Summary
Traditionella cDNA-baserade överuttryck tekniker har en begränsad tillämplighet för överuttryck av långa icke-kodande RNAs på grund av deras flera splice formulär med potentiella funktionalitet. Denna översyn rapporterar ett protokoll som tekniken CRISPR till överuttrycka flera skarv varianter av en lång kodande RNA.
Abstract
Långa icke-kodande RNA (lncRNA) biologi är en ny och spännande forskningsfält, med antalet publikationer från fältet växer exponentiellt sedan 2007. Dessa studier har bekräftat att lncRNAs ändras i nästan alla sjukdomar. Studera de funktionella rollerna för lncRNAs i samband med sjukdomen förblir dock svårt på grund av avsaknaden av proteinprodukter, vävnad-specifika uttryck, låga nivåer, komplexiteten i splice former, och bristen på bevarande bland arter. Med tanke på de artspecifika uttrycket, är lncRNA studier ofta begränsade till mänskliga forskningssammanhang när man studerar sjukdomsprocesser. Eftersom lncRNAs fungerar på molekylär nivå, är ett sätt att dissekera lncRNA biologi att ta bort lncRNA eller överuttrycka lncRNA och mäta cellulära effekter. I den här artikeln presenteras ett skriftligt och visualiserade protokoll till överuttrycka lncRNAs in vitro. Som ett experiment med representativa visas ett lncRNA som är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), för att i ökad utsträckning i Jurkat T-cell modell. För att åstadkomma detta, används aktiverande klustrade regelbundet mellanliggande kort palindromic repetitioner (CRISPR) tekniken för att aktivera överuttryck på de endogena genomisk loci. Aktiverande CRISPR tekniken riktar en uppsättning transkriptionsfaktorer till webbplatsen transkriptionell start av en gen, möjliggör en robust överuttryck av flera lncRNA splice formulär. Detta förfarande kommer att delas upp i tre steg, nämligen (i) guide RNA (gärna) design och vektorn konstruktion, (ii) virus generation och transduktion och (iii) kolonin screening för överuttryck. För detta representativa experiment, en större än 20-fold förbättring i IFNG-AS1 i Jurkat T-celler observerades.
Introduction
Medan de flesta biomedicinsk forskning fokuserat på protein-kodning avskrifter, består majoriteten av transkriberas gener faktiskt av icke-kodande RNAs (häckning release 93). Aktuell forskning börjar utforska detta område, antalet publikationer på lncRNAs i sjukdomsprocesser som ökar exponentiellt mellan 2007 och 20171. Dessa publikationer visar att många lncRNAs är förknippade med sjukdomen. Molekylära mekanismer för dessa lncRNAs är dock svårt att studera på grund av deras olika funktioner jämfört med mRNA. Förvärrar problemet med att förstå rollen som lncRNAs vid sjukdom, uttrycks lncRNAs ofta på lägre nivåer än kodande RNAs2. Dessutom bevaras dåligt lncRNAs, vilket begränsar de funktionella studierna i mänskliga-cell-linjen-baserade tekniker3. En metod att studera mekanismen för dessa nya gener är att endogenously överuttrycka dem i odlade celler. Överuttryck studier kan ge viktig information om funktionen för specifika gener och möjliggöra forskare att dissekera viktiga molekylära vägar.
En ny metod för att aktivera transkriptionen av lncRNA gener är baserat på CRISPR tekniker utvecklades ursprungligen av Gersbach laboratorium4. Detta protokoll har anpassats för användning i lncRNA biologi och för uttrycket av dessa gener i andra modellsystem. I den CRISPR överuttryck av teknik, kan ett protein som kallas CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) riktas mot en DNA-sekvens via en antisense gärna som känns igen av Cas9. Normalt, kommer Cas9 inducera DNA klyvning; dock inaktivera mutationer i Cas9, tidigare utvecklat för överuttryck teknik, detta steg5. När en transkriptionell aktivator smälts samman till en ”dead” Cas9 (dCas9) och sensorik i cellinjer, den endogena överuttryck av lncRNAs kan vara uppnådda4,6. Tillägg av ytterligare ändringar den gärna, möjliggör ytterligare transkriptionell faktorer att binda till gärna, ökade effekten av det dCas9 genen aktiveringssystemet 10-faldig7. Ännu viktigare, det visades att transkriptionell aktiveringen kräver närhet (< 200 bp) till den transkriptionell starta webbplatsen gener, aktivera en specifik uppreglering i gen-rika områdena7. Till skillnad från CRISPR knockout teknik behöver dCas9 och gärna kassetter integreras i genomet för celler att behålla ett överuttryck över flera generationer. En metod att uppnå detta är att använda lentiviruses för att integrera dCas9 och gärna innehållande - kassetter. Efter integration, kan lncRNA genuttrycket bestämmas.
