Summary
Traditionelle cDNA-basierte Überexpression Techniken haben eine begrenzte Anwendbarkeit für die Überexpression von lange forensisches RNAs aufgrund ihrer mehrere Spleiß-Formulare mit potenziellen Funktionalität. Dieser Beitrag berichtet ein Protokoll mit CRISPR-Technologie mehrere Splice-Varianten eine lange nichtcodierender RNA overexpress.
Abstract
Lange nichtcodierender RNA (LncRNA) Biologie ist ein neues und spannendes Forschungsfeld, mit der Anzahl der Publikationen aus diesem Bereich exponentiell seit 2007. Diese Studien haben bestätigt, dass LncRNAs in fast allen Krankheiten verändert sind. Studieren die funktionalen Rollen für LncRNAs im Zusammenhang mit der Krankheit bleibt jedoch schwierig, da der Mangel an Protein-Produkte, Gewebe-spezifischen Ausdruck, geringe Expression Ebenen Komplexität im Spleiß Formen und mangelnde Konservierung zwischen den Arten. Die artspezifischen Ausdruck gegeben, sind LncRNA Studien oft auf Humanforschung Kontexte beschränkt wenn Krankheitsprozesse zu studieren. Da LncRNAs auf molekularer Ebene funktionieren, ist Einweg, LncRNA Biologie zu sezieren, entfernen die LncRNA oder overexpress LncRNA und Maßnahme zelluläre Effekte. In diesem Artikel wird eine schriftliche und visualisierte Protokoll zum LncRNAs in-vitro-overexpress vorgestellt. Als repräsentatives Experiment zeigt ein LncRNA Zusammenhang mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, Interferon-Gamma-Antisense-1 (IFNG-AS1), in einem Jurkat T-Zell-Modell überexprimiert werden. Um dies zu erreichen, wird die aktivierende gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) Technik zur Überexpression an der endogenen genomic Loci zu ermöglichen. Die aktivierende CRISPR-Technik zielt auf eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die transkriptionelle Startseite eines Gens, eine robuste Überexpression von mehreren LncRNA Spleiß Formen ermöglichen. Dieses Verfahren wird in drei Schritten, nämlich (i) Guide RNA (gRNA) Design und Vektor Bau, (Ii) Virus-Generation und Transduktion und (Iii) Kolonie Screening für die Überexpression unterteilt werden. Für diese repräsentative Experiment größer als 20-fold Verbesserung der IFNG-AS1 in Jurkat T-Zellen beobachtet wurde.
Introduction
Während die biomedizinischer Forschung auf Protein-kodierenden Transkripte konzentriert hat, besteht die Mehrheit der transkribierten Gene eigentlich forensisches RNAs (Ensembl Release 93). Aktueller Forschung fängt an, dieses Feld mit der Zahl der Publikationen über LncRNAs in Krankheitsprozesse steigt exponentiell zwischen 2007 und 20171zu erkunden. Diese Publikationen zeigen, dass viele LncRNAs mit Krankheit verbunden sind. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der diese LncRNAs schwer, aufgrund ihrer vielfältigen Funktionen im Vergleich zu mRNAs zu studieren. Erschwerend für das Verständnis der Rolle der LncRNAs bei Krankheit, werden LncRNAs oft auf einem niedrigeren Niveau als Kodierung RNAs2ausgedrückt. Darüber hinaus sind LncRNAs schlecht konserviert, die Grenzen der funktionellen Studies in Human-Zell-Linie-basierte Techniken3. Eine Methode, um den Mechanismus dieser neuartigen Gene studieren soll sie endogen in kultivierten Zellen overexpress. Überexpression Studien bieten wichtige Informationen über die Funktion bestimmter Gene und erlauben es, wichtige molekulare Signalwege zu sezieren.
