Summary
Tecniche tradizionali basati su cDNA sovraespressione hanno una limitata applicabilità per la sovraespressione di RNA lunghi non codificanti a causa del loro più moduli di giunzione con funzionalità potenziale. Questa revisione segnala un protocollo utilizzando la tecnologia CRISPR per overexpress più varianti di splicing di un RNA lunghi non codificante.
Abstract
Lungo non codificanti RNA (lncRNA) biologia è un nuovo ed eccitante campo di ricerca, con il numero di pubblicazioni da questo settore in crescita esponenziale dal 2007. Questi studi hanno confermato che lncRNAs sono alterati in quasi tutte le malattie. Tuttavia, studiando i ruoli funzionali per lncRNAs nel contesto della malattia rimane difficile a causa della mancanza di prodotti proteici, espressione tessuto-specifica, i livelli di espressione bassa complessità nelle forme della giuntura e mancanza di conservazione tra specie. Dato l'espressione specie-specifica, gli studi lncRNA sono spesso limitati ai contesti di ricerca umana quando lo studio dei processi di malattia. Poiché lncRNAs funzionare a livello molecolare, un modo di sezionare lncRNA biologia è di rimuovere il lncRNA o dei overexpress gli effetti cellulari lncRNA e misura. In questo articolo, è presentato un protocollo scritto e visualizzato in quel momento ai overexpress lncRNAs in vitro. Come un esperimento rappresentanza, un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, l'interferone Gamma antisenso 1 (IFNG-AS1), è indicato per essere sovraespresso in un modello di T-cellula di Jurkat. A tale scopo, l'attivazione tecnica regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster è possibile abilitare sovraespressione ai loci genomici endogeni. La tecnica d'attivazione di CRISPR si rivolge a un insieme di fattori di trascrizione per il sito di inizio trascrizionale di un gene, consentendo una robusta sovraespressione di molteplici forme di giuntura lncRNA. Questa procedura verrà essere suddivisi in tre passi, vale a dire (i) guida RNA (gRNA) progettazione e vettore di costruzione, (ii) virus generazione e trasduzione e screening (iii) Colonia per sovraespressione. Per questo esperimento rappresentanza, un maggiore di 20 volte aumento in IFNG-AS1 in cellule di T di Jurkat è stato osservato.
Introduction
Mentre la ricerca biomedica più è incentrato su trascrizioni di proteina-codificazione, la maggior parte dei geni trascritti in realtà consiste di RNA non codificanti (Ensembl rilascio 93). La ricerca attuale sta cominciando ad esplorare questo campo, con il numero di pubblicazioni su lncRNAs nei processi di malattia aumenta in modo esponenziale tra 2007 e 20171. Queste pubblicazioni dimostrano che molti lncRNAs sono associate con la malattia. Tuttavia, i meccanismi molecolari di questi lncRNAs sono difficili da studiare a causa di loro diverse funzioni rispetto al mRNA. Ad aggravare il problema della comprensione del ruolo di lncRNAs nella malattia, lncRNAs sono spesso espressi a livelli inferiori a codificazione RNAs2. Inoltre, lncRNAs sono mal conservati, che limita gli studi funzionali in umani-cell-linea-based tecniche3. Un metodo per studiare il meccanismo di questi nuovi geni consiste in modo endogeno iperesprimono li in cellule coltivate. Sovraespressione studi possono fornire le principali informazioni per quanto riguarda la funzione dei geni specifici e consentire ai ricercatori di sezionare vie molecolari chiave.
