Summary
Tradisjonelle cDNA-baserte overuttrykte teknikker har et begrenset bruksområde for overuttrykte lang noncoding RNAs på grunn av skjemaene for flere skjøte med mulig funksjonalitet. Denne anmeldelsen rapporterer en protokoll bruker CRISPR teknologi for å overexpress flere skjøte-varianter av en lang noncoding.
Abstract
Lang noncoding RNA (lncRNA) biologi er et nytt og spennende forskning, med antall publikasjoner fra dette feltet vokser eksponentielt siden 2007. Disse studiene bekrefter at lncRNAs er endret i nesten alle sykdommer. Studere funksjonsroller for lncRNAs i forbindelse med sykdom imidlertid vanskelig på grunn av mangel på protein produkter, vev-spesifikke uttrykk, lav uttrykk nivåer, kompleksiteten i skjøte former, og mangel på bevaring blant arter. Gitt artsspesifikke uttrykket, er lncRNA studier ofte begrenset til menneskelig forskning sammenhenger når studere sykdom prosesser. Siden lncRNAs fungerer på molekylært nivå, er en måte for dissekere lncRNA biologi å fjerne lncRNA eller overexpress lncRNA og måle mobilnettet effektene. I denne artikkelen presenteres en skriftlig og visualisert protokoll til overexpress lncRNAs i vitro. Som en representant eksperiment vises en lncRNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), å være overexpressed i en Jurkat T-celle modell. Dette brukes aktivering gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) teknikken til å aktivere overuttrykte på de endogene genomisk loci. Aktivere CRISPR teknikken mål en rekke transkripsjonsfaktorer til webområdet transcriptional starte med et muliggjør en robust overuttrykte flere lncRNA skjøte skjemaer. Denne fremgangsmåten vil deles inn i tre trinn, nemlig (i) guide RNA (gRNA) design og vektor konstruksjon, (ii) virus generasjon og signaltransduksjon og (iii) kolonien screening for overuttrykte. For dette representant eksperimentet, større enn 20-fold ekstrautstyr i IFNG-AS1 i Jurkat T celler ble observert.
Introduction
Mens mest biomedisinsk forskning har fokusert på protein-koding transkripsjoner, består fleste transkribert gener av noncoding RNAs (Ensembl release 93). Nåværende forskning begynner å utforske dette feltet med antallet publikasjoner om lncRNAs i sykdom prosesser øker eksponentielt mellom 2007 og 20171. Disse publikasjonene viser at mange lncRNAs er forbundet med sykdom. Molekylære mekanismer av disse lncRNAs er imidlertid vanskelig å studere på grunn av deres forskjellige funksjoner i forhold til mRNAs. Compounding problemet med forståelsen av lncRNAs i sykdom, uttrykkes lncRNAs ofte på lavere nivåer enn koding RNAs2. I tillegg er lncRNAs dårlig bevart, som begrenser den funksjonelle studier i menneske-celle-linje-baserte teknikker3. En metode å studere mekanismen av disse romanen genene er å endogenously overexpress dem i kulturperler celler. Overuttrykte studier kan gi informasjon om funksjonen av bestemte gener og aktiverer forskere å dissekere nøkkel molekylær veier.
En ny metode for å aktivere Transkripsjonen til lncRNA gener er basert på CRISPR teknologi opprinnelig utviklet av Gersbach laboratorium4. Denne protokollen er tilpasset for bruk i lncRNA biologi og uttrykk for disse genene i andre modellsystemer. I CRISPR overexpressing teknikk, kan et protein som kalles CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) rettes mot en DNA sekvens via en antisense gRNA som gjenkjennes av Cas9. Normalt vil Cas9 indusere DNA cleavage; men deaktivere mutasjoner i Cas9, utviklet for det overuttrykte teknikken, denne trinn5. Når en transcriptional aktivator er sammensmeltet med en "dead" Cas9 (dCas9) og transduced i linjer, den endogene overuttrykte lncRNAs kan være oppnådd4,6. Tillegg av ytterligere modifiseringer å gRNA, slik at flere transcriptional faktorer å binde til gRNA, økte effekten av dCas9 genet aktiveringssystemet 10 ganger7. Viktigere, ble det vist at transcriptional aktivering krever nærhet (< 200 bp) den transcriptional start området gener, slik at en bestemt oppregulering i genet-rike områder7. I motsetning til CRISPR knockout teknologier må dCas9 og gRNA kassetter integreres i genomet slik at cellene å beholde en overuttrykte over flere generasjoner. Én metode for å oppnå dette er å bruke lentiviruses for å integrere dCas9 - og gRNA-inneholder kassettene. Etter integrasjon, kan lncRNA genuttrykk bestemmes.