Eine neue Methode zur Aktivierung der Transkription von Genen LncRNA basiert auf CRISPR-Technologien, die zunächst von Gersbach Labor4entwickelt. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in LncRNA Biologie und für den Ausdruck dieser Gene in andere Modellsystemen angepasst. In der CRISPR überexprimierenden Technik kann ein Protein namens CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9) auf eine DNA-Sequenz über eine antisense gRNA gerichtet werden, die vom Cas9 erkannt wird. Normalerweise wird Cas9 DNA Spaltung induzieren; Mutationen im Cas9, die zuvor für die Überexpression Technik entwickelt deaktivieren jedoch diesen Schritt5. Wenn eine transcriptional Aktivator ist verschmolzen zu einem "Toten" Cas9 (dCas9) und ausgestrahlt in Zelllinien, die endogene Überexpression des LncRNAs kann erreicht4,6. Die Zugabe von zusätzlichen Änderungen an gRNA, ermöglichen zusätzliche transcriptional Faktoren binden an die gRNA erhöht die Wirksamkeit der dCas9-gen-Aktivierungs-System 10-divisibel7. Wichtiger ist, es konnte gezeigt werden, dass transkriptionelle Aktivierung Nähe erfordert (< 200 bp) auf die transkriptionelle Website Gene, ermöglichen eine spezifische Hochregulation in gen-reiche Gebiete7beginnen. Im Gegensatz zu CRISPR Ko-Technologien dCas9 und gRNA Kassetten in das Genom, um Zellen weiterhin eine Überexpression über mehrere Generationen hinweg ermöglichen integriert werden müssen. Eine Methode, um dies zu erreichen ist Lentiviren verwenden, um die dCas9 - und gRNA-haltigen Kassetten zu integrieren. Nach der Integration kann die LncRNA Genexpression ermittelt werden.
In diesem Artikel wird ein Protokoll für LncRNA Überexpression in einem Jurkat T-Zell-Modell demonstriert. Eine Schrittanleitung wird angezeigt und kann auch auf adhärente Zellen angepasst werden.
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Protocol
Hinweis: Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll Replikation-defizienten Lentiviren verwendet. Durchführen Sie virale Behandlung erst nach entsprechenden Labor-Sicherheitstraining. Bleichen Sie alle Gegenstände und Flächen, die in Kontakt mit Phasenviren für ein Minimum von 10 min nach der Handhabung kommen. Ein Einweg-Lab Coat und Gesicht/Auge Schutz, sowie doppelte Handschuhe, zu allen Zeiten. Arbeiten Sie Virus-in Biosafety Level 2 + Labors mit viralen Zertifizierung. Widmen Sie Gewebekultur Hauben und Inkubatoren virale Arbeit.
(1) Vector Design und Generation
Hinweis: Der beste Weg, um gRNA Sequenzen zu identifizieren ist, Online-Design-Tools (z. B. http://crispr-era.stanford.edu) zu verwenden (ergänzende Abbildung1: gRNA Design). Für die begleitenden repräsentativen Experiment ein Unternehmen konzipiert und erstellt die gRNA Vektoren in der repräsentativen Experiment verwendet. Das dCas9-Plasmid wurde auch online erhältlich.
- Die gRNA Sequenz befindet sich stromaufwärts der Nukleotid-Sequenz "NGG", wo "N" jedem Nukleotid ist auch innerhalb von 100 Basenpaare des Standortes transkriptionelle Start. Die gRNA-Sequenz, um sicherzustellen, dass im Genom mit ähnlichen Sequenzen gibt es keine anderen Seiten genetischen Datenbanken wie z. B. BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) suchen (ergänzende Abbildung2: BLAT). Dadurch wird sichergestellt, dass die gRNA-Sequenz für das gen des Interesses (GOI) eindeutig ist.
- Speichern der gRNA und dCas9 Plasmide, die kommen als bakterielle Stubs, bei 4 ° C. Streifen aus Escherichia coli auf eine Luria Brühe (LB) Agar-Platte mit Ampicillin (Supplemental Tabelle1) und wachsen die Bakterien über Nacht bei 37 ° C.
- Wählen Sie eine Kolonie und wachsen Sie die Bakterien in 5 mL LB mit Ampicillin (Supplemental Tabelle1) über Nacht kräftig schütteln die Platte in einem Inkubator 37 ° C. Am nächsten Tag, fügen Sie 2 mL auf 200 mL LB mit Ampicillin Bakterien wachsen in eine 2 L-Flasche kräftig schütteln der Flasche über Nacht in einem Inkubator 37 ° C.
- Spin-down der Bakterien 3.724 x g für 20 min. Entfernen der Medien und Ort der Röhre, die die Bakterien auf dem Eis.
-
Bakterielle DNA mit einem Plasmid-Reinigung-Kit pro Protokoll des Herstellers zu reinigen.
Hinweis: die Plasmid-Reinigung-Kits enthalten proprietäre Wiederfreisetzung Puffer, Lyse Puffer Waschpuffer, Gleichgewichtherstellung Puffer und Elution Puffer.- Hinzu kommen 10 mL Wiederfreisetzung Puffer aus dem Bausatz der Bakterien und pipettieren die Bakterien in die Lösung. Dann die resuspendierte Bakterien fügen Sie 10 mL Lyse Puffer aus dem Kit hinzu und mischen sie durch das Rohr zu invertieren. Warten Sie 5 min um die Bakterien zu lösen; dann die lysierten Bakterien fügen Sie 10 mL eiskaltes Neutralisation Puffer aus dem Kit hinzu und mischen sie durch das Rohr zu invertieren.