Un nuovo metodo per attivare la trascrizione dei geni di lncRNA si basa su tecnologie CRISPR sviluppati inizialmente da Gersbach laboratorio4. Questo protocollo è stato adattato per uso in biologia di lncRNA e per l'espressione di questi geni in altri sistemi-modello. In CRISPR che overexpressing tecnica, una proteina chiamata proteina CRISPR 9 (Cas9) può essere diretto verso una sequenza di DNA tramite una gRNA antisenso che viene riconosciuto da Cas9. Normalmente, Cas9 indurranno la fenditura del DNA; Tuttavia, mutazioni in Cas9, precedentemente sviluppato per la tecnica di sovraespressione, disattivare questo passaggio5. Quando un attivatore trascrizionale è fusa ad un "morto" Cas9 (dCas9) e trasformata in linee cellulari, la sovraespressione endogena di lncRNAs può essere raggiunto4,6. L'aggiunta di ulteriori modifiche per il gRNA, consentendo ulteriori fattori trascrizionali di associare il gRNA, aumentato l'efficacia del sistema di attivazione del gene di dCas9 10 volte7. D'importanza, è stato dimostrato che l'attivazione trascrizionale richiede vicinanza (< 200 bp) iniziare la trascrizione geni sito, consentendo un upregulation specifici in aree ricche di gene7. A differenza delle tecnologie di knockout CRISPR, dCas9 e gRNA cassette devono essere integrati nel genoma per consentire le cellule a mantenere una sovraespressione nel corso di più generazioni. Un metodo per raggiungere questo obiettivo è utilizzare lentivirus per integrare le cassette contenenti dCas9 e gRNA. Dopo l'integrazione, l'espressione del gene di lncRNA può essere determinato.
In questo articolo, verrà dimostrato un protocollo per la sovraespressione di lncRNA in un modello di T-cellula di Jurkat. Una procedura dettagliata viene visualizzata e può essere adattata anche a cellule aderenti.
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Protocol
Nota: È importante notare che questo protocollo usa lentivirus replica-carenti. Eseguire la gestione di virale solo dopo addestramento di sicurezza di laboratorio appropriati. Bleach tutti gli elementi e le superfici che vengono a contatto con virus vivi per un minimo di 10 min dopo la manipolazione. Uso una protezione monouso laboratorio di cappotto e viso e occhi, così come doppie guanti, in ogni momento. Eseguire lavori di virus in biosicurezza livello 2 + laboratori con certificazione virale. Dedicare cappe di coltura del tessuto e incubatori a lavoro virale.
1. vector Design e generazione
Nota: Il modo migliore per identificare sequenze di gRNA è quello di utilizzare strumenti di progettazione on-line (ad esempio, http://crispr-era.stanford.edu) (supplementare figura 1: progettazione di gRNA). Per l'esperimento rappresentanza d'accompagnamento, una società progettato e realizzato i vettori gRNA utilizzati nell'esperimento rappresentativo. Il plasmide dCas9 inoltre è stato acquistato online.
- La sequenza di gRNA si trova a Monte della sequenza del nucleotide "NGG", dove "N" è qualsiasi nucleotide, che è anche all'interno di 100 coppie di basi del sito inizio trascrizionale. Ricerca genetici database quali BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) per la sequenza di gRNA, per assicurarsi che ci sono altri siti nel genoma con sequenze simili (supplementare nella figura 2: BLAT). Questo farà sì che la sequenza di gRNA è unica per il gene di interesse (GOI).
- Memorizzare i plasmidi gRNA e dCas9, che vengono come stub batterica, a 4 ° C. Striscia fuori Escherichia coli su un Luria agar di brodo (LB) piastra con ampicillina (Supplemental tabella 1) e far crescere i batteri durante la notte a 37 ° C.
- Scegli una Colonia e crescere i batteri in 5 mL di LB con ampicillina (Supplemental tabella 1) durante la notte, scuotere con forza la piastra in un incubatore a 37 ° C. Il giorno successivo, aggiungere 2 mL di batteri a 200 mL di LB con ampicillina crescono in un pallone da 2 L, agitando vigorosamente durante la notte in un incubatore a 37 ° C.
- Rallentare i batteri a 3.724 x g per 20 min. Rimuovi il supporto e posto nella provetta contenente i batteri sul ghiaccio.
-
Purificare il DNA batterico utilizzando un kit di purificazione del plasmide secondo il protocollo del produttore.
Nota: il kit di purificazione del plasmide contiene tampone di risospensione proprietarie, buffer di Lisi, tampone di lavaggio, buffer di equilibrazione e tampone di eluizione.- Aggiungere 10 mL di tampone di risospensione dal kit per i batteri e dispensare i batteri nella soluzione. Quindi, aggiungere 10 mL di tampone di lisi dal kit ai batteri sedimento e mescolare capovolgendo la provetta. Attendere 5 min per lisare i batteri; quindi, aggiungere 10 mL di tampone di neutralizzazione ghiacciata dal kit ai batteri lisati e mescolare capovolgendo la provetta.
