Summary
Традиционные на основе cDNA гиперэкспрессия методы имеют ограниченную применимость для гиперэкспрессия длиной некодирующих РНК за счет их несколько форм сращивания с потенциальными возможностями. Этот обзор докладов протокол, с помощью технологии ТРИФОСФАТЫ для overexpress несколько вариантов соединения длиной некодирующих РНК.
Abstract
Длиной некодирующих биологии РНК (lncRNA) является новой и интересной области исследований, количество публикаций из этой области растет экспоненциально с 2007 года. Эти исследования подтвердили, что lncRNAs изменяются в практически всех заболеваний. Однако изучая функциональные роли для lncRNAs в контексте болезнь остается сложным вследствие нехватки белковых продуктов, ткани конкретного выражения, низкой выражение уровня, сложностей в сращивания формы и отсутствие сохранения среди видов. Учитывая вегетационных выражение, lncRNA исследования, часто ограничиваются исследований человеческого контекста при изучении процессов болезни. Поскольку lncRNAs функционировать на молекулярном уровне, одним из способов вскрыть lncRNA Биология является либо удалить lncRNA или overexpress lncRNA и измерения клеточном эффекты. В этой статье представлены письменные и визуализировать протокол к overexpress lncRNAs в пробирке. Как представитель эксперимент lncRNA, связанных с воспалительным заболеванием кишечника, интерферон гамма Antisense 1 (IFNG-AS1), показано оверэкспрессировали в модели Jurkat Т-клеток. Для этого, активируя кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) техника используется для включения гиперэкспрессия на эндогенных локусов генома. Метод активации ТРИФОСФАТЫ цели набор факторов транскрипции на сайт transcriptional начала гена, позволяя надежные гиперэкспрессия множественных форм сплайс lncRNA. Эта процедура будет разбить на три этапа, а именно (i) руководство РНК (gRNA) дизайн и вектор строительства, (ii) вирус поколения и трансдукции и (iii) колонии скрининга для гиперэкспрессия. Для этого представитель эксперимента больше чем кратной повышение в IFNG-AS1 в Jurkat Т-клеток наблюдалось.
Introduction
Хотя наиболее биомедицинских исследований сосредоточено на кодирвоания протеина стенограммы, большинство транскрипции генов на самом деле состоит из некодирующих РНК (Ensembl релиз 93). Текущие исследования начинают исследовать это поле, количество публикаций по lncRNAs в процессах заболеваний растет экспоненциально между 2007 и 2017-1. Эти публикации показывают, что многие lncRNAs, связанные с болезнью. Однако молекулярные механизмы этих lncRNAs трудно учиться из-за их различных функций по сравнению с мРНК. Усугубляет проблему понимания роли lncRNAs в болезни, lncRNAs часто выражаются на более низких уровнях, чем кодирования RNAs2. Кроме того lncRNAs плохо сохраняются, что ограничивает функциональные исследования в3человека клетки линии-на основе методов. Один из способов изучить механизм этих новых генов является эндогенно overexpress их в культивируемых клеток. Гиперэкспрессия исследования может предоставить ключевую информацию о функции специфических генов и позволяют исследователям анализировать основные молекулярные пути.
Новый метод для того чтобы активировать транскрипцию генов lncRNA основана на ТРИФОСФАТЫ технологий, первоначально разработанных в лаборатории Gersbach4. Этот протокол был адаптирован для использования в lncRNA биологии и экспрессии этих генов в других системах модель. В ТРИФОСФАТЫ, экспрессирующих технику белок, называемый ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (Cas9) могут быть направлены на последовательность ДНК через антисмысловых gRNA, который распознается Cas9. Как правило Cas9 будет стимулировать расщепления ДНК; Однако мутации в Cas9, ранее разработанных для гиперэкспрессия технику, деактивировать этот шаг5. Когда transcriptional активатор сливается с «мертвых» Cas9 (dCas9) и преобразованы в клеточных линий, эндогенного Сверхэкспрессия lncRNAs может быть достигнуто в4,6. Добавление дополнительных изменений gRNA, включение дополнительных транскрипционный анализ факторов для привязки к gRNA, повышает эффективность активации системы dCas9 гена десятикратного7. Важно отметить, что было продемонстрировано, что transcriptional активации требует непосредственной близости (< 200 bp) для transcriptional запустить сайт генов, включение конкретных upregulation в Джин богатые районы7. В отличие от ТРИФОСФАТЫ нокаут технологий dCas9 и gRNA кассеты должны быть интегрированы в геном для клеток сохранить гиперэкспрессия через несколько поколений. Один из способов добиться этого заключается в использовании lentiviruses для интеграции dCas9 и содержащих gRNA кассеты. После интеграции можно определить выражение гена lncRNA.