- Equilibrate der DNA-Spalte aus dem Kit mit 10 mL Gleichgewichtherstellung Puffer für 5 min. Gießen die Proben in der DNA-Spalte filtern und lassen Sie die Lösung, die den Filter passieren.
- Waschen Sie die Proben 2 X mit 30 mL Puffer zu waschen und dann die DNA mit 30 mL Elution Puffer in einem 15 mL konische Röhrchen eluieren. Langsam Schicht 10,5 mL Isopropanol bei Raumtemperatur auf der eluierten DNA, invertieren Sie das Rohr und drehen Sie es sofort bei 16.200 X g für 30 min bei 4 ° C.
- Entfernen des Überstands und 1 mL 70 % igem Ethanol in das DNA-Pellet. Aufzuwirbeln Sie das Pellet durch Streichen des Schlauchs. Drehen sie bei 16.200 X g für 10 min bei 4 ° C und verwenden Sie 200 μL Pipettieren Tipp, um die meisten des Ethanols zu entfernen. Trocknen Sie das Pellet für 5 min an der Luft und in 200 μl Wasser Aufschwemmen Sie und speichern Sie die DNA bei-20 ° C. Die erwartete Konzentration werden > 1 μg/μL.
(2) Virus Generation und Partikel Graf
- Wenn Sie fertig sind erstellen Sie die dCAS9-haltigen Lentivirus, Mantel 100 mm Gewebekultur Schalen mit 5 mL 0,01 % Poly-L-Lysin (Supplemental Tabelle1). Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit gründlich von den Platten und lassen Sie sie an der Luft trocknen für ein paar Minuten in eine biologische Kabinett.
- Platte 5 x 106 HEK 293T Zellen pro Schale in 10 mL komplette Dulbecco modifiziert Adlers Medium (DMEM) (zusätzliche Tabelle1) und inkubieren sie über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO2. Am nächsten Tag, entfernen Sie das Medium aus der HEK 293T Gerichte und 10 mL komplette DMEM.
- Mix 6,5 μg des Plasmids pMDLg/pRRE mit Gag/Pol (Komponenten des Virus), 3,5 µg das Plasmid pMDG2.G mit dem VSV-G (eine Komponente des Virus), 2,5 µg Plasmid pRSV-Rev mit Rev (eine Komponente des Virus), 10 μg eine lange terminal repeat ( LTR)-Vektor und fügen Sie Wasser auf ein Gesamtvolumen von 450 μL gRNA Vektor oder eine LTR-haltigen dCas9 enthalten. Filtern Sie die Mischung durch ein 0,2 µm Filter Tipp mit einer Spritze verbunden.
- Jede DNA-Probe Transfektion 50 µL 2,5 M CaCl2 (Supplemental Tabelle1) hinzufügen und vorsichtig mischen. Filtern Sie die Kalzium/DNA-Mischung durch eine 0,2 µm Filterspitze an einer Spritze befestigt. Pipettieren 500 µL 2 X HBS (zusätzliche Tabelle1) in einer 5 mL Polystyrol Röhrchen. Fügen Sie die 500 µL DNA/CaCl2 Mischung tropfenweise und sanft Wirbel. Bei Raumtemperatur für 3 min inkubieren.
- Fügen Sie 1 mL der DNA/CaCl2/HBS Suspension langsam jedes Gericht hinzu. Sofort wirbeln die Gerichte um den Inhalt gleichmäßig zu verteilen. Inkubieren Sie jedes Gericht über Nacht in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° c
- Am 3. Tag langsam entfernen Sie und entsorgen Sie die Medien von den Speisen. Waschen Sie sorgfältig die Zellen 1 X mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Hinzugeben Sie 6 mL komplette DMEM mit 20 mM HEPES und 10 mM Natrium Butyrat ergänzt. Inkubieren Sie die Zellen für 5 – 6 h in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° c
- Waschen Sie die Zellen 1 X mit PBS und 5 mL komplette DMEM mit 20 mM HEPES, die HEK 293T Zellen. 12 h über Nacht in einem 5 % CO2 Inkubator bei 37 ° c inkubieren
- Am 4. Tag sammeln die HEK 293T Zelle Überstände und Filtern des Überstands. 1 mL Aliquote bei-80 ° c eingefroren
- Wenn Sie bereit sind, das Virus zu verwenden, tauen Sie ein Aliquot der Viruspartikel mit konditionierten Medien (gespeichert als in beschrieben Schritt 2,8) auf Eis auf. Bringen Sie alle Reagenzien auf Raumtemperatur.