- Equilibrare la colonna di DNA dal kit con 10 mL di tampone di equilibrazione per 5 min, versare i campioni nella colonna DNA filtrare e lasciare che la soluzione passa attraverso il filtro.
- Lavare i campioni 2 x con 30 mL di tampone di lavaggio e, quindi, eluire il DNA con 30 mL di tampone di eluizione in una provetta conica da 15 mL. Strato lentamente 10,5 mL di isopropanolo a temperatura ambiente sul DNA eluito, capovolgere la provetta e immediatamente girare a 16.200 x g per 30 min a 4 ° C.
- Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di etanolo al 70% al pellet di DNA. Risospendere il pellet, spostando il tubo. Spin a 16.200 x g per 10 min a 4 ° C e utilizzare un suggerimento di dispensare 200 μL per rimuovere la maggior parte dell'etanolo. Asciugare il pellet per 5 min e risospendere in 200 μL di acqua e conservare il DNA a-20 ° C. La concentrazione attesa sarà > 1 μg/μL.
2. virus generazione e particelle totali
- Quando si è pronti per creare il lentivirus contenenti dCAS9, cappotto piatti di coltura del tessuto di 100 mm con 5 mL di 0.01% poli-L-lisina (Supplemental tabella 1). Rimuovere accuratamente il liquido in eccesso dalle piastre e lasciarli asciugare all'aria per qualche minuto in una cappa di biosicurezza.
- Piastra 5 x 106 HEK 293T cellule per piatto in 10 mL di completa di Dulbecco modificato medio dell'Aquila (DMEM) (Supplemental tabella 1) e incubare per una notte a 37 ° C con 5% CO2. Il giorno successivo, rimuovere il supporto dai piatti HEK 293T e aggiungere 10 mL di DMEM completo.
- Mix 6.5 μg di plasmide pMDLg/pRRE contenente il bavaglio/pol (componenti del virus), 3,5 μg del pMDG2.G di plasmide contenente il VSV-G (un componente del virus), 2,5 µ g del plasmide OSPRO-Rev contenente Rev (un componente del virus), 10 μg di un (ripetizione terminale lunga LTR)-contenente gRNA vettoriale o un dCas9 LTR contenenti vector e aggiungere acqua ad un volume totale di 450 μL. Filtrare la miscela attraverso una punta di filtro 0,2 µm collegata a una siringa.
- Aggiungere 50 µ l di 2,5 M CaCl2 (Supplemental tabella 1) per ogni campione di transfezione del DNA e mescolare delicatamente. Filtrare la miscela di calcio/DNA attraverso una punta di filtro 0,2 µm collegata a una siringa. Dispensare 500 µ l di 2 x HBS (Supplemental tabella 1) in una provetta di polistirene di 5 mL. Aggiungere 500 µ l DNA/CaCl2 mix goccia a goccia e delicatamente vortice. Incubare a temperatura ambiente per 3 min.
- Lentamente aggiungere 1 mL di sospensione /HBS DNA/CaCl2ad ogni piatto. Immediatamente agitare i piatti per distribuire i contenuti in modo uniforme. Incubare ogni piatto una notte in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Il giorno 3, lentamente rimuovere e scartare i media dai piatti. Lavare accuratamente le cellule 1 x con tampone fosfato salino (PBS). Aggiungere 6 mL di DMEM completo integrato con 20 mM HEPES e butirrato del sodio di 10 mM. Incubare le cellule per 5 – 6 h in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Lavare le cellule 1 x con PBS e aggiungere 5 mL di DMEM completo con 20 mM HEPES alle cellule HEK 293T. Incubare per 12 ore durante la notte in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Il giorno 4, raccogliere i surnatanti di cellule HEK 293T e filtrare il surnatante. Congelare aliquote di 1 mL a-80 ° C.