I denna artikel, kommer ett protokoll för lncRNA överuttryck i Jurkat T-cell modell att demonstreras. Stegvisa instruktioner visas och kan också anpassas till vidhäftande celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Det är viktigt att observera att detta protokoll använder replikering-brist lentiviruses. Utföra viral hantering endast efter lämpliga lab säkerhetsutbildning. Bleka alla föremål och ytor som kommer i kontakt med levande virus i minst 10 min efter hantering. Använd en disponibel lab coat och ansikte/ögon skydd, liksom dubbla handskar, hela tiden. Utföra virus arbete i biosäkerhet nivå 2 + labs med viral certifiering. Ägna vävnadsodling huvor och inkubatorer till viral arbete.
1. vektor Design och Generation
Obs: Det bästa sättet att identifiera gärna sekvenser är att använda online-designverktyg (t.ex. http://crispr-era.stanford.edu) (kompletterande figur1: gärna design). För det medföljande representativa experimentet, ett företag utformas och skapas gärna vektorer används i representativa experimentet. DCas9 plasmiden köptes också online.
- Sekvensen gärna ligger uppströms om av nukleotidsekvensen ”NGG”, där ”N” är någon nukleotid, som också ligger inom 100 base-par av webbplatsen transkriptionell start. Söker gärna sekvensen, att se till att det finns inga andra platser i arvsmassan med liknande sekvenser genetiska databaser såsom BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) (kompletterande figur 2: BLAT). Detta kommer att säkerställa att sekvensen gärna är unik för gen av intresse (GOI).
- Förvara de gärna och dCas9 plasmider, som kommer som bakteriell stubbar, vid 4 ° C. Strimma ut Escherichia coli på en Luria buljong (LB) agar med ampicillin (kompletterande Tabell1) och växa bakterier över natten vid 37 ° C.
- Plocka en koloni och växa bakterier i 5 mL LB med ampicillin (kompletterande Tabell1) över natten, kraftigt skaka plattan i en 37 ° C inkubator. Nästa dag, tillsätt 2 mL av bakterier till 200 mL LB med ampicillin växer i en 2 L kolv, kraftigt skaka kolven över natten i en 37 ° C inkubator.
- Snurra ner bakterier vid 3.724 x g i 20 min. ta bort media och plats röret som innehåller bakterier på isen.
-
Rena bakteriell DNA med hjälp av en plasmid rening kit per tillverkarens protokollet.
Obs: plasmid rening Kit innehåller egenutvecklad resuspension buffert, lyseringsbuffert, tvättbuffert, Jämviktstiden buffert och eluering buffert.- Tillsätt 10 mL av resuspension buffert från kit till bakterier och Pipettera bakterierna i lösningen. Sedan, tillsätt 10 mL lyseringsbuffert från kit till de återsuspenderade bakterierna och blanda dem genom att vända tuben. Vänta 5 min för att lysera bakterien; sedan, tillsätt 10 mL av iskall neutralisering buffert från kit till lyserat bakterierna och blanda dem genom att vända tuben.
- Temperera kolumnen DNA från kit med 10 mL Jämviktstiden buffert för 5 min. Häll proverna i kolumnen DNA filtrera och låt lösningen passerar genom filtret.