-
Verwenden Sie eine p24 Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Kit, um die Zahl der Viruspartikel pro Milliliter zu quantifizieren.
- Verdünnen Sie das Wäsche-Konzentrat aus dem Kit durch Hinzufügen von 19 Teilen destilliertem, entionisiertem Wasser. Die positive Kontrolle aus dem Kit auf 200 ng/mL zu verdünnen, mit RMPI 1640 als Verdünnungsmittel, und machen die Verdünnungen für Standardkurve in 1,5 mL Röhrchen nach der p24 ELISA Verdünnung Tabelle (Supplemental Tabelle 2).
- Fügen Sie 20 μl 5 % Triton x-100 in alle Vertiefungen mit Ausnahme des Substrats leer. Die Negativkontrolle Brunnen 200 μL von RPMI 1640 hinzufügen. Fügen Sie 200 μL jeder Norm (in zweifacher Ausfertigung) in die dafür vorgesehenen Vertiefungen.
- Mit einem Spektralphotometer, Messen Sie die Konzentration des Virus in die Proben mit Hilfe einer Standardkurve. Beginnen Sie der Probenverdünnung bei 1:1,000 und ändern Sie die Lautstärke als notwendig, um innerhalb des Bereichs der Standardkurve. Verdünnen Sie die Proben mit Triton x-100, eine Endkonzentration von 0,5 % und fügen Sie 200 μL jeder Probe in RPMI 1640 in dafür vorgesehenen Vertiefungen. Die Dichtplatte und 2 h bei 37 ° c inkubieren
- Waschen Sie die Platte 6 X mit 300 μl 1 x Waschpuffer pro Bohrloch. Entfernen Sie jede überschüssigen Flüssigkeit durch die Platte umdrehen und tippen sie auf ein Papiertuch. Alle Quellen außer dem Substrat leer 100 μL der Detektor Antikörper aus dem Kit hinzufügen. Die Dichtplatte und 1 h bei 37 ° c inkubieren Waschen Sie die Platte und dann entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch die Platte umdrehen und tippen sie auf ein Papiertuch.
- Um den Detektor Antikörper messen, bereiten Sie Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (SA-HRP) innerhalb von 15 Minuten der Nutzung. Verdünnen Sie die SA-HRP bei 1: 100 mit SA-HRP Verdünnungsmittel. Die verdünnte SA-HRP gründlich mischen und alle Brunnen mit Ausnahme der Blank 100 μL hinzufügen. Dichtung und die Platte für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Platte mit 1 x Waschpuffer und entfernt Tippen Sie überschüssige Flüssigkeit wie in Schritt 2.10.4. Verwenden Sie ortho-Phenylendiamin (OPD) Substrat-Lösung, die die Peroxidase bietet die erforderlichen Substrate Chemilumineszenz, innerhalb von 15 Minuten Vorbereitungszeit zu produzieren. Verwenden Sie eine OPD Tablette bis 11 mL Substrat Verdünnungsmittel für jede Platte.
- Wirbel der OPD Lösung kräftig vollständig auflösen und vor Licht schützen. Alle Brunnen, einschließlich der Blank fügen Sie 100 μL der OPD Substratlösung hinzu. Mit einem Spektralphotometer, lesen Extinktion bei 450 nm sofort, diese 10 X 1 s Abständen wiederholen, und nehmen Sie das durchschnittliche Maß.
3. dCas9 -VP64 Transduktion
- Kultur-Jurkat T-Zellen im kompletten DMEM in einem T75-Kolben mit einer Dichte von 2 x 106 Zellen in 15 mL der Medien. Kultur der Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.
- Spin-down der Zellen für 5 min bei 233 X g , und sie dann in 10 mL reduzierte Serum Medien Aufschwemmen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
- Aufschwemmen und Platte 1 x 106 Jurkat Zellen in 5 mL reduzierte Serum-Medien mit Polybrene (zusätzliche Tabelle1) in einem Kolben T75. Fügen Sie HEK 293T konditioniert Medien mit 1 x 106 dCas9-haltigen Viruspartikel hinzu. Die Zahl der Viruspartikel errechnet werden etwa aus der p24 ELISA da 1 μg/mL p24 1 x 107 Viruspartikel gleich ist. Legen Sie die Fläschchen in 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2.