В этой статье будет продемонстрирована протокол для lncRNA гиперэкспрессия в модели Jurkat Т-клеток. Пошаговая процедура показана и также может быть адаптирована для адэрентных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Важно отметить, что этот протокол использует репликацию недостаточным lentiviruses. Вирусная обработки только после соответствующей лаборатории безопасности подготовки. Блич все предметы и поверхности, которые вступают в контакт с живые вирусы как минимум 10 минут после обработки. Использование одноразовых лаборатории пальто и лица/глаз защиты, а также двойных перчаток, во все времена. Выполните работу вирус в биобезопасности уровня 2 + лабораториях с вирусной сертификации. Посвятите вирусных работа капюшоны тканевые культуры и инкубаторы.
1. Векторный Дизайн и поколения
Примечание: Лучший способ для определения последовательности gRNA заключается в использовании онлайн дизайн инструменты (например, http://crispr-era.stanford.edu) (Дополнительные рисунок 1: gRNA дизайн). Для сопровождающих представителя эксперимента компании разработан и создан gRNA векторов используется в представитель эксперимента. Плазмида dCas9 было также приобрести через Интернет.
- GRNA последовательность расположен вверх по течению от нуклеотидной последовательности «Нг», где «N» — любой нуклеотид, который также находится в пределах 100 пар оснований transcriptional запуск сайта. Поиск генетических баз данных, таких как БЛАТ (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) для gRNA последовательности, чтобы убедиться есть без других сайтов в геноме с аналогичными последовательностей (Дополнительные рисунок 2: БЛАТ). Это будет гарантировать, что gRNA последовательность является уникальным для гена интереса (ГОИ).
- Хранить gRNA и dCas9 плазмиды, которые приходят как бактериальный заглушки, при 4 ° C. Полоса из Escherichia coli на Лурия бульон (LB) агар пластины с ампициллин (Справочная таблица 1) и расти бактерий на ночь при 37 ° C.
- Выберите колонии и расти бактерий в 5 мл фунтов с ампициллин (Справочная таблица 1) на ночь, энергично встряхивать пластину в инкубаторе 37 ° C. Следующий день, добавить 2 мл бактерий до 200 мл фунтов с ампициллина расти в колбе 2 Л, энергично встряхивать флакон на ночь в инкубаторе 37 ° C.
- Спин вниз бактерий на 3,724 x g 20 мин удалить средства массовой информации и место трубка, содержащая бактерии на льду.
-
Очищайте бактериальной ДНК, используя набор очищения плазмиды за производителя протокол.
Примечание: наборы очищения плазмиды содержат несвободные ресуспендирования буфер, буфера lysis, мыть буфер, буфер уравновешивания и Элюирующий буфер.- Добавьте 10 мл буфера ресуспендирования из комплекта для бактерий и пипетки бактерии в раствор. Затем добавить 10 мл буфера lysis из комплекта ресуспензированы бактерий и смешивать их, инвертирование трубки. Подождите 5 минут, чтобы лизировать бактерий; затем добавить 10 мл ледяной нейтрализации буфера из комплекта в лизированных бактерий и смешивать их, инвертирование трубки.
- Сбалансировать столбце ДНК из комплекта с 10 мл уравновешивания буфера для 5 минут влить образцы в ДНК столбец фильтра и пусть решение пройти через фильтр.
- Стирать образцы 2 x с 30 мл мыть буфер и, затем, элюировать ДНК с 30 мл Элюирующий буфер в 15 мл Конические трубки. Медленно слой 10,5 мл изопропанола при комнатной температуре на eluted ДНК, перевернуть трубку и сразу же его спина на 16200 x г за 30 мин при 4 ° C.
- Удалить супернатант и добавить 1 мл 70% этанола в Пелле ДНК. Ресуспензируйте гранулы, стряхивая трубки. Его спина на 16200 x g 10 мин при температуре 4 ° C и использовать кончик накапайте 200 мкл, чтобы удалить большую часть этанола. Просушите Пелле за 5 мин Ресуспензируйте в 200 мкл воды и хранить ДНК при-20 ° C. Ожидаемые концентрации будет > 1 мкг/мкл.
