la transcriptase inverse. Diluer le cDNA avec 60 µL d’eau après la synthèse.
- Préparer des réactions en chaîne par polymérase (PCR) contenant 5 µL de SYBR green, 4 µL d’ADNc, 0,5 µL d’apprêt avant (10 µM) et 0,5 µL d’apprêt inverse (10 µM). Exécutez la PCR comme suit : étape 1 = 95 ° C pendant 3 min, étape 2 = 95 ° C pendant 10 s, étape 3 = 60 ° C pendant 10 s et puis, répéter des étapes 2 et 3 pour 30 x.
Remarque : La séquence pour l’apprêt avant de dCas9 est 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA et la séquence pour l’apprêt inverse dCas9 est 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. L’amorce vers l’avant pour l’Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) est 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT et l’apprêt inverse est 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA Transduction, sélection, Clone , création et le dépistage
- Retransduce les cellules Jurkat-dCas9 validés avec virus contenant gRNA énoncées à l’article 3. Sélectionner les cellules de DMEM avec hygromycine (Supplemental tableau1) pendant 10 jours. Tournez en bas les cellules et modifier les médias tous les 3 jours.
- Effectuer une dilution en série de cellules (comme indiqué au point 4.2) et d’étendre les colonies individuelles (comme indiqué au point 4.3). Purifier l’ARN à partir des colonies exactement comme indiqué au point 4.5 et effectuer la synthèse de cDNA comme indiqué au point 4.9. Effectuer une PCR en temps réel contre les pouvoirs publics indiens et HPRT1 ou un gène de ménage appropriés, de même pour la PCR décrit à l’étape 4.10, sauf dans ce cas, image que les puits chaque cycle après l’étape 3.
- Utilisez la méthode du seuil (Ct) cycle comparative pour déterminer pli changement dans le gouvernement de l’Inde8. En bref, utilisez l’équation suivante pour calculer les niveaux de transcription relatif (RTLs) : 2-(moyenne Ct de GOI – moyenne Ct du gène de ménage). Puis, calculer la moyenne RTL des contrôles et diviser toutes les valeurs RTL par la commande moyenne RTL pour produire un pli des changements par rapport à des échantillons de contrôle.
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Representative Results
Un système de double vecteur de surexprimer le lncRNA IFNG-AS1
L’expérience de l’exemple dans ce manuscrit est la surexpression d’un système de modèle de cellules T Jurkat exprimant le lncRNA AS1-IFNG9. IFNG-AS1 est un lncRNA associé à la maladie intestinale inflammatoire, qui a été vu à réglementer l’interféron Gamma10. Le gène IFNG-AS1 contient trois variants d’épissage qui utilisent le même site d’initiation transcriptionnelle (Figure 1 a). Par conséquent, les séquences de gRNA dont 10 et 100 bp loin du site d’initiation transcriptionnelle et ayant une séquence « NGG » en amont ont été utilisées pour orienter le complexe Cas9-activation du locus transcriptionnelle de IFNG-AS1 (Figure 1 a). Un système de deux-plasmide servait à transduce soit dCas9 soit gRNAs/rehausseurs en cellules comme un plasmide seul rend particule virale génération difficile en raison de la taille de plasmide (Figure 1 b). Pour activer la sélection des cellules transduites-double, le vecteur dCas9 contenue un gène de résistance puromycine (aminonucléoside), et le plasmide contenant gRNA contenait un gène de résistance à l’hygromycine (aminosides). gRNAs ont été fusionnés en une séquence d’échafaudage MS2 permettant à la protéine d’échafaudage MS2 à lier le gRNAs. Fondue à la MS2 protéine sont des activateurs transcriptional supplémentaires pour améliorer la surexpression d’IFNG-AS17. À l’aide de ces vecteurs, particules virales peuvent être créées pour transmettre ce système surexpression dans la plupart des lignées de cellules.