- Quando si è pronti a utilizzare il virus, scongelare un'aliquota della particella virale contenente media condizionati (memorizzati come descritto nel passo 2.8) sul ghiaccio. Portare tutti i reattivi a temperatura ambiente.
-
Utilizzare un kit di p24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) per quantificare il numero di particelle virali per millilitro.
- Diluire la soluzione di lavaggio concentrata dal kit aggiungendo 19 parti di acqua distillata deionizzata. Diluire il controllo positivo da kit a 200 ng/mL, utilizzando RMPI 1640 come diluente e fare le diluizioni per curva standard in 1,5 mL tubi secondo la p24 tabella di diluizione ELISA (Supplemental tabella 2).
- Aggiungere 20 μL di 5% Triton X-100 in tutti i pozzetti tranne il bianco-substrato. Aggiungere 200 μL di RPMI 1640 nei pozzetti di controllo negativo. Aggiungere 200 μL di ciascuno standard (in duplicato) pozzetti designati.
- Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la concentrazione del virus all'interno dei campioni, usando una curva standard. Iniziare la diluizione del campione a 1:1,000 e modificare il volume necessario al fine di essere all'interno della gamma della curva standard. Diluire i campioni con Triton X-100 ad una concentrazione finale di 0,5% e aggiungere 200 µ l di ciascun campione in RPMI 1640 pozzetti designati. Sigillare la piastra e incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Lavare la piastra 6 x con 300 μL di tampone di lavaggio per pozzetto: 1x. Rimuovere qualsiasi eccesso di liquidi invertendo la piastra e battendolo su un tovagliolo di carta. Aggiungere 100 μL di anticorpo rivelatore da kit in tutti i pozzetti tranne il bianco-substrato. Sigillare la piastra e incubare per 1h a 37 ° C. Lavare la piastra e, successivamente, togliere il liquido in eccesso invertendo la piastra e battendolo su un tovagliolo di carta.
- Al fine di misurare l'anticorpo rivelatore, preparare streptavidina-perossidasi (SA-HRP) entro 15 min di utilizzo. Diluire il SA-HRP a 1: 100 con diluente SA-HRP. Mescolare accuratamente il SA-HRP diluito e aggiungere 100 μL in tutti i pozzetti tranne il vuoto. Ed incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Lavare la piastra con tampone di lavaggio 1X e tocca via il liquido in eccesso come nel passaggio 2.10.4. Utilizzare la soluzione di substrato ortho-fenilendiammina (OPD), che fornisce la perossidasi i substrati necessari per la produzione di chemiluminescenza, entro 15 min di preparazione. Utilizzare una compressa OPD 11 mL di diluente per substrato per ogni piatto.
- Vortex la soluzione OPD vigorosamente per dissolverlo completamente e proteggerlo dalla luce. Aggiungere 100 μL di soluzione di substrato OPD in tutti i pozzetti, compreso lo spazio vuoto. Utilizzando uno spettrofotometro, leggere l'assorbanza a 450 nm immediatamente, ripetere questo 10x a intervalli di 1 s e prendere la misura media.
3. dCas9 -VP64 trasduzione
- Cellule di T di Jurkat cultura in DMEM completo in una boccetta di T75 con una densità di 2 x 106 cellule in 15 mL di media. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
- Rotazione verso il basso le cellule per 5 min a 233 x g e, quindi, li risospendere in 10 mL di media riduttori del siero. Contare le celle con un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
- Risospendere e piastra 1 x 106 cellule di Jurkat in 5 mL di media riduttori del siero con polybrene (Supplemental tabella 1) in un matraccio da T75. Aggiungi HEK 293T-condizionato media contenente 1 x 106 dCas9-contenente particelle virali. Il numero di particelle virali può essere calcolato approssimativamente dalla p24 ELISA perché 1 μg/mL p24 è uguale a 1 x 107 particelle virali. Mettere le beute in incubatore a 37 ° C con 5% CO2.