2. вирус поколения и частиц фото
- Когда все готово для создания dCAS9-содержащих Лентивирусы, пальто 100 мм культуры ткани блюда с 5 мл 0,01% поли L-лизин (Справочная таблица 1). Тщательно удалить лишнюю жидкость из пластин и пусть воздушно-сухой на несколько минут в кабинете биобезопасности.
- Клемная 5 x 106 ГЭС 293T клетки за блюдо в 10 мл полной Дульбекко изменение средних орла (DMEM) (Справочная таблица 1) и инкубировать их на ночь при 37 ° C с 5% CO2. На следующий день, удалите средство от ГЭС 293T блюд и добавляют 10 мл полной DMEM.
- Mix 6.5 мкг плазмида pMDLg/pRRE, содержащий кляп/Поль (компоненты вируса), 3,5 мкг плазмида pMDG2.G, содержащие VSV-G (компонент вируса), 2,5 мкг плазмида pRSV-Rev содержащих Rev (компонент вируса), 10 мкг долго терминала повторить ( LTR)-содержащих gRNA вектор или LTR-содержащих dCas9 векторные и добавить воду, чтобы суммарный объем 450 мкл. Фильтр смесь через наконечник 0.2 мкм фильтр прилагается к шприцу.
- 50 мкл 2,5 М CaCl2 (Справочная таблица 1) для каждой трансфекции образец ДНК и осторожно перемешать. Фильтр кальция/ДНК смесь через наконечник 0.2 мкм фильтр прилагается к шприцу. Накапайте 500 мкл 2 x HBS (Справочная таблица 1) в 5 мл трубку из полистирола. Добавьте 500 мкл ДНК/CaCl2 смеси каплям и аккуратно вихря. Инкубации при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Медленно добавьте 1 мл суспензии /HBS ДНК/CaCl2к каждому блюду. Сразу же вихрем блюда равномерно распределить содержимое. Инкубировать каждое блюдо на ночь в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- На третий день медленно снимите и выбросьте СМИ от блюд. Тщательно вымыть клетки 1 x с фосфат амортизированное saline (PBS). Добавьте 6 мл полной DMEM дополнены 20 мм HEPES и натрия бутират 10 мм. Инкубировать клетки для 5-6 ч в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- Вымыть клетки 1 x с PBS и добавьте 5 мл полного DMEM с 20 мм HEPES ГЭС 293T клетки. Инкубируйте 12 h ночь в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- На 4 день собирать supernatants клетки 293T ГЭС и фильтровать супернатант. Заморозить 1 мл аликвоты-80 ° c.
- Когда будете готовы использовать вирус, оттепель Алиготе вирусные частицы, содержащие кондиционером СМИ (хранится как описано в шаге 2.8) на льду. Довести все реагенты до комнатной температуры.
-
Используйте p24 твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) Комплект для количественного определения количество вирусных частиц на миллилитр.
- Разбавьте концентрат мыть из комплекта, добавив 19 частей дистиллированной деионизированной воды. Разбавить положительный контроль из комплекта 200 нг/мл, используя RMPI 1640 в качестве растворителя и сделать разведениях для стандартной кривой в 1,5 мл трубки согласно p24 ELISA разрежения таблицы (Справочная таблица 2).
- Добавить 20 мкл 5% Тритон X-100 для всех скважин, кроме пустого субстрата. Добавьте 200 мкл RPMI 1640 отрицательный контроль скважины. Добавьте 200 мкл каждого стандарта (в двух экземплярах) в назначенный скважин.
- С помощью спектрофотометра, измерьте концентрацию вируса в пределах образцы, с использованием стандартной кривой. Запустите образец разрежения в 1:1,000 и изменить громкость как необходимые для того, чтобы находиться в пределах диапазона калибровочной кривой. Развести образцы с Тритон X-100 до конечной концентрации 0,5% и добавьте 200 мкл каждого образца в RPMI 1640 назначенных скважин. Уплотнение пластину и инкубировать в течение 2 часов при 37 ° C.
- Вымойте тарелка 6 x с 300 мкл 1 x мыть буфера в колодец. Удалите любой избыток жидкости, инвертирование пластину и выстукивать на бумажное полотенце. Добавьте 100 мкл антител детектор из комплекта для всех скважин, кроме пустого субстрата. Уплотнение пластину и проинкубируйте 1 ч при 37 ° C. Вымойте тарелку и, затем, удалите любой избыток жидкости, инвертирование пластину и выстукивать на бумажное полотенце.