Titrage viral et criblage de colonie
Après avoir généré les plasmides contenant dCas9 et gRNA, des purifications de plasmide ont été réalisées et lentivirus ont été créés. Comme lentivirus intègrent au hasard leurs cassettes dans le génome, une quantification du nombre de particules virales permet le moins nombre d’intégrations possibles. Pour ce faire, conditionné-médias-contenant des virus ont été mesurées avec un p24 kit ELISA, permettant le calcul du nombre de virions par millilitre. Après avoir mesuré, les surnageants virales avaient près de 1 µg/mL de p24, ce qui a permis l’utilisation de 100 µL de virus pour transmettre les cellules Jurkat. Après transduction, cellules sélectionnées antibiotique ont été dilués en série et clones ont été élargies. Cas9 expression est ensuite analysée par PCR en temps réel et électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 2 b). Les deux clones sélectionnés étaient positifs pour l’expression de Cas9. Pour confirmer l’expression de l’ARNm, transcriptase inverse a été omise de la réaction de cDNA (Figure 2 b). Amorces contre HPRT1 ont été utilisées pour confirmer la présence d’ARN dans les cellules nontransduced.
Mesure de l’expression des gènes IFNG-AS1
À l’aide de la dCas9 clones comme une ligne de cellules parentales, les cellules ont été transduites avec un virus nontargeting gRNA contenant ou un virus contenant gRNAs contre IFNG-AS1. Après gRNA transduction, sélection et création de clone analogue à la création de ligne dCas9 cellulaire, l’expression de IFNG-AS1 a été mesurée pour vérifier la surexpression. IFNG-AS1 produit trois variants d’épissage, chacun d'entre eux peut être détecté individuellement avec des amorces spécifiques de transcription (rouges) ou contre toutes les retranscriptions de IFNG-AS1 connues (bleu) (Figure 3 a). Toutes les courbes de fluorescence sont exponentielles avec HPRT1 pour atteindre que l’exponentielle phase (ou Ct) dans un demi cycle entre le contrôle et les cellules exprimant IFNG-AS1-gRNA (Figure 3 bC). Amorces contre toutes les retranscriptions de IFNG-AS1 connues ont été les plus détectable entre les expériences avec des mesures d’augmentations 20 fois IFNG-AS1 (Figure 3 b). Alors que les amorces contre transcriptions contre 1 et 2 avec succès amplifié dans les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC), ces transcriptions n’étaient pas détectables dans les cellules Jurkat (données non présentées). Toutefois, lorsque la troisième transcription de IFNG-AS1 n’est décelable dans l’ARN concentré, un cinq-dix fois augmentation notable de IFNG-AS1 niveaux a été observé. Ces données suggèrent un épissage alternatif de IFNG-AS1 dans Jurkat cellules existent par rapport aux cellules primaires. Amorces contre IFNG-AS1 détecté des augmentations de ce gène, validant ainsi le système activateur de surexpression CRISPR.
Figure 1 : un système de double vecteur de surexprimer le lncRNA AS1-IFNG. (A) A schéma de la structure du gène IFNG-AS1 et la relation entre les sites de fixation guide RNA (gRNA) et le site d’initiation transcriptionnelle (TSS). (B) les caractéristiques des vecteurs gRNA et dCAS9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : titrage Viral et criblage de colonie. (A) un exemple p24 ELISA standard courbe pour les médias contenant des lentivirus, conditionnés. Les points noirs représentent des échantillons standards et le rouge points échantillons inconnus. (B) après que transduction, en sélectionnant et générant des colonies, PCR en temps réel et électrophorèse sur gel contre dCas9 ont été réalisés sur l’ARN soit nontransduced cellules Jurkat (parentales) ou dCas9-transduites clones. Aucun contrôle de la transcriptase inverse (RT No) ont été effectuées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : mesure de l’expression des gènes IFNG-AS1. (A) A diagramme des relations entre les paires d’amorces et de variantes de transcription. Les flèches rouges représentent des amorces de transcription spécifiques, tandis que les flèches bleues indiquent les amorces contre toutes les transcriptions connues. (B et C) courbes représentatives de PCR moyennes et pli-changement quantitatives pour le contrôle et les cellules surexprimant IFNG-AS1. RFU = unités de fluorescence relative. N = 3 échantillons par groupe. Moyenne ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. Un étudiant t-test a été utilisé pour calculer la p-valeurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : gRNA design S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Supplémentaire Figure 2 : BLAT S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
La Table 1 : Solutions S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Supplémentaire tableau 2 : les dilutions ELISA S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce manuscrit présente un protocole permettant d’utiliser l’activation CRISPR pour surexprimer lncRNAs in vitro. Il s’agit d’une technique particulièrement importante lorsque l'on étudie les ARN long non codantes puisque le produit de transcriptomique est l’unité fonctionnelle. Après surexpression, le chercheur peut, ensuite, utiliser ces cellules pour augmenter le rapport signal-bruit lorsque l'on étudie les partenaires de liaison et même de mesurer les conséquences cellulaires d’augmentation du lncRNAs. En outre, comme lncRNAs agissent fréquemment sur les cis-gènes, cette technique endogène surexpression permet ces événements soient étudiées11,,12.