4. selezione e Clone creazione
- Tre giorni dopo l'infezione, rotazione verso il basso le cellule a 233 x g per 5 min e risospendere li in 10 mL di DMEM completo con con puromicina (Supplemental tabella 1). Piastra le cellule in boccette T75 e loro coltura a 37 ° C con 5% CO2. Ogni terzo giorno, per un periodo di 9 giorni, rotazione verso il basso le cellule a 233 x g per 5 min e sostituire il supporto con DMEM completo con con puromicina.
- Contare le celle utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro. Su una piastra a 96 pozzetti trattata con coltura tissutale, piastra 10.000 cellule in 100 μL di DMEM completo con con puromicina nel primo bene e in modo seriale diluire 1:1 il contenuto dei pozzetti seguenti con DMEM completo con con puromicina. Eseguire 24 diluizioni e ripetere questo 4x per piastra al fine di garantire che ci sia un numero sufficiente di cellule per pozzetto. Incubare le cellule a 37 ° C con 5% CO2.
- Espandere le cellule clonali in due piastre da 24 pozzetti, poi in una piastra a 6 pozzetti e alla fine in un matraccio da T75. Al fine di concentrarsi su tre dei cloni, piastra 2 x 106 cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per tre dei cloni. Piatto degli altri tre pozzi con nontransduced cellule Jurkat come controlli. Mettere le celle in un'incubatrice di coltura cellulare durante la notte.
- Per l'estrazione di RNA, utilizzare un kit di isolamento del RNA disponibile in commercio. Rotazione verso il basso le cellule a 233 x g per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il supporto. Utilizzare una punta di Pipetta 1ml per risospendere le cellule in 350 μL di tampone di lisi. Aggiungere 350 μL di etanolo al 70% per le cellule lisate, mescolare accuratamente con una pipetta da 1 mL e trasferire il campione nella colonna di RNA.
- Girare i lisati a 10.000 x g per 1 min, rimuovere il flusso continuo e aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio di basso-rigore dal kit della colonna. Girare i lisati a 10.000 x g per 1 min, rimuovere il flusso continuo e aggiungere 80 µ l di dnasi I soluzione dal kit alla colonna; Lasciate che i campioni Incubare per 15 min a temperatura ambiente.
- Girare i lisati a 10.000 x g per 1 min, rimuovere il flusso continuo e aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio ad alta-rigore dal kit della colonna. Girare i lisati a 10.000 x g per 1 min, rimuovere il flusso continuo e aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio di basso-rigore alla colonna.
- Rimuovere la colonna dalla provetta di raccolta e trasferirlo in un nuovo tubo di raccolta. Gira i lisati a 10.000 x g per 1 min e, quindi, trasferire la colonna di RNA in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 50 µ l di acqua per la colonna e spin a 10.000 x g per 1 min.
- Utilizzare uno spettrofotometro per quantificare la concentrazione di RNA. Aspettatevi la concentrazione tra 100-500 ng / µ l, con un'assorbanza 260/280 tra 1,9 a 2,1. Memorizzare il RNA a-80 ° C.
- In 250 µ l tubi, aggiungere 1 µ g di RNA, 4 µ l di tampone di sintesi complementare del DNA (cDNA), 1 µ l della trascrittasi inversa e acqua ad un volume finale di 20 µ l. non includere nessun controllo della trascrittasi inversa. In un termociclatore, sintetizzare cDNA a 42 ° C per 30 min e a 95 ° C per 5 min inattivare la trascrittasi inversa. Diluire il cDNA con 60 µ l di acqua dopo la sintesi.
- Preparare le reazioni a catena della polimerasi (PCR) contenente 5 µ l di SYBR green, 4 µ l di cDNA, 0,5 µ l di primer forward (10 µM) e 0,5 µ l di primer reverse (10 µM). Eseguire la PCR come segue: passo 1 = 95 ° C per 3 min, passo 2 = 95 ° C per 10 s, passo 3 = 60 ° C per 10 s e quindi, ripetere i passaggi 2 e 3 per x 30.
Nota: La sequenza per il primer forward dCas9 è 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA e la sequenza per il primer reverse dCas9 è 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Il primer forward per ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1) è 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT e il primer reverse è 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA trasduzione, selezione, Clone creazione e Screening
- Retransduce le cellule Jurkat-dCas9 convalidate con gRNA contenenti virus, come descritto nella sezione 3. Selezionare le celle in DMEM con igromicina (Supplemental tabella 1) per 10 giorni. Rotazione verso il basso le cellule e cambiare i media ogni 3 giorni.