4. Auswahl und Klon - Erstellung
- Drei Tage nach der Infektion, spin-down der Zellen bei 233 X g für 5 min und Aufschwemmen ihnen in 10 mL komplette DMEM mit Puromycin (Supplemental Tabelle1). Die Zellen in T75 Korbflaschen Platte und Kultur sie bei 37 ° C mit 5 % CO2. Jeden dritten Tag, für einen Zeitraum von 9 Tagen, spin-down der Zellen bei 233 X g für 5 min und ersetzen Sie die Medien mit kompletten DMEM mit Puromycin.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler. Auf einer 96-Well-Platte mit Gewebekultur behandelt verdünnen Platte 10.000 Zellen in 100 μL des kompletten DMEM mit Puromycin in den ersten 1:1 der Inhalt der folgenden Brunnen mit kompletten DMEM mit Puromycin gut und seriell. Führen Sie 24 Verdünnungen und wiederholen Sie diese 4 X pro Platte um sicherzustellen, dass es eine ausreichende Anzahl von Zellen pro Bohrloch. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2.
- Klonale Zellen in zwei 24-Well-Platten, dann in einem 6-Well-Platte, und schließlich in einem T75 Kolben zu erweitern. Um sich auf drei der Klone, Platte 2 x 106 Zellen pro Bohrloch einer 6-Well-Platte für drei der Klone zu konzentrieren. Die anderen drei Brunnen-Platte mit nontransduced Jurkat-Zellen als Kontrollen. Setzen Sie die Zellen in einer Zelle Kultur Inkubator über Nacht.
- Verwenden Sie für RNA-Extraktion eine handelsübliche RNA Isolierungskit. Spin-down der Zellen bei 233 X g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie das Medium. Verwenden Sie einen 1 mL Pipettieren Tipp um Zellen in 350 μL der Lyse Puffer Aufschwemmen. Die lysierten Zellen 350 μL 70 % Ethanol hinzu, mischen mit einer 1 mL pipettieren, und übertragen Sie die Probe auf der RNA-Spalte.
- Spin Lysates bei 10.000 X g für 1 min, fließen-durch entfernen und Hinzufügen der Spalte 700 μl Waschpuffer Low-Stringenz aus dem Kit. Drehen der Lysates bei 10.000 X g für 1 min, der durchströmten entfernen und hinzufügen 80 µL DNase ich Lösung aus dem Kit auf die Spalte; lassen Sie die Proben für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Spin Lysates bei 10.000 X g für 1 min, fließen-durch entfernen und Hinzufügen der Spalte 700 µL Waschpuffer High-Stringenz aus dem Kit. Spin Lysates bei 10.000 X g für 1 min, entfernen der durchströmten und 700 µL Waschpuffer Low-Stringenz in die Spalte hinzufügen.
- Entfernen Sie die Spalte aus dem Sammelrohr und überträgt es auf eine neue Kollektion-Röhre. Drehen Sie die Lysates bei 10.000 X g für 1 min und übertragen Sie anschließend die RNA-Spalte auf einen 1,5 mL-Tube. Die Spalte und Spin bei 10.000 X g für 1 min 50 µL Wasser hinzufügen.
- Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration von RNA zu quantifizieren. Die Konzentration zwischen 100 – 500 ng/µL, mit einem 260/280 Extinktion zwischen 1,9-2,1 zu erwarten. Speichern der RNS bei-80 ° C.
- Rohre, fügen 1 µg RNA, 4 µL komplementäre DNA (cDNA) Synthese Puffer, 1 µL Reverse Transkriptase in 250 µL und Wasser zu einem Endvolumen von 20 µL. enthalten keine Reverse-Transkriptase-Steuerelemente. Synthetisieren Sie in einem Thermocycler cDNA bei 42 ° C für 30 min und bei 95 ° C für 5 min, die Reverse Transkriptase zu inaktivieren. Verdünnen Sie die cDNA mit 60 µL Wasser nach der Synthese.
- Bereiten Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit 5 µL SYBR grün, 4 µL cDNA, 0,5 µL forward Primer (10 µM) und 0,5 µL des rückwärts-Primer (10 µM vor). Führen Sie die PCR wie folgt: 1 = 95 ° C für 3 min Schritt, Schritt 2 = 95 ° C für 10 s, Schritt 3 = 60 ° C für 10 s und dann, wiederholen Sie die Schritte 2 und 3 für 30 X.
Hinweis: Die Reihenfolge für die dCas9 nach vorne Grundierung ist 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA und ist die Reihenfolge für die dCas9-rückwärts-Primer 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Der forward Primer für Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase-1 (HPRT1) ist 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT und die rückwärts-Primer 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA Transduktion, Auswahl, Klon , Schöpfung, und Screening
- Retransduce Sie die validierten Jurkat-dCas9 Zellen mit gRNA-haltige Viren, wie in Abschnitt 3 dargelegt. Markieren Sie Zellen in DMEM mit Hygromycin (Supplemental Tabelle1) für 10 Tage. Spin-down der Zellen und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.