- Для того чтобы измерить детектор антитела, подготовьте стрептавидина-пероксидаза (SA-ПХ) в течение 15 минут использования. Разбавьте SA-ПХ на масштаба 1: 100 с SA-ПХ разбавителя. Тщательно перемешать разреженных SA-ПХ и добавьте 100 мкл все скважины за исключением пустой. Печать и инкубировать пластину для 30 мин при комнатной температуре.
- Вымойте тарелку с 1 x мыть буфера и прочь коснитесь любой избыток жидкости как шаг 2.10.4. Использование раствора субстрата орто фенилендиамином (OPD), который обеспечивает пероксидазы необходимых субстратах производить хемилюминесценции, в течение 15 минут подготовки. Используете одну таблетку OPD 11 мл разбавителя субстрата для каждой пластины.
- Вихрь OPD решение энергично растворения его и защитить его от света. Добавьте 100 мкл раствора субстрата OPD для всех скважин, включая пустые. С помощью спектрофотометра, читать поглощения на 450 Нм немедленно, повторите этот 10 x интервалы 1 s и среднее измерение.
3. dCas9 -VP64 трансдукция
- Культура Jurkat Т-клеток в полной DMEM в колбе T75 с плотностью 2 х 106 клеток в 15 мл средства массовой информации. Культура клетки в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
- Спин вниз ячейки для 5 мин на 233 x g и, затем, Ресуспензируйте их в 10 мл сокращение сыворотке СМИ. Подсчет количества ячеек с Горяева или счетчик автоматизированных клеток.
- Ресуспензируйте и пластина 1 х 106 клеток Jurkat в 5 мл сокращение сыворотке СМИ с Полибрен (Справочная таблица 1) в колбе T75. Добавьте ГЭС с кондиционером 293T СМИ, содержащие 1 x 10-6 , dCas9-содержащих вирусных частиц. Количество вирусных частиц могут быть рассчитаны примерно с p24 ELISA потому что 1 мкг/мл p24 составляет 1 x 107 вирусных частиц. Положите колбы в инкубаторе 37 ° C с 5% CO2.
4. отбор и клон Создание
- Три дня после инфекции, спина вниз клетки на 233 x g 5 мин и Ресуспензируйте их в 10 мл полного DMEM с puromycin (Справочная таблица 1). Пластина клеток в колбах T75 и культуры их при 37 ° C с 5% CO2. Каждый третий день, в течение 9 дней, спина вниз клетки на 233 x g 5 мин и заменить средства массовой информации с полным DMEM с puromycin.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева или счетчик автоматизированных клеток. На 96-луночных тарелку с тканевой культуры плита 10 000 ячеек в 100 мкл полного DMEM с puromycin в первом хорошо и серийно разбавить содержимое следующих скважин с полным DMEM с puromycin 1:1. Выполнять 24 разведений и повторите этот 4 x на пластину для того, чтобы обеспечить, что есть достаточное количество ячеек на хорошо. Инкубируйте клетки при 37 ° C с 5% CO2.
- Разверните клоновых клеток в два 24-ну пластины, а затем в 6-ну плиту и в конечном итоге в колбе T75. Для того, чтобы сосредоточиться на трех клонов, плита 2 x 106 клеток на хорошо 6-ну плиты для трех из клонов. Плита, три других скважин с nontransduced Jurkat клетки как элементы управления. Положите клетки в инкубатор культуры клеток на ночь.
- Для извлечения РНК используйте коммерчески доступных комплект изоляции РНК. Спин вниз клетки на 233 x g 5 мин при комнатной температуре и удалить средства массовой информации. Используете 1 мл наконечник пипетки для Ресуспензируйте клетки в 350 мкл буфера lysis. Добавить 350 мкл 70% этанола в лизированных клетках, тщательно перемешать с 1 мл пипетки и передать образец столбце РНК.
- Спина лизатов на 10000 x g за 1 мин, удалите потока через и добавить 700 мкл буфера мытья низкой жесткости из комплекта в столбце. Спина лизатов на 10000 x g за 1 мин, удалить потока через и 80 мкл DNase I решения из комплекта в столбце; Пусть образцы Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре.