- Tvätta proverna 2 x med 30 mL tvätta buffert och, sedan eluera DNA med 30 mL eluering buffert i en 15 mL koniska rör. Långsamt lager 10,5 mL isopropanol i rumstemperatur på eluerade DNA vänd tuben och omedelbart spinna på 16 200 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL 70% etanol till DNA pelleten. Återsuspendera pelleten genom att snärta röret. Snurra det vid 16 200 x g i 10 minuter vid 4 ° C och Använd ett 200 μL Pipettera tips att ta bort de flesta av etanol. Lufttorka pelleten i 5 min och återsuspendera det i 200 μL av vatten, och lagra DNA vid-20 ° C. Den förvänta koncentrationen blir > 1 μg/μL.
2. virus Generation och partikel räknas
- När du är redo att skapa de dCAS9-innehållande lentivirus, coat 100 mm vävnadsodling rätter med 5 mL 0,01% poly-L-Lysin (kompletterande Tabell1). Ta bort överflödig vätska noggrant från plattorna och låt dem lufttorka några minuter i en biosäkerhet skåp.
- Tallrik 5 x 106 HEK 293T celler per maträtt i 10 mL av komplett Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) (kompletterande Tabell1) och inkubera dem över natten vid 37 ° C med 5% CO2. Nästa dag, ta bort mediet från HEK 293T rätter och tillsätt 10 mL av komplett DMEM.
- Blanda 6,5 μg av Plasmiden pMDLg/pRRE som innehåller den gag/pol (komponenter av viruset), 3,5 μg av de plasmiden pMDG2.G som innehåller den VSV-G (en komponent av viruset), 2,5 µg i plasmiden pRSV-Rev med Rev (en komponent av viruset), 10 μg av en lång terminal upprepa ( LTR)-som innehåller gärna vektor- eller en LTR-innehållande dCas9 vektor och tillsätt vatten till en total volym på 450 μL. Filtrera blandningen genom ett 0,2 µm filter tips bifogas en spruta.
- Tillsätt 50 µL 2,5 M CaCl2 (kompletterande Tabell1) i varje transfection prov av DNA och blanda försiktigt. Filtrera kalcium/DNA blandningen genom ett 0,2 µm filter tips bifogas en spruta. Pipettera 500 µL av 2 x HBS (kompletterande Tabell1) i en 5 mL polystyren röret. Tillsätt 500 µL DNA/CaCl2 mix droppvis och försiktigt vortex. Odla i rumstemperatur i 3 min.
- Tillsätt 1 mL av DNA/CaCl2/HBS suspensionen till varje maträtt. Omedelbart snurra rätterna för att distribuera innehållet jämnt. Inkubera varje maträtt över natten i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Dag 3, sakta avlägsna och kassera media från rätter. Noggrant tvätta cellerna 1 x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 6 mL komplett DMEM kompletteras med 20 mM HEPES och 10 mM natrium butyrate. Inkubera cellerna för 5 – 6 h i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Tvätta cellerna 1 x med PBS och tillsätt 5 mL av komplett DMEM med 20 mM HEPES i HEK 293T celler. Inkubera i 12 h över natten i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C.
- På dag 4, samla HEK 293T cell supernatanterna och filtrera supernatanten. Frysa 1 mL alikvoter vid-80 ° C.
- När du är redo att använda viruset, Tina en alikvot av den virala-partikeln som innehåller betingade media (lagrade som beskrivs i steg 2,8) på is. Placera alla reagenser i rumstemperatur.
-
Använd en p24 enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) kit för att kvantifiera antalet viruspartiklar per milliliter.
- Späd tvätta koncentratet från kit genom att lägga till 19 delar destillerat avjoniserat vatten. Späd den positiva kontrollen från kit till 200 ng/mL, med RMPI 1640 som den spädningsvätska och se spädningarna för standardkurva i 1,5 mL rör enligt p24 ELISA utspädning bord (kompletterande Tabell2).
- Tillsätt 20 μL av 5% Triton x-100 i alla brunnar utom substratet tomt. Tillsätt 200 μl RPMI 1640 till de negativa kontrollbrunnarna. Tillsätt 200 μL av varje standard (i två exemplar) till de utsedda brunnarna.
- Med en spektrofotometer, mäta koncentrationen av viruset inom proverna, använder en standardkurva. Starta provspädningen på 1:1,000 och ändra volymen som nödvändiga för att inom spänna av standardkurvan. Späd ut proverna med Triton x-100 till en slutlig koncentration av 0,5% och tillsätt 200 μl av varje prov RPMI 1640 till utsedda brunnar. Försegla plattan och inkubera det i 2 timmar vid 37 ° C.