- Führen Sie eine serielle Verdünnung von Zellen (wie in Schritt 4.2 beschrieben) und erweitern Sie einzelne Kolonien (wie in Schritt 4.3 beschrieben) zu. RNA aus den Kolonien genau wie unter Punkt 4.5 beschrieben reinigen und cDNA Synthese wie unter Punkt 4.9 beschrieben durchführen. Real-Time PCR gegen die indische Regierung führen und HPRT1 oder eine entsprechende Housekeeping gen, ähnlich wie bei der PCR beschrieben im Schritt 4.10, außer in diesem Fall Bild, das jeder Brunnen nach Schritt 3 Zyklus.
- Verwenden Sie die vergleichende Zyklus Schwelle (Ct) Methode zur Falte Veränderung der GOI-8. Kurz, die folgende Gleichung verwenden, um relative Transkript Ebenen (RTLs) berechnen: 2-(durchschnittliche Ct GOI-durchschnittliche Ct der Hauswirtschaft gen). Dann berechnen Sie die durchschnittliche RTL der Steuerelemente und teilen Sie alle RTL-Werte vom durchschnittlichen Steuerelement RTL, eine Falte Änderung gegenüber der Kontrollproben zu generieren.
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Representative Results
Ein dual Vektorsystem, LncRNA IFNG-AS1 overexpress
Das Beispiel Experiment in dieser Handschrift ist die Überexpression eines Jurkat T-Zell-Modell-Systems mit dem Ausdruck LncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 ist ein LncRNA Zusammenhang mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, die Interferon-Gamma10Regeln gesehen hat. Das IFNG-AS1-gen enthält drei Splice-Varianten, die alle die gleichen transkriptionelle Startseite (Abbildung 1A) verwenden. Daher wurden gRNA Sequenzen, die 10 bis 100 bp entfernt die transkriptionelle Startsite und hatten eine "NGG" Sequenz stromaufwärts verwendet, für die Leitung des Aktivierung von Cas9 komplexes, der die transkriptionelle Locus IFNG-AS1 (Abbildung 1A). Ein zwei-Plasmid-System wurde verwendet, um entweder dCas9 oder gRNAs/Enhancer in Zellen als ein einzelnes Plasmid allein macht Viruspartikel Generation erschwert durch Plasmid Größe (Abbildung 1 b) transduzieren. Um die Auswahl der doppelten ausgestrahlt Zellen zu aktivieren, der dCas9-Vektor enthaltenen Puromycin (Aminonucleoside)-Resistenz-Gen und gRNA-haltigen Plasmid enthalten (Aminoglykosid) Hygromycin-Resistenz-Gen. gRNAs wurden mit einer MS2 Gerüst Sequenz verschmolzen, die das MS2 Gerüst Protein binden an die gRNAs aktiviert. Mit der MS2 verschmolzen Protein sind zusätzliche transcriptional Aktivatoren, die Überexpression von IFNG-AS17zu verbessern. Diese Vektoren verwenden, können Viruspartikel erstellt werden, um diese Überexpression-System in den meisten menschlichen Zelllinien transduzieren.
Virale verschoben und Kolonie screening
Nach dem Generieren der dCas9 und gRNA enthalten Plasmide, Plasmid Reinigungen durchgeführt und Lentiviren entstanden. Lentiviren zufällig ihre Kassetten in das Genom integrieren, ermöglicht eine Quantifizierung der Zahl der Viruspartikel die geringste Anzahl von Integrationen möglich. Um dies zu erreichen, wurden konditioniert-Medien-haltige Viren gemessen mit einem p24 ELISA-Kit, so dass für die Berechnung der Anzahl der Virionen pro Milliliter. Nach der Messung hatten beide virale Überstände fast 1 µg/mL p24, ermöglichte die Verwendung von 100 µL des Virus in die Jurkat-Zellen transduzieren. Nach Transduktion Antibiotikum ausgewählt Zellen wurden seriell verdünnt und Klone wurden erweitert. Cas9 Ausdruck wurde dann von Real-Time PCR und Agarose-Gelelektrophorese (Abb. 2 b) analysiert. Beide Klone ausgewählt wurden positiv für Cas9 Ausdruck. Um mRNA Ausdruck zu bestätigen, wurde Reverse Transkriptase von cDNA-Reaktion (Abb. 2 b) weggelassen. Primer gegen HPRT1 wurden verwendet, um das Vorhandensein von RNS in den nontransduced Zellen zu bestätigen.