Ce manuscrit met en évidence un protocole généralisé pour gRNA création et génération de lentivirus, transduction et la sélection, et un exemple représentatif de la surexpression de lncRNA dans une lignée de cellules T du sang périphérique a été décrit. En outre, cette technique a déjà été démontrée réussisse à OS-moelle osseuse des cellules immunitaires13, neurones7, les cellules souches embryonnaires de souris14et les cellules épithéliales de rein4. Alors que ce protocole est généralement applicable pour la plupart des lignées de cellules, les cellules qui sont difficiles à transmettre peuvent nécessiter des titres individuels qu’il permette à des taux plus élevés d’infection. En outre, il est important d’effectuer des courbes de tuer aux antibiotiques lors de l’utilisation de nouvelles lignées de cellules, comme ce protocole utilise une stratégie de sélection positive.
À noter, ce protocole a plusieurs aspects techniques qui nécessitent une attention particulière. Reproductible et cohérente de pipetage pour PCR en temps réel sont essentiel pour établir des résultats reproductibles. Même de petites différences dans les volumes provoquera des valeurs très variables, rendant l’interprétation difficile. En plus d’une conception d’amorces PCR quantitative appropriée, contrôles, y compris le contrôle de la transcriptase-inverse-non pour les amorces PCR en temps réel, sont essentiels car ils confirment que l’ARN étant quantifiée n’est pas l’ADN génomique. La sélection des gènes domestiques pour PCR en temps réel est également importante pour accomplir adéquatement ces expériences. Tandis que HPRT1 a été choisi dans le présent protocole, les autres gènes d’intérêts ciblés par cette technique pourraient altérer HPRT115. Une sélection rigoureuse des gènes domestiques selon ces facteurs devrait prendre en considération.
Il y a quelques inconvénients à activation CRISPR et à des aspects particuliers du présent protocole. Une des limitations potentielles est l’expression de transcriptions dans des régions très riches en gènes comme autres gènes voisins pourraient être allumés. Il est possible que les voisins des gènes à proximité peuvent être activé et contrôles doivent être effectuées pour évaluer ce. En outre, autres limitations incluent le manque de liaison pour gRNAs particulière à une séquence d’ADN donnée. La sélection des multiples gRNAs devrez peut-être identifier le gRNA approprié à l’expression de la voiture. Une autre restriction au système est que la cellule d’intérêt doit avoir la capacité à conduire les promoteurs dans les cassettes pour conduire l’expression du gRNAs et dCas9. Pour les études présentées ici, le modèle de cellules T Jurkat était capable de conduire l’expression de ces composants pour un système de surexpression réussie.
Idéalement, le protocole décrit ici devrait être couplé avec d’autres informations concordantes, comme simple transcription surexpression données et effets fonctionnels d’études démontable ou coup de grâce, pour soutenir le cas pour les conclusions suivantes. Cette technique offre un moyen fiable de surexprimant aucun gène dans un type particulier de cellules. Compte tenu des limites de la biologie des lncRNA, tels que la conservation de l’espèce médiocre, techniques comme celle décrite ici sont essentiels à l’exploration de leur fonction dans les cellules concernées. Cette étude s’est concentrée sur un lncRNA qui a été impliqué dans la physiopathologie de la maladie inflammatoire de l’intestin, mais sert de modèle d’étudier la fonction des autres lncRNAs en biologie humaine de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
C.P. est pris en charge par DK60729 RO1 et P30 DK 41301-26. D.P. est pris en charge par un Crohn & Colitis Foundation (CCFA) career development award, CURE : centre de recherches des maladies digestives (DDRC) DK41301 et UCLA clinique et translationnelle Science Institute (ILEC) UL1TR0001881. Le noyau de virologie UCLA a été financé par le centre de recherche sida (CFAR) accorder 5P 30 AI028697. Les Technologies intégrées moléculaire de UCLA core a été pris en charge par CURE/P30 accorder DK041301. Ce travail a été également soutenu par l’Institut de sida de UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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