I denne artikkelen, vil en protokoll for lncRNA overuttrykte i en Jurkat T-celle modell bli demonstrert. En fremgangsmåte vises og kan også tilpasses tilhenger celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Det er viktig å merke seg at denne protokollen bruker replikasjon dårlig lentiviruses. Utføre viral håndtering etter passende lab sikkerhetsopplæring. Bleach alle elementer og overflater som kommer i kontakt med levende virus i minst 10 min etter bruk. Bruk en engangs lab frakk og ansikt/øye beskyttelse, samt doble hansker, hele tiden. Utføre virus arbeid i biosikkerhet nivå 2 + labs med viral sertifisering. Vie vev kultur hetter og inkubatorer viral arbeid.
1. vektor Design og generasjon
Merk: Den beste måten å identifisere gRNA sekvenser er å bruke online verktøy (f.eks http://crispr-era.stanford.edu) (supplerende figur 1: gRNA design). For tilhørende representant eksperimentet, et selskap designet og skapt gRNA vektorer i representant eksperimentet. DCas9 plasmider også kjøpt online.
- Den gRNA sekvensen ligger oppstrøms av nukleotid sekvensen "NGG", der "N" er alle nukleotid, som også ligger innen 100 base-parene av transcriptional startwebstedet. Genetisk databaser som BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) etter gRNA orden, å sørge for at det er ingen andre områder i genomet med lignende sekvenser (supplerende figur 2: BLAT). Dette sikrer at gRNA sekvensen er unik for genet av interesse (GOI).
- Lagre gRNA og dCas9 plasmider, som kommer som bakteriell stubber, på 4 ° C. Strek ut Escherichia coli på en Luria kjøttkraft (LB) agar plate med ampicillin (ekstra tabell 1) og vokse bakterier overnatting på 37 ° C.
- Velg en koloni og vokse bakterier i 5 mL av LB med ampicillin (ekstra tabell 1) over natten, kraftig risting platen i en 37 ° C inkubator. Neste dag, legger 2 mL bakterier til 200 mL LB med ampicillin vokse i en 2 L kolbe, kraftig risting kolbe overnatter i en 37 ° C inkubator.
- Nedspinning bakterier 3,724 x g i 20 min. Fjern media og sted røret som inneholder bakterier på is.
-
Rense bakteriell DNA ved hjelp av en plasmider rensing kit per produsentens protokollen.
Merk: plasmider rensing kits inneholder proprietær rørets buffer, lyseringsbuffer, vaskebuffer, balanse buffer og elueringsbufferen.- Legg til 10 mL rørets bufferen fra kit bakterier og Pipetter bakterier i løsningen. Deretter legge til 10 mL lyseringsbuffer fra kit resuspended bakterier og bland dem ved å snu røret. Vent på 5 minutter for å lyse av bakterier; deretter legge til 10 mL iskald nøytralisering bufferen fra kit lysed bakterier og bland dem ved å snu røret.
- Equilibrate kolonnen DNA fra kit med 10 mL balanse bufferen for 5 min. hell prøvene i kolonnen DNA filtrere og la løsningen passerer gjennom filteret.
- Vask prøvene 2 x med 30 mL vaske bufferen og, deretter elute DNA med 30 mL av elueringsbufferen i et 15 mL konisk rør. Sakte lag 10,5 mL isopropanol ved romtemperatur på eluted DNA Inverter røret og umiddelbart spinn på 16,200 x g i 30 min på 4 ° C.
- Fjerne nedbryting og Legg til 1 mL av 70% etanol DNA-pellets. Resuspend pellet ved å sveipe røret. Spinn 16,200 x g i 10 min på 4 ° C og bruke et 200 μL Pipetter tips for å fjerne det meste av etanol. Air-Dry pellets for 5 min resuspend det i 200 μL av vann og lagre DNA på 20 ° C. Forventet konsentrasjonen blir > 1 μg/μL.