- Спина лизатов на 10000 x g за 1 мин, удалите потока через и 700 мкл буфера мытья высокой жесткости из комплекта к столбцу. Спина лизатов на 10000 x g за 1 мин, удалите потока через и 700 мкл буфера низкой жесткости мыть в столбце.
- Удалите столбец из коллекции трубки и передача его в новой коллекции трубки. Спиновые лизатов на 10000 x g за 1 мин и, затем перенесите столбце РНК в 1,5 мл трубку. Добавьте 50 мкл воды столбец и спина на 10000 x g за 1 мин.
- Используйте спектрофотометр для количественного определения концентрации РНК. Ожидать, что концентрация составляет от 100-500 нг/мкл, с 260/280 поглощения между 1.9-2.1. Магазин РНК-80 ° c.
- В 250 мкл трубы, добавить 1 мкг РНК, 4 мкл дополнительных буфера синтеза ДНК — (cDNA кДНК), 1 мкл обратной транскриптазы, и вода в окончательный объем 20 мкл. включают элементы управления не обратной транскриптазы. В тепловая велосипедист синтеза cDNA на 42 ° C в течение 30 мин и на 95 ° C за 5 минут, чтобы инактивировать обратной транскриптазы. Разбавьте после синтеза cDNA с 60 мкл воды.
- Подготовьте полимеразной цепной реакции (PCR) содержащий 5 мкл SYBR зеленый, 4 мкл cDNA, 0.5 мкл вперед праймера (10 мкм) и 0,5 мкл обратного праймера (10 мкм). Запустите PCR следующим образом: шаг 1 = 95 ° C в течение 3 мин, шаг 2 = 95 ° C 10 s, шаг 3 = 60 ° C для 10 s, а затем, повторите шаги 2 и 3 для 30 x.
Примечание: Последовательность для грунтовки вперед dCas9, 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA и последовательность для обратного грунт dCas9, 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Форвард грунтовка для гипоксантин Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) является 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT и обратный грунт является 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA трансдукции, выбор, клон , Создание и скрининг
- Retransduce проверяемые ячейки Jurkat-dCas9 с gRNA содержащих вирусов, как указано в разделе 3. Выделите ячейки в среде DMEM с hygromycin (Справочная таблица 1) за 10 дней. Спин вниз ячейки и измените СМИ каждые 3 дня.
- Выполнить последовательный разрежения клеток (как описано в шаге 4.2) и расширения отдельных колоний (как описано в шаге 4.3). Очистить РНК из колоний точно так, как описано в шаге 4.5 и выполнять синтеза cDNA как описано в шаге 4.9. Выполнять ПЦР в реальном времени против ГОИ и HPRT1 или соответствующие хозяйственные гена, аналогично для ПЦР описано в шаге 4.10, за исключением в этом случае изображение лунки каждого цикла после шага 3.
- Используйте метод порог (Ct) сравнительной цикла для определения раз изменения в ГОИ8. Вкратце, используйте следующее уравнение для расчета уровней относительное стенограммы (RTLs): 2-(средняя Ct ГОИ – средняя Ct уборки гена). Затем рассчитать среднее RTL элементов управления и разделить все значения RTL средняя управления RTL для генерации раз изменения по сравнению с образцами управления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Система двойной Векторный overexpress lncRNA IFNG-AS1
Например эксперимент в этой рукописи является гиперэкспрессия модель системы Jurkat Т-клеток, выражая lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 является lncRNA, связанных с воспалительным заболеванием кишечника, что видел регулировать интерферона гамма10. Ген IFNG-AS1 содержит три варианта соединения, которые используют тот же сайт transcriptional Пуск (Рисунок 1A). Таким образом gRNA последовательностей, которые были 10 и 100 ВР от transcriptional стартовый сайт и последовательности «Нг» вверх по течению использовались для руководства Cas9-активации комплекса transcriptional Локус IFNG-AS1 (рис. 1A). Система двух плазмида была использована передавать dCas9 или оформления/усилители в клетки как единый плазмида одиночку делает вирусных частиц поколение трудно из-за размера плазмида (Рисунок 1B). Чтобы включить выделение ячеек, двойной преобразованы, вектор dCas9 содержится ген сопротивления puromycin (aminonucleoside), а gRNA содержащих плазмида сопротивления гена hygromycin (аминогликозидов). Оформления были слиты MS2 эшафот последовательность, которая позволила MS2 эшафот белка для привязки к оформления. Сливается с MS2 белка являются дополнительные transcriptional активаторы для повышения гиперэкспрессия IFNG-AS17. Используя эти векторы, вирусные частицы могут быть созданы передавать эту систему гиперэкспрессия в большинство человеческих клеточных линий.