Messung der IFNG-AS1 Genexpression
Mit der dCas9 als eine elterliche Zelllinie Klone, Zellen mit einem nontargeting gRNA-haltigen Virus oder ein Virus mit gRNAs gegen IFNG-AS1 ausgestrahlt wurden. Nach gRNA Transduktion, Auswahl und Klon Schöpfung analog zu dCas9 Linie Zellbildung wurde IFNG-AS1 Ausdruck gemessen, um zu überprüfen, Überexpression. IFNG-AS1 produziert drei Splice-Varianten, von die jeder einzeln mit Transkript-spezifische Primer (rot) oder gegen alle bekannten IFNG-AS1 Transkripte (blau) (Abbildung 3A) erkannt werden kann. Alle Fluoreszenz Kurven wurden exponentiell mit HPRT1 erreichen die exponentielle Phase (oder Ct) innerhalb einer halben zwischen Kontrolle und IFNG AS1-gRNA-exprimierenden Zellen (Abb. 3 bC Zyklus). Primer gegen alle bekannten IFNG-AS1 Transkripte wurden die meisten nachweisbar zwischen Experimente mit Messungen der 20-fold Anstieg der IFNG-AS1 (Abb. 3 b). Während Primer gegen Abschriften gegen 1 und 2 erfolgreich in peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) verstärkt, waren diese Abschriften in Jurkat Zellen (Daten nicht gezeigt) nicht nachweisbar. Jedoch als das dritte Transkript der IFNG-AS1 in konzentrierter RNA nachweisbar war, der fünf bis zur zehnfachen Anstieg IFNG-AS1 Ebenen galt. Diese Daten deuten darauf hin, entweder alternatives Spleißen der IFNG-AS1 in Jurkat Zellen gibt es im Vergleich zu Primärzellen. Primer gegen IFNG-AS1 erkannt hohe Zuwächse in diesem Gen, damit das aktivierende CRISPR Überexpression System validieren.
Abbildung 1: ein dual Vektorsystem, LncRNA IFNG-AS1 overexpress. (A) A schematische Darstellung der IFNG-AS1 Genstruktur und die Beziehung zwischen Guide RNA (gRNA) verbindliche Aufstellungsorte und die transkriptionelle Startsite (TSS). (B) die Merkmale der Vektoren gRNA und dCAS9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: virale verschoben und Kolonie Screening. (A) ein Beispiel p24 ELISA Standardkurve für Lentivirus-haltigen, konditionierte Medien. Die schwarzen Punkte repräsentieren Standardmuster und die roten Punkte unbekannte Proben. (B) nach transducing, auswählen und generieren von Kolonien, Real-Time PCR und Gelelektrophorese gegen dCas9 auf der RNA aus beiden nontransduced Jurkat-Zellen (Eltern-) oder dCas9 ausgestrahlt Klone durchgeführt wurden. Kein Reverse Transkriptase (No RT) Kontrollen durchgeführt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Messung der IFNG-AS1 Genexpression. (A) A Diagramm des Verhältnisses zwischen Grundierung Sets und Protokoll-Varianten. Die roten Pfeile stellen Transkript-spezifische Primer, während der blaue Pfeile, Primer gegen alle bekannten Abschriften zeigen. (B und C) repräsentativen Durchschnitt PCR Kurven und Falten-Änderung Quantifizierungen zur Steuerung und IFNG-AS1-überexprimierenden Zellen. RFU = relative Fluoreszenz-Einheiten. N = 3 Proben pro Gruppe. Meine ± SD. *p < 0,05 ***p < 0,001. Ein Student t-Test wurde zur Berechnung der p-Werte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Ergänzende Abbildung1: gRNA Design Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Ergänzende Abbildung 2: BLAT Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Zusätzliche Tabelle 1: Lösungen Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
Zusätzliche Tabelle 2: ELISA Verdünnungen Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.
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Discussion
Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die Verwendung aktivieren CRISPR zur in-vitro-LncRNAs overexpress. Dies ist eine besonders wichtige Technik, wenn lange forensisches RNAs zu studieren, da das transkriptomischen Produkt der Funktionseinheit. Nach Überexpression können der Forscher dann diese Zellen das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, wenn Bindungspartner studieren und sogar die zellulären Folgen der erhöhte Spiegel von LncRNAs zu messen. Darüber hinaus als LncRNAs häufig auf GUS-Gene wirken, ermöglicht dieser endogenen Überexpression Technik diese Ereignisse studierte11,12.