2. virus generasjon og partikkel teller
- Når du er klar til å opprette dCAS9 som inneholder lentivirus, pels 100 mm vev kultur retter med 5 mL 0,01% poly-L-lysine (ekstra tabell 1). Fjern overflødig væske grundig fra platene og la dem air-dry i noen minutter i en biosafety kabinett.
- Plate 5 x 106 HEK 293T celler per parabolen i 10 mL av komplett Dulbecco endret Eagle's medium (DMEM) (ekstra tabell 1) og ruge dem over natten på 37 ° C med 5% CO2. Neste dag, Fjern mediet fra HEK 293T retter og tilsett 10 mL av fullstendig DMEM.
- Mix 6.5 μg av plasmider pMDLg/pRRE som inneholder den gag/pol (komponenter av viruset), 3,5 μg av plasmider pMDG2.G som inneholder VSV-G (en komponent av viruset), 2,5 µg plasmider pRSV-Rev inneholde Rev (en komponent av viruset), 10 μg av en lang terminal gjenta ( LTR)-inneholder gRNA vektor eller en LTR inneholder dCas9 vektor og legge vann til et totalt volum på 450 μL. Filtrere blandingen gjennom en 0,2 µm filter tips knyttet til en sprøyte.
- Legg 50 µL av 2.5 M CaCl2 (ekstra tabell 1) hver transfection utvalg av DNA og bland forsiktig. Filtrere kalsium/DNA blandingen gjennom en 0,2 µm filter tips knyttet til en sprøyte. Pipetter 500 µL av 2 x HBS (ekstra tabell 1) inn i et 5 mL polystyren rør. Legg til 500 µL DNA/CaCl2 blanding dropwise og forsiktig vortex. Inkuber ved romtemperatur for 3 min.
- Sakte legge 1 mL av DNA/CaCl2/HBS suspensjon til hver rett. Umiddelbart swirl retter å distribuere innholdet jevnt. Inkuber hver rett over natten i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Dag 3, sakte fjerne og kast media fra retter. Forsiktig vaske cellene 1 x med fosfat-bufret saltvann (PBS). Legge til 6 mL av komplett DMEM supplert med 20 mM HEPES og 10 mM natrium butyrate. Inkuber celler for 5-6 h i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Vask cellene 1 x med PBS og legge til 5 mL av komplett DMEM med 20 mM HEPES HEK 293T cellene. Inkuber 12 h overnatter i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- På dag 4, samle HEK 293T celle supernatants og filtrere nedbryting. Fryse 1 mL dele på-80 ° C.
- Når du er klar til å bruke viruset, tine en aliquot av viral partikkel som inneholder betinget media (lagret som beskrevet i trinn 2.8) på is. Bringe reagenser til romtemperatur.
-
Bruke en p24 Enzyme-Linked Immunosorbent analysen (ELISA) kit for å tallfeste antallet virus partikler per milliliter.
- Fortynne vask konsentrat fra kit ved å legge til 19 deler destillert deionisert vann. Fortynne positiv kontrollen fra kit 200 ng/mL, med RMPI 1640 som fortynningsmiddel, og make fortynninger for standardkurve i 1,5 mL rør etter p24 ELISA fortynning tabellen (ekstra tabell 2).
- Legge til 20 μL 5% Triton X-100 til alle brønnene bortsett fra underlaget tomt. Tilsett 200 μL av RPMI 1640 negativ kontroll brønnene. Legge til 200 μL av hver standard (i duplikat) utpekt brønnene.
- Bruker et spektrofotometer, måle konsentrasjonen av viruset i prøvene, bruke en standard kurve. Start eksempel fortynning på 1:1,000 og endre volumet som nødvendig for å være innenfor rekkevidde av standardkurve. Fortynne prøvene med Triton X-100 til en siste konsentrasjon på 0,5% og legge 200 μL av hver prøve i RPMI 1640 utpekte brønner. Forsegle platen og Inkuber det 2 h på 37 ° C.
- Vaske platen 6 x med 300 μL av 1 x vaskebuffer per brønn. Fjern overflødig væske ved snu platen og trykke det på et papirhåndkle. Tilsett 100 μL detektor antistoff fra kit alle brønnene bortsett fra underlaget tomt. Forsegle platen og Inkuber det 1t på 37 ° C. Vaske platen, og deretter fjerner overflødig væske av snu platen og trykke det på et papirhåndkle.