Вирусный titering и колонии скрининг
После создания dCas9 - и gRNA содержащих плазмид, очищения плазмиды были выполнены и были созданы lentiviruses. Как lentiviruses случайным образом интегрировать их кассеты в геноме, количественная оценка количество вирусных частиц позволяет наименее количество внедрений возможно. Для этого, кондиционером медиа содержащих вирусов были измерены с p24 комплект ELISA, позволяя для расчета числа вирионов на миллилитр. После измерения, как вирусный supernatants был почти 1 мкг/мл p24, которая позволила использовать 100 мкл вируса передавать Jurkat клетки. После трансдукции серийно разводили антибиотик выбранные ячейки и клоны были расширены. Cas9 выражение затем был проанализирован ПЦР в реальном времени и электрофорез геля агарозы (рис. 2B). Оба клоны выбран были положительными для выражения Cas9. Для подтверждения выражение mRNA, обратная транскриптаза был опущен из cDNA реакции (рис. 2B). Праймеры против HPRT1 были использованы для подтверждения наличия РНК в nontransduced клетках.
Измерения экспрессии генов IFNG-AS1
С помощью dCas9 клоны как линия родительской клетки, клетки были преобразованы с nontargeting gRNA содержащий вирус или вирус, содержащий оформления против IFNG-AS1. После gRNA трансдукции, выбор и создание клона аналогичен dCas9 клеток линии создания была измерена IFNG-AS1 выражение для проверки гиперэкспрессия. IFNG-AS1 производит три варианта соединения, каждая из которых может быть обнаружен индивидуально с Стенограмма специфические праймеры (красный) или против всех известных IFNG-AS1 стенограммы (синий) (Рисунок 3А). Все флуоресценции кривые были экспоненциального с HPRT1 достижения экспоненциальная фаза (или КТ) в течение половины цикла между элементом управления и IFNG-AS1-gRNA выражая клетки (рисунок 3BC). Праймеры против всех известных IFNG-AS1 стенограммы были наиболее обнаружению между эксперименты с измерениями кратной увеличение IFNG-AS1 (рис. 3B). Хотя грунтовки против стенограммы против 1 и 2 успешно усиливается в мононуклеаров периферической крови (получения), эти стенограммы были не обнаружить в Jurkat клетках (данные не показаны). Однако когда третий Стенограмма IFNG-AS1 было обнаружено в концентрации РНК, в 5-десятикратный значительное увеличение уровня IFNG-AS1 был замечен. Эти данные показывают, либо альтернативного сплайсинга IFNG-AS1 в Jurkat клетки существуют по сравнению с первичной клетки. Праймеры против IFNG-AS1 обнаружено значительное увеличение данного гена, таким образом проверка активации ТРИФОСФАТЫ гиперэкспрессия системы.
Рисунок 1: система двойной Векторный overexpress lncRNA IFNG-AS1. (A) A схема IFNG-AS1 генной структуры и отношения между сайтов связывания РНК (gRNA) руководство и transcriptional стартовый сайт (TSS). (B) особенности gRNA и dCAS9 векторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: вирусный titering и колонии скрининг. (A) пример p24 ELISA калибровочной кривой для человека содержащих, кондиционером средств массовой информации. Черные точки представляют собой стандартные образцы и красные точки неизвестных образцов. (B) после преобразователя, выбор и создание колоний, ПЦР в реальном времени и электрофорез геля против dCas9 были исполнены на РНК от либо nontransduced Jurkat клеток (родителей) или преобразованы dCas9 клонов. Элементы управления обратной транскриптазы (No RT) не были выполнены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: измерение экспрессии генов IFNG-AS1. (A) A схема взаимосвязи между грунтовка наборы и Стенограмма варианты. Красные стрелки представляют Стенограмма специфические праймеры, в то время как синие стрелки указывают грунтовки против всех известных стенограммы. (B и C) представитель средний PCR кривых и количественной фолд изменения для элемента управления и клеток, экспрессирующих IFNG-AS1. РФС = относительная флуоресценции единицы. N = 3 образцы каждой группы. Значит, ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. Студент t-тест используется для вычисления p-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительные рисунок 1: gRNA дизайн Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные рисунок 2: БЛАТ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Справочная таблица 1: решения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Справочная таблица 2: ELISA разведения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись представляет собой протокол для использования активации ТРИФОСФАТЫ для overexpress lncRNAs в пробирке. Это особенно важно техника при изучении длиной некодирующих РНК как продукт транскриптомики является функциональное подразделение. После гиперэкспрессия исследователь может затем, использовать эти клетки увеличить соотношение сигнал шум при изучении привязки партнеров и даже измерить сотовой последствия повышенного уровня lncRNAs. Кроме того как lncRNAs часто действуют на СНГ генов, эта методика эндогенного гиперэкспрессия позволяет эти события, чтобы быть изучены11,12.