- Eseguire una diluizione seriale delle cellule (come descritto al punto 4.2) ed espandere le colonie individuali (come descritto al punto 4.3). Purificare il RNA dalle colonie esattamente come descritto nel passaggio 4.5 ed eseguire sintesi di cDNA come descritto al punto 4.9. Eseguire PCR in tempo reale contro il governo indiano e HPRT1 o un gene housekeeping appropriato, allo stesso modo la PCR descritto al punto 4.10, tranne in questo caso, immagine che i pozzetti ogni ciclo dopo il passaggio 3.
- Utilizzare il metodo di soglia (Ct) ciclo comparativa per determinare variazione piega il GOI8. Brevemente, utilizzare la seguente equazione per calcolare i livelli della trascrizione relativa (RTLs): 2-(media Ct del GOI – media Ct del gene housekeeping). Calcolare il medio RTL dei controlli, quindi dividere tutti i valori RTL per il controllo della media RTL per generare un cambiamento di piega rispetto ai campioni di controllo.
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Representative Results
Un sistema di doppio vettore ai overexpress lncRNA IFNG-AS1
L'esperimento di esempio in questo manoscritto è la sovraespressione di un sistema di modello di T-cellula di Jurkat esprimendo il lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 è un lncRNA associato a malattia infiammatoria intestinale, che è stato visto per regolare il Gamma interferone10. Il gene di IFNG-AS1 contiene tre varianti di splicing che tutti utilizzare lo stesso sito di inizio trascrizionale (Figura 1A). Di conseguenza, sequenze di gRNA che erano 10 e 100 bp lontano dal sito di inizio trascrizionale e avevano una sequenza di "NGG" a Monte sono state usate per dirigere il complesso d'attivazione Cas9 al locus trascrizionale di IFNG-AS1 (Figura 1A). Un sistema di due-plasmide è stato utilizzato per trasdurre o dCas9 o gRNAs/Enhancer nelle cellule come un plasmide singolo da solo rende generazione particella virale difficile a causa delle dimensioni del plasmide (Figura 1B). Per attivare la selezione delle cellule trasdotte matrimoniale, il vettore dCas9 conteneva un gene di resistenza con puromicina (aminonucleoside), e il plasmide contenente gRNA conteneva un gene di resistenza igromicina (aminoglicoside). gRNAs sono stati fusi in una sequenza di impalcatura di MS2 che attivata la proteina dell'impalcatura MS2 associare alla gRNAs. Fusa per la MS2 proteina sono altri attivatori trascrizionali per migliorare la sovraespressione di IFNG-AS17. Utilizzando questi vettori, particelle virali possono essere create per trasdurre questo sistema sovraespressione in linee cellulari più umane.
Titolazione virale e la proiezione di Colonia
Dopo aver generato i plasmidi contenenti dCas9 e gRNA, purificazioni di plasmide sono state effettuate e sono stati creati lentivirus. Lentivirus integrazione della loro cassette in modo casuale nel genoma, una quantificazione del numero di particelle virali consente il minimo numero di integrazioni possibili. A tale scopo, condizionata-media-contenente virus sono stati misurati con un p24 kit ELISA, consentendo per il calcolo del numero di virioni per millilitro. Dopo la misurazione, entrambi surnatanti virali avevano quasi 1 µ g/mL di p24, che ha permesso l'uso di 100 µ l di virus trasduce le cellule Jurkat. Dopo trasduzione, antibiotico-selezionato di celle in serie sono state diluite e cloni sono stati espansi. Cas9 espressione è stata poi analizzata mediante PCR in tempo reale e l'elettroforesi del gel dell'agarosi (Figura 2B). Entrambi i cloni selezionati erano positivi per l'espressione di Cas9. Per confermare l'espressione del mRNA, trascrittasi inversa è stato omesso dalla reazione di cDNA (Figura 2B). Primer contro HPRT1 sono stati usati per confermare la presenza di RNA nelle cellule nontransduced.