- For å måle detektor antistoffer, forberede streptavidin-pepperrotperoksidase (SA-HRP) innen 15 min bruk. Fortynne SA-HRP på 1: 100 med SA-HRP fortynner. Bland den utvannet SA-HRP grundig og tilsett 100 μL alle brønnene bortsett fra tomt. Seal og ruge platen i 30 min ved romtemperatur.
- Vask platen med 1 x vaskebuffer og trykke overflødig væske som i trinn 2.10.4. Bruk substratløsningen Orto-phenylenediamine (OPD), som gir peroxidase nødvendig substrater for å produsere chemiluminescence, innen 15 min forberedelser. Bruk en OPD tablett til 11 mL substrat fortynningsmiddel for hver plate.
- Vortex OPD løsningen kraftig å oppløse den helt og beskytte den mot lyset. Tilsett 100 μL av OPD substratløsningen alle brønner, inkludert tomt. Bruker et spektrofotometer, lese absorbans ved 450 nm umiddelbart, Gjenta dette 10 x 1 s intervaller, og ta gjennomsnittet målingen.
3. dCas9 -VP64 signaltransduksjon
- Kultur Jurkat T celler i fullstendig DMEM i en MT75 bolle med en tetthet 2 x 106 celler i 15 mL av media. Kultur cellene i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Nedspinning celler for 5 min 233 x g og deretter resuspend dem i 10 mL redusert serum medier. Telle celler med en hemocytometer eller en automatisert celle teller.
- Resuspend og plate 1 x 106 Jurkat celler i 5 mL av redusert serum media med polybrene (ekstra tabell 1) i en MT75 bolle. Legge til HEK 293T-conditioned medier som inneholder 1 x 106 dCas9 inneholder virus partikler. Antall virus partikler kan beregnes omtrent fra p24 ELISA fordi 1 μg/mL p24 tilsvarer 1 x 107 virus partikler. Satt i flasker i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
4. valg og klone etableringen
- Tre dager etter infeksjon, Nedspinning cellene på 233 x g i 5 min og resuspend dem i 10 mL av komplett DMEM med puromycin (ekstra tabell 1). Plate cellene i MT75 flasker og kultur dem på 37 ° C med 5% CO2. Hver tredje dag, for 9 dager, Nedspinning cellene på 233 x g i 5 min og erstatte media med komplett DMEM med puromycin.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller en automatisert celle teller. På en 96-brønns plate behandlet med vev kultur, plate 10.000 celler i 100 μL komplett DMEM med puromycin i første godt og serielt fortynnes 1:1 innholdet av følgende med komplett DMEM med puromycin. Utføre 24 fortynninger gjenta denne 4 x per plate for å sikre at det er et tilstrekkelig antall celler per brønn. Inkuber cellene på 37 ° C med 5% CO2.
- Utvid klonal celler i to 24-vel plater, så i en 6-vel plate, og til slutt i en MT75 kolbe. For å fokusere på tre kloner, plate 2 x 106 celler per brønn av en 6-vel plate for tre kloner. Plate de andre tre brønnene med nontransduced Jurkat celler som kontroller. Sette cellene i en celle kultur inkubator natten.
- RNA utvinning, bruke en kommersielt tilgjengelig RNA isolering kit. Nedspinning cellene på 233 x g i 5 minutter ved romtemperatur og fjerner mediet. Bruk en 1 mL Pipetter tips for å resuspend cellene i 350 μL lyseringsbuffer. Tilsett 350 μL av 70% etanol lysed cellene, bland godt med en 1 mL Pipetter og overføre prøven til kolonnen RNA.
- Spinn lysates på 10 000 x g for 1 min, fjerne gjennomflytsenhet og tilsett 700 μL av lav-stringens vaskebuffer fra kit kolonnen. Spinn lysates på 10 000 x g for 1 min, fjerne gjennomflytsenhet og legge 80 µL av DNase jeg løsningen fra kit på kolonnen. La prøvene ruge i 15 min ved romtemperatur.
- Spinn lysates på 10 000 x g for 1 min, fjerne gjennomflytsenhet og legge 700 µL av høy-stringens vaskebuffer fra kit til kolonnen. Spinn lysates på 10 000 x g for 1 min, fjerne gjennomflytsenhet og legge til 700 µL av lav-stringens vaskebuffer kolonnen.