- Tvätta plattan 6 x med 300 μL 1 x Tvättbuffert per brunn. Ta bort någon överflödig vätska genom invertering plattan och knacka på en pappershandduk. Tillsätt 100 μL av detektor antikropp från kit till alla brunnar utom substratet tomt. Försegla plattan och inkubera det för 1 h vid 37 ° C. Tvätta plattan och ta sedan bort all överflödig vätska genom invertering plattan och knacka det på en pappershandduk.
- För att mäta detektor antikroppen, förbereda streptividin-pepparrotsperoxidas (SA-HRP) inom 15 min användning. Späd den SA-HRP på 1: 100 med SA-HRP spädningsvätska. Blanda den utspädda SA-HRP och tillsätt 100 μl till alla brunnar utom tomrummet. Försegla och inkubera plattan för 30 min i rumstemperatur.
- Tvätta plattan med 1 x Tvättbuffert och tryck bort någon överflödig vätska som i steg 2.10.4. Använd ortho-fenylendiamin (OPD) Substratlösning, som ger peroxidaset de nödvändiga substratesna för att producera chemiluminescence, inom 15 min av preparatet. Använda en OPD tablett 11 ml av substrat spädningsvätska för varje platta.
- Vortex OPD lösningen kraftigt att upplösa den helt och skydda den från ljus. Tillsätt 100 μL av OPD Substratlösning i alla brunnar, inklusive tomrummet. Med en spektrofotometer, läsa absorbans vid 450 nm omedelbart, upprepa detta 10 x med 1 s intervall och ta genomsnittliga mätning.
3. dCas9 -VP64 transduktion
- Kultur Jurkat T-celler i komplett DMEM i en T75 kolv med en densitet på 2 x 106 celler i 15 mL av media. Odla cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Snurra ner cellerna för 5 min på 233 x g och sedan Återsuspendera dem i 10 mL minskade serum media. Räkna cellerna med en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare.
- Omsuspendera och platta 1 x 106 Jurkat celler i 5 mL minskade serum media med polybrene (kompletterande Tabell1) i en T75 kolv. Lägga till HEK 293T-villkorade media som innehåller 1 x 106 dCas9-innehållande viruspartiklar. Antalet viruspartiklar kan beräknas ungefär från p24 ELISA eftersom 1 μg/mL p24 är lika med 1 x 107 viruspartiklar. Sätta kolvarna i 37 ° C inkubator med 5% CO2.
4. urval och klon skapandet
- Tre dagar efter infektion, snurra ner cellerna vid 233 x g i 5 min och återsuspendera dem i 10 mL av komplett DMEM med puromycin (kompletterande Tabell1). Platta celler i T75 kolvar och kultur dem vid 37 ° C med 5% CO2. Var tredje dag, för 9 dagar, snurra ner cellerna vid 233 x g i 5 min och ersätta mediet med komplett DMEM med puromycin.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad cell räknare. På en plattan med 96 brunnar behandlas med vävnadsodling, plattan 10.000 celler i 100 μL av komplett DMEM med puromycin i första väl och seriellt späd 1:1 innehållet i följande brunnarna med komplett DMEM med puromycin. Utföra 24 utspädningar och upprepa detta 4 x per platta för att säkerställa att det finns ett tillräckligt antal celler per brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
- Expandera klonal celler i två 24-bra plattor, och sedan till en 6-well platta, och så småningom i en T75-kolv. För att fokusera på tre av klonerna, plattan 2 x 106 celler per brunn 6-well platta för tre av klonerna. Tallrik de andra tre brunnarna med nontransduced Jurkat celler som kontroller. Sätta cellerna i en cell kultur inkubator över natten.
- För RNA-extraktion, Använd en kommersiellt tillgänglig RNA isolering kit. Snurra ner cellerna på 233 x g för 5 min i rumstemperatur och ta bort media. Använd en 1 mL Pipettera spets för att resuspendera cellerna i 350 μL lyseringsbuffert. Tillsätt 350 μL i 70% etanol lyserat cellerna, blanda väl med en 1 mL Pipettera och överföra provet till kolumnen RNA.