Misura l'espressione genica di IFNG-AS1
Utilizzando il dCas9 cloni come una linea cellulare parentale, le cellule sono state trasdotte con un nontargeting gRNA contenenti virus o un virus contenente gRNAs contro IFNG-AS1. Dopo gRNA trasduzione, la selezione e creazione di clone analoga alla creazione di linee di dCas9 delle cellule, l'espressione di IFNG-AS1 è stato misurato per verificare sovraespressione. IFNG-AS1 produce tre varianti di splicing, ognuno dei quali può essere rilevato singolarmente con primer di trascrizione specifici (rosso) o contro tutte le trascrizioni di IFNG-AS1 note (blu) (Figura 3A). Tutte le curve di fluorescenza sono stati esponenziale con HPRT1 raggiungere che l'esponenziale fase (o, Ct) all'interno di un ciclo tra controllo e IFNG-AS1-gRNA-esprimendo le cellule (Figura 3BC). Primer contro tutte le trascrizioni di IFNG-AS1 note erano il più rilevabili tra esperimenti con misure di 20 volte aumenta in IFNG-AS1 (Figura 3B). Mentre gli iniettori contro trascrizioni contro 1 e 2 amplificato con successo in cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs), queste trascrizioni non erano rilevabili in cellule Jurkat (dati non mostrati). Tuttavia, quando la terza trascrizione di IFNG-AS1 era rilevabile in RNA concentrato, un cinque-dieci volte aumento significativo nei livelli di IFNG-AS1 è stata veduta. Questi dati suggeriscono uno splicing alternativo di IFNG-AS1 in Jurkat cellule esistano rispetto alle cellule primarie. Primer contro IFNG-AS1 rilevato grandi aumenti in questo gene, conseguenza di convalidare il sistema di sovraespressione CRISPR d'attivazione.
Figura 1: un sistema di doppio vettore ai overexpress lncRNA IFNG-AS1. (A) A disegno schematico della struttura genica IFNG-AS1 e il rapporto tra siti di legame del RNA (gRNA) guida e il sito di inizio trascrizionale (TSS). (B) le caratteristiche dei vettori gRNA e dCAS9. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Titolazione virale e la proiezione di Colonia. (A) un esempio p24 curva standard di ELISA per i supporti contenenti lentivirus, condizionate. I punti neri rappresentano campioni standard e il rosso dei puntini campioni incogniti. (B) dopo transducing, selezionando e generare colonie, PCR in tempo reale e l'elettroforesi del gel contro dCas9 sono stati effettuati sul RNA da entrambi nontransduced cellule Jurkat (parentale) o cloni dCas9 trasdotte. Nessun controllo della trascrittasi inversa (RT No) sono stato effettuato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: misura l'espressione genica di IFNG-AS1. (A) A diagramma della relazione tra set di primer e varianti di trascrizione. Le frecce rosse rappresentano il primer di trascrizione specifici, mentre le frecce blue indicano Primer contro tutte le trascrizioni di note. (B e C) curve PCR media rappresentativo e quantificazioni piega-cambiamento per il controllo e le cellule che overexpressing IFNG-AS1. RFU = fluorescenza relativa unità. N = 3 campioni per ogni gruppo. Media ± SD. *p < 0,05, * * *p < 0,001. Di uno studente t-test è stato utilizzato per calcolare il p-valori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare figura 1: gRNA design Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare nella figura 2: BLAT Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare tabella 1: soluzioni Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Supplementare tabella 2: diluizioni ELISA Per favore clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo manoscritto presenta un protocollo per l'utilizzo di attivazione CRISPR per overexpress lncRNAs in vitro. Si tratta di una tecnica particolarmente importante quando si studia a lungo non codificanti RNA come il prodotto di trascrittomica è l'unità funzionale. Dopo sovraespressione, il ricercatore può, quindi, utilizzare queste cellule per aumentare il rapporto segnale-rumore quando lo studio partner di legame e anche misurare le conseguenze cellulari di aumento dei livelli di lncRNAs. Come lncRNAs frequentemente agiscono su cis-geni, questa tecnica di sovraespressione endogeno consente inoltre di questi eventi essere studiato11,12.