- Fjern kolonnen fra samlingen røret og overføre den til en ny samling rør. Spinn lysates på 10 000 x g for 1 min, og deretter overføre kolonnen RNA slik 1,5 mL. Legge til 50 µL av vann til kolonnen og spinn på 10 000 x g for 1 min.
- Bruk et spektrofotometer for å kvantifisere konsentrasjonen av RNA. Forvent konsentrasjonen mellom 100-500 ng/µL, med en 260/280 absorbansen mellom 1,9-2.1. Lagre RNA på-80 ° C.
- I 250 µL rør, legger 1 µg RNA, 4 µL komplementære DNA (cDNA) syntese bufferen, 1 µL av revers transkriptase og vann til et endelig antall 20 µL. inneholder ingen revers transkriptase kontroller. I en termisk cycler, syntetisere cDNA 42 ° C i 30 min og 95 ° C i 5 min å deaktivere revers transkriptase. Fortynn cDNA med 60 µL vann etter syntese.
- Forberede polymerase kjedereaksjoner (PCRene) som inneholder 5 µL av SYBR grønne, 4 µL av cDNA, 0,5 µL av fremover primer (10 µM), 0,5 µL av omvendt primer (10 µM). Kjøre PCR som følger: trinn 1 = 95 ° C i 3 minutter, trinn 2 = 95 ° C for 10 s, trinn 3 = 60 ° C i 10 s, og deretter, gjentar du trinn 2 og 3 for 30 x.
Merk: Rekkefølgen for dCas9 frem primer er 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA og rekkefølgen for dCas9 omvendt primer er 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Fremover primer for Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) er 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT omvendt primeren er 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA signaltransduksjon, utvalg, klone skapelse, og Screening
- Retransduce de validerte Jurkat-dCas9-cellene med gRNA inneholder virus som beskrevet i § 3. Merke celler i DMEM med hygromycin (ekstra tabell 1) i 10 dager. Nedspinning cellene og endre media hver tredje dag.
- Utføre en seriell fortynning av celler (som beskrevet i trinn 4.2) og utvide individuelle kolonier (som beskrevet i trinn 4.3). Rense RNA fra koloniene akkurat som beskrevet i trinn 4.5 og utføre cDNA syntese som beskrevet i trinn 4,9. Utføre sanntid PCR mot GOI og HPRT1 eller en passende housekeeping genet, på samme måte som PCR beskrevet i trinn 4.10, unntatt i dette tilfellet bildet brønnene hver syklus etter trinn 3.
- Bruke metoden sammenlignende syklus terskelen (Ct) til å fastslå fold endring i GOI8. Kort, bruk denne formelen til å beregne relative transkripsjon nivåer (RTLs): 2-(gjennomsnittlig Ct av GOI-gjennomsnittlig Ct av housekeeping genet). Deretter beregner den gjennomsnittlige RTL kontrollene og dele alle RTL verdier av gjennomsnittlig kontrollen RTL generere en fold endring i forhold til kontrollen prøvene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et dobbelt vektor-system for å overexpress lncRNA IFNG-AS1
Eksempel eksperimentet i dette manuskriptet er overuttrykte en Jurkat T-celle modell systemet uttrykker lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 er et lncRNA forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, som har blitt sett å regulere Interferon-Gamma10. IFNG-AS1 genet inneholder tre skjøte-varianter som alle bruke de samme transcriptional startwebstedet (figur 1A). Derfor ble gRNA sekvenser som var 10 og 100 bp fra transcriptional startwebstedet og hadde en "NGG"-sekvens oppstrøms brukt for regissere Cas9-aktivere komplisert å transcriptional locus IFNG-AS1 (figur 1A). En to-plasmider system ble brukt til å transduce dCas9 eller gRNAs/enhancers inn cellene som et enkelt plasmider alene gjør viral partikkel generasjon vanskelig på grunn av plasmider størrelse (figur 1B). For å aktivere merkede celleområdet dobbelt-transduced, dCas9 vektoren inneholdt en puromycin (aminonucleoside) motstand genet, og gRNA inneholder plasmider inneholdt en hygromycin (aminoglycoside) motstand genet. gRNAs var smeltet en MS2 stillaset sekvensen som aktivert MS2 stillaset protein binde til gRNAs. Del av MS2 protein er ekstra transcriptional aktivator å forbedre overuttrykte av IFNG-AS17. Bruker disse vektorer, kan virus partikler opprettes for å transduce overuttrykte systemet i de fleste mennesker linjer.