Эта рукопись освещает обобщенных протокол для создания gRNA и Лентивирусы поколения, трансдукция и выбор, и репрезентативного примера Сверхэкспрессия lncRNA в периферической крови клеток T линия шла. Кроме того этот метод уже было показано, чтобы быть успешным в кости-костного мозга производные иммунные клетки13, нейроны7, мыши эмбриональные стволовые клетки14и эпителиальных клеток почек4. Хотя этот протокол обычно применяется для большинства клеточных линий, клетки, которые трудно передают может потребовать отдельных титры, чтобы выше инфекции. Кроме того важно выполнить антибиотикам убивать кривых при использовании новых клеточных линий, поскольку этот протокол использует положительный выбор стратегии.
Следует отметить этот протокол имеет некоторые технические аспекты, которые требуют особого внимания. Воспроизводимость и последовательное дозирование для ПЦР в реальном времени имеет решающее значение для установления воспроизводимые результаты. Даже небольшие различия в объемах приведет к весьма переменных значений, тем самым затрудняя интерпретации. В дополнение к надлежащей конструкции праймера PCR количественных элементов управления, включая элемент без транскриптазы для реального времени PCR праймеры, решающее значение, поскольку они подтверждают, что РНК количественно не является геномной ДНК. Выбор уборки генов для ПЦР в реальном времени также имеет важное значение для того, чтобы адекватно выполнять эти эксперименты. В то время как HPRT1 был выбран в этом протоколе, другие гены интересов мишенью этот метод может изменить HPRT115. Тщательный отбор уборки генов, основанные на этих факторов должны приниматься во внимание.
Есть несколько недостатков для активации ТРИФОСФАТЫ и к конкретным аспектам этого протокола. Одним из потенциальных недостатков является выражением стенограммы в регионах весьма ген-богатые люди как другие соседние генов может быть включен. Вполне возможно, что соседние генов в непосредственной близости от может быть активирован и элементы управления должны быть выполнены оценить это. Кроме того другие ограничения относятся отсутствие привязки для конкретного оформления к заданной последовательности ДНК. Выбор нескольких оформления может потребоваться определить соответствующие gRNA диск выражение. Еще один нюанс в системе является то, что ячейка интерес иметь способность управлять промоутеров в кассеты для того чтобы управлять выражение оформления и dCas9. Для исследования, представленные здесь модель Jurkat Т-клеток был в состоянии управлять выражение этих компонентов для успешного гиперэкспрессия системы.
В идеале протокол, описанные здесь следует быть в паре с другой подтверждающей информации, как единый Стенограмма гиперэкспрессия данных и функциональных эффектов от нокдаун или нокаут исследований, чтобы укрепить в случае любых последующих выводов. Эта техника предлагает надежный способ экспрессирующих любой ген в конкретной ячейке тип. Учитывая ограниченность lncRNA биологии, таких как сохранение бедных видов, такие методы, как один описаны здесь имеют решающее значение для изучения их функции в типы соответствующих клеток. Это исследование сосредоточено на один lncRNA, который был вовлечен в патофизиологии воспалительных кишечника болезнь, но служит моделью изучения функции других lncRNAs в биологии болезней человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
C.P. поддерживается RO1 DK60729 и P30 ДК 41301-26. Д.п. поддерживается крона и колит фонда (CCFA) карьеры премии в области развития, лечения: DK41301 центр исследований пищеварением заболеваний (DDRC) и клинических UCLA на всей территории отеля и в трансляционной институт науки (CTSI) UL1TR0001881. UCLA вирусологии ядро финансировалась центром СПИДа исследований (CFAR) предоставить 5P 30 AI028697. UCLA комплексной молекулярных технологий, которую ядро было поддержано CURE/P30 Грант DK041301. Эта работа также была поддержана UCLA СПИДа института.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