Questo manoscritto evidenzia un protocollo generalizzato per gRNA creazione e generazione dei lentivirus, trasduzione e selezione, e un esempio rappresentativo della sovraespressione di lncRNA in una linea a cellula T periferici di anima è stato delineato. Inoltre, questa tecnica ha già dimostrata di riuscire in osso-zucchino-derivate cellule immunitarie13, neuroni7, cellule staminali embrionali di topo14e rene cellule epiteliali4. Mentre questo protocollo è generalmente applicabile per la maggior parte delle linee cellulari, cellule che sono difficili da trasdurre potrebbero richiedere i titoli individuali tale da consentire più elevati tassi di infezione. Inoltre, è importante eseguire kill antibiotico curve quando si utilizza nuove linee di cellule, come questo protocollo utilizza una strategia di selezione positiva.
Di nota, questo protocollo ha diversi aspetti tecnici che richiedono particolare attenzione. Risultati riproducibili e coerenti di pipettaggio per PCR in tempo reale è fondamentale per stabilire la riproducibilità dei risultati. Anche piccole differenze di volumi causerà valori altamente variabili, rendendo difficile interpretazione. Oltre a un corretto disegno di primer PCR quantitativo, controlli, compreso il controllo di no-reverse-transcriptase per gli iniettori PCR in tempo reale, sono fondamentali in quanto confermano che il RNA viene quantificato non è DNA genomic. La selezione di geni housekeeping per PCR Real-Time è anche importante al fine di poter svolgere in questi esperimenti. Mentre HPRT1 è stato scelto in questo protocollo, altri geni di interesse presi di mira da questa tecnica potrebbero alterare HPRT115. Un'attenta selezione di geni housekeeping basato su questi fattori deve essere presi in considerazione.
Ci sono alcuni svantaggi di attivazione CRISPR e di aspetti particolari del presente protocollo. Una limitazione potenziale è l'espressione di trascritti nelle regioni altamente ricco di gene come altri geni vicini potevano essere accesa. È possibile che vicini geni in prossimità può essere attivato e controlli dovrebbero essere effettuati per valutare questo aspetto. Inoltre, altre limitazioni includono la mancanza di associazione per gRNAs particolare per una data sequenza di DNA. La selezione di più gRNAs potrebbe essere necessario identificare il gRNA appropriato all'espressione di unità. Un altro avvertimento al sistema è che la cella di interesse deve avere la capacità di guidare i promotori in cassette al fine di guidare l'espressione del gRNAs e dCas9. Per gli studi presentati qui, il modello di T-cellula di Jurkat è stata in grado di guidare l'espressione di questi componenti per un sistema di successo sovraespressione.
Idealmente, il protocollo descritto qui dovrebbe essere accoppiato con altre informazioni che confermano, come singola trascrizione sovraespressione dati ed effetti funzionali dagli studi atterramento o ad eliminazione diretta, per sostenere il caso per uno qualsiasi dei risultati successivi. Questa tecnica offre un modo efficiente di overexpressing qualsiasi gene in un tipo di cella specifica. Date le limitazioni della biologia, lncRNA, quali la conservazione delle specie poveri, tecniche come quello descritto qui sono fondamentali per esplorare la loro funzione in tipi cellulari rilevanti. Questo studio si è concentrato su un lncRNA che è stato implicato nella fisiopatologia della malattia infiammatoria intestinale, ma serve come un modello di studiare la funzione di altri lncRNAs in biologia della malattia umana.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
C.P. è supportato da DK60729 RO1 e P30 DK 41301-26. D.P. è supportato dal career development award di Crohn & colite Foundation (CCFA), cura: centro di ricerca Malattie Digestive (DDRC) DK41301 e UCLA clinica e traslazionale Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. Il nucleo di virologia UCLA è stato finanziato dal centro di ricerca del AIDS (CFAR) concedere 5P 30 AI028697. Le tecnologie molecolari integrate di UCLA core è stato sostenuto dalla cura/P30 concedere DK041301. Questo lavoro è stato supportato anche dall'istituto UCLA AIDS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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