Viral titering og kolonien screening
Etter genererer dCas9 og gRNA-inneholder plasmider, plasmider renselser ble utført og lentiviruses ble opprettet. Som lentiviruses tilfeldig integrere sine kassetter i genomet, en kvantifisering av antall virus partikler kan minst mange integreringer mulig. Dette klimatiserte-media-inneholder virus ble målt med et p24 ELISA kit, tillater for beregning av antall virions per milliliter. Etter måling hadde både viral supernatants nesten 1 µg/mL av p24, som tillot bruk av 100 µL av viruset til transduce Jurkat cellene. Etter transduction, antibiotika-valgte celler var serielt utvannet og kloner ble utvidet. Cas9 uttrykk var da analysert ved sanntid PCR og agarose gel geleelektroforese (figur 2B). Begge kloner valgt var positive Cas9 uttrykk. For å bekrefte mRNA uttrykk, ble revers transkriptase utelatt fra cDNA reaksjonen (figur 2B). Primere mot HPRT1 ble brukt til å bekrefte tilstedeværelse av RNA i nontransduced celler.
Måle IFNG-AS1 genuttrykk
Bruker dCas9 kloner som en overordnet celle linje, celler var transduced nontargeting gRNA inneholder virus eller et virus som inneholder gRNAs mot IFNG-AS1. Etter gRNA signaltransduksjon, utvalg og klone etableringen analoge til dCas9 celle linje etableringen, ble IFNG-AS1 uttrykket målt for å bekrefte overuttrykte. IFNG-AS1 produserer tre skjøte-varianter, hver kan oppdages individuelt med transkripsjon-spesifikke primer (rød) eller mot alle kjente IFNG-AS1 transkripsjoner (blå) (figur 3A). Alle fluorescens kurver var eksponentiell med HPRT1 nå den eksponentielle fase (eller Ct) i en halv syklus mellom kontrollen og IFNG-AS1-gRNA-uttrykke celler (figur 3BC). Grunning mot alle kjente IFNG-AS1 transkripsjoner var den mest synlig mellom eksperimenter med målinger av 20-fold øker i IFNG-AS1 (figur 3B). Mens primere mot transkripsjoner mot 1 og 2 ble forsterket i perifert blod mononukleære celler (PBMCs), var ikke disse transkripsjonene synlig i Jurkat celler (data ikke vist). Men da tredje transkripsjon av IFNG-AS1 var i konsentrert RNA, ble en fem-til ti ganger betydelig økning i IFNG-AS1 nivåer sett. Disse data tyder på en alternativ skjøting av IFNG-AS1 i Jurkat celler finnes i forhold til primære celler. Primere mot IFNG-AS1 oppdaget store økninger i dette genet, dermed validere aktivering CRISPR overuttrykte systemet.
Figur 1: en dobbelt vektor-system for å overexpress lncRNA IFNG-AS1. (A) A skjematisk av IFNG-AS1 genet strukturen og forholdet mellom guide RNA (gRNA) bindende områder og transcriptional startwebstedet (TSS). (B) funksjoner i gRNA og dCAS9 vektorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Viral titering og kolonien screening. (A) en eksempel p24 ELISA standardkurven for lentivirus inneholder, betinget medier. De sorte prikkene representerer standard prøver og røde prikker ukjent prøver. (B) etter transducing, velge og generere kolonier, sanntid PCR og gel geleelektroforese mot dCas9 ble utført på RNA fra enten nontransduced Jurkat celler (foreldre) eller dCas9-transduced kloner. Ingen revers transkriptase (ingen RT) kontroller ble utført. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: måle IFNG-AS1 genuttrykk. (A) A diagram av forholdet mellom primer sett og transkripsjon varianter. Den røde piler representerer transkripsjon-spesifikke primere, mens de blå pilene angir primere mot alle kjente transkripsjoner. (B og C) representant gjennomsnittlig PCR kurver og fold-endre quantifications for kontroll og IFNG-AS1-overexpressing celler. RFU = relativ fluorescens enheter. N = 3 utvalg per gruppe. Mener ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. En Student t-test ble brukt til å beregne p-verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ekstra figur 1: gRNA design Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra figur 2: BLAT Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra tabell 1: løsninger Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra tabell 2: ELISA fortynninger Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet presenterer en protokoll for bruk aktivere CRISPR for å overexpress lncRNAs i vitro. Dette er en spesielt viktig teknikk når studere lang noncoding RNAs som transcriptomic produktet er funksjonell enhet. Etter overuttrykte, kan forskeren deretter bruke disse cellene for å øke signal-til-støy forholdet når studere bindende partnere og selv måle mobilnettet konsekvensene av økte nivåer av lncRNAs. I tillegg som lncRNAs ofte handle på cis-gener, kan denne endogene overuttrykte teknikken disse hendelsene være studerte11,12.