Diese Handschrift zeigt ein allgemeines Protokoll für gRNA Schöpfung und Lentivirus Generation, Transduktion und Auswahl, und ein repräsentatives Beispiel für LncRNA-Überexpression in einem peripheren Blut T-Zell-Linie wurde skizziert. Darüber hinaus wurde diese Technik bereits gezeigt in Bone-Marrow-derived Immunzellen13, Neuronen7, Maus embryonale Stammzellen14und Niere Epithelzellen4erfolgreich zu sein. Während dieses Protokoll in der Regel für die meisten Zelllinien anwendbar ist, Zellen, die schwer zu transduzieren erfordern möglicherweise einzelne Titer höhere Infektionsraten zu ermöglichen. Darüber hinaus ist es wichtig, Antibiotika töten Kurven durchzuführen, wenn neue Zelllinien, da dieses Protokoll eine Positivauswahl Strategie nutzt.
Der Hinweis hat dieses Protokoll mehrere technische Aspekte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern. Reproduzierbare und konsequente Pipettieren für Real-Time PCR ist entscheidend für reproduzierbare Ergebnisse zu etablieren. Auch kleine Unterschiede im Volumen verursacht sehr Variable Werte, wodurch Interpretation schwierig. Neben einem richtigen quantitative PCR Primer Design sind Kontrollen, einschließlich der keine-Reverse-Transkriptase-Steuerung für die Echtzeit-PCR-Primer, sie bestätigen, dass die RNA quantifiziert nicht genomischer DNA. Die Auswahl der Housekeeping-Gene für Real-Time PCR ist auch wichtig, um ausreichend diese Experimente durchführen. Während HPRT1 in diesem Protokoll gewählt wurde, könnten andere Gene Interessen gezielt durch diese Technik HPRT115verändern. Eine sorgfältige Auswahl der Housekeeping-Gene, die auf der Grundlage dieser Faktors sollten berücksichtigt werden.
Es gibt ein paar Nachteile CRISPR aktivieren und bestimmte Aspekte dieses Protokolls. Eine mögliche Einschränkung ist der Ausdruck der Transkripte in hoch gen-reiche Regionen wie andere benachbarte Gene aktiviert werden konnte. Es ist möglich, dass benachbarte Gene in der Nähe aktiviert werden kann und Kontrollen durchgeführt werden, um dies zu beurteilen. Darüber hinaus sind weitere Einschränkungen den Mangel an Bindung für bestimmte gRNAs zu einer bestimmten DNA-Sequenz. Die Auswahl von mehreren gRNAs muss gegebenenfalls die entsprechenden gRNA Laufwerk Ausdruck zu identifizieren. Ein weiterer Nachteil des Systems ist, dass die Zelle von Interesse in der Lage, die Projektträger in den Kassetten zu fahren, um den Ausdruck der gRNAs und dCas9 zu fahren. Für die hier vorgelegten Studien konnte Jurkat T-Zell-Modell den Ausdruck dieser Komponenten für eine erfolgreiche Überexpression System fahren.
Im Idealfall sollte das hier beschriebene Protokoll mit anderen übereinstimmende Informationen, z. B. einzelne Überexpression von Protokolldaten und funktionellen Auswirkungen von Niederschlag oder Knockout Studien den Fall für eines der nachfolgenden Erkenntnisse stärken gekoppelt werden. Diese Technik bietet eine robuste Möglichkeit jedes Gen in einem bestimmten Zelltyp überexprimiert. Angesichts der Einschränkungen der LncRNA Biologie, wie z. B. schlechte Artenschutz, kritisieren Techniken wie die hier beschriebenen erkunden ihre Funktion im jeweiligen Zelltypen. Diese Studie konzentriert sich auf eine LncRNA, die entzündliche Darm-Krankheit-Pathophysiologie in Verbindung gebracht hat, sondern dient als Modell für die Funktion des anderen LncRNAs in der menschlichen Biologie zu studieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
C.P stützt sich auf RO1 DK60729 und P30 DK 41301-26. D.P. stützt sich auf einen Morbus Crohn & Colitis Foundation (EKFF) Karriere Entwicklungspreis, Heilung: verdauungsfördernde Krankheiten Research Center (DDRC) DK41301 und UCLA klinischen und translationalen Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Die UCLA-Virologie-Kern wurde finanziert durch Center AIDS Forschung (CFAR) 5P 30 AI028697 zu gewähren. Die UCLA integrierten molekularen Technologien, den Kern von Heilung/P30 unterstützt wurde gewähren DK041301. Diese Arbeit wurde auch von der UCLA AIDS-Institut unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