Dette manuskriptet fremhever en generalisert protokoll for gRNA opprettelse og lentivirus generasjon, signaltransduksjon og utvalg, og et representativt eksempel på lncRNA overuttrykte i en perifert blod T celle linje ble skissert. I tillegg har denne teknikken allerede vist seg å lykkes i bein margtransplantasjon-avledet immunceller13, nerveceller7, mus embryonale stamceller14og nyre epitelceller4. Denne protokollen er generelt gjelder for de fleste cellelinjer, kreve celler som er vanskelig å transduce personlige titers som å aktivere høyere infeksjon priser. I tillegg er det viktig å utføre antibiotika drepe kurver ved nye linjer, som denne protokollen utnytter en positiv valg strategi.
Av notatet har denne protokollen flere tekniske aspekter som krever spesiell oppmerksomhet. Reproduserbar og konsekvent pipettering for sanntids PCR er viktig å etablere reproduserbar resultater. Selv små forskjeller i volumer får svært variabel verdier, og dermed gjør tolkning vanskelig. En riktig kvantitative PCR primer design er kontroller, inkludert ingen revers transkriptase kontrollen for sanntids PCR primere, kritisk som de bekrefter at RNA blir kvantifisert ikke er genomisk DNA. Utvalget av housekeeping gener for sanntids PCR er også viktig for å utføre tilstrekkelig disse eksperimentene. Mens HPRT1 ble valgt i denne protokollen, kan andre gener interesser målrettet av denne teknikken endre HPRT115. Valget av housekeeping gener basert på disse faktorene bør tas i betraktning.
Det er noen ulemper å aktivere CRISPR og bestemte aspekter av denne protokollen. En potensiell begrensning er uttrykk for utskrifter i svært gen-rike områder som andre nærliggende gener kan være aktivert. Det er mulig at nabolandet gener i nærheten kan aktiveres og kontroller skal utføres for å vurdere dette. I tillegg omfatter andre begrensninger mangel på bindingen for bestemt gRNAs for en gitt DNA sekvens. Valg av flere gRNAs kan være nødvendig å identifisere den aktuelle gRNA til stasjonen uttrykk. En annen påminnelse til systemet er at cellen rundt må ha kapasitet til å kjøre arrangørene i kassettene for å kjøre uttrykk for gRNAs og dCas9. For studiene som blir presentert her, kunne Jurkat T-celle modell kjøre uttrykk for disse komponentene for et vellykket overuttrykte system.
Ideelt sett bør protokollen beskrevet her kobles til annen corroborating informasjon som enkelt utskrift overuttrykte data og funksjonelle effekter fra pusse eller knockout studier, å styrke saken for noen av de påfølgende resultatene. Denne teknikken tilbyr en robust måte å overexpressing alle gen i en bestemt celle type. Gitt begrensninger av lncRNA biologi, som dårlig arter bevaring, er teknikker som beskrevet her avgjørende for å utforske funksjoner i relevante celletyper. Denne studien fokusert på en lncRNA som har vært innblandet i inflammatorisk tarm sykdom patofysiologi, men fungerer som en modell av studere funksjonen til andre lncRNAs i menneskelig sykdom biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
C.P. støttes av RO1 DK60729 og P30 DK 41301-26. D.P. støttes av en Crohns og kolitt Foundation (CCFA) karriere development award, CURE: Digestive sykdommer Research Center (DDRC) DK41301, og UCLA kliniske og translasjonsforskning Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi kjernen ble finansiert av senter for AIDS Research (CFAR) gi 5P 30 AI028697. UCLA integrert molekylær teknologiene kjernen ble støttet av kur/P30 gi DK041301. Dette arbeidet ble også støttet av UCLA AIDS Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