- Snurra lysates vid 10 000 x g i 1 min, ta bort genomströmmande och tillsätt 700 μL av låg-stränghet tvättbuffert från kit till kolumnen. Snurra lysates vid 10 000 x g i 1 min, ta bort genomströmmande och tillsätt 80 µL av DNAS jag lösning från kit till kolumnen; Låt proverna Inkubera i 15 min i rumstemperatur.
- Snurra lysates vid 10 000 x g i 1 min, ta bort genomströmmande och tillsätt 700 µL av hög-stränghet tvättbuffert från kit till kolumnen. Snurra lysates vid 10 000 x g i 1 min, ta bort genomströmmande och lägga till 700 µL av låg-stränghet tvättlösning i kolumnen.
- Ta bort kolumnen från samling röret och överföra den till en ny samling tub. Snurra lysates vid 10 000 x g i 1 min och överför sedan kolumnen RNA till en 1,5 mL tub. Tillsätt 50 µL av vatten till kolumn och spinn vid 10 000 x g i 1 min.
- Använd en spektrofotometer för att kvantifiera koncentration av RNA. Förvänta sig att koncentrationen var mellan 100 – 500 ng/µL, med en 260/280 absorbansen mellan 1,9-2,1. Store RNA vid-80 ° C.
- Rör, Lägg 1 µg av RNA, 4 µL av kompletterande DNA (cDNA) syntes buffert, 1 µL av omvänt transkriptas till 250 µL och vatten till en slutlig volym av 20 µL. innehåller inga omvänt transkriptas-kontroller. I en termocykel, syntetisera cDNA vid 42 ° C i 30 min och vid 95 ° C i 5 min att inaktivera det omvänt transkriptas. Späd till cDNA med 60 µL vatten efter syntesen.
- Förbereda polymeras kedjereaktioner (primärvården) innehållande 5 µL SYBR green, 4 µL av cDNA, 0,5 µL av forward primer (10 µM) och 0,5 µL av reverse primer (10 µM). Kör PCR enligt följande: steg 1 = 95 ° C i 3 min, steg 2 = 95 ° C under 10 s, steg 3 = 60 ° C under 10 s, och sedan, upprepa steg 2 och 3 för 30 x.
Obs: Sekvensen för dCas9 framåt primern är 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA och sekvensen för den dCas9 reverse primern är 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Forward primer för hypoxantin Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) är 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT och reverse primer är 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gärna transduktion, urval, klon skapelse, och Screening
- Retransduce validerade Jurkat-dCas9 cellerna med gärna innehållande virus som beskrivs i avsnitt 3. Markera celler i DMEM med hygromycin (kompletterande Tabell1) för 10 dagar. Snurra ner cellerna och ändra media varje 3 dagar.
- Utföra en seriell utspädning av celler (enligt beskrivningen i steg 4,2) och expandera enskilda kolonier (enligt beskrivningen i steg 4,3). Rena RNA från kolonierna exakt enligt beskrivningen i steg 4,5 och utföra cDNA syntes som beskrivs i steg 4,9. Utföra realtids-PCR mot Indiens myndigheter och HPRT1 eller en lämplig städning gen, på samma sätt som PCR som beskrivs i steg 4.10, förutom i det här fallet bild brunnarna varje cykla efter steg 3.
- Använd metoden jämförande cykel tröskel (Ct) för att fastställa faldig förändring i GOI8. Kort, använda följande ekvation för att beräkna relativa avskrift nivåer (RTLs): 2-(genomsnittliga Ct av Indiens myndigheter – genomsnittliga Ct av städning genen). Sedan beräkna den genomsnittliga RTL kontroller och dividera alla RTL värden av kontrollen genomsnittliga RTL att generera en fold förändring jämfört med kontrollproverna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En dubbel vector systemet till överuttrycka lncRNA IFNG-AS1
Exempel experimentet i detta manuskript är överuttryck av Jurkat T-cell modellsystem uttrycker lncRNA IFNG-AS19. IFNG-AS1 är ett lncRNA som är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom, som har sett att reglera Interferon Gamma10. IFNG-AS1 genen innehåller tre skarv varianter som alla använder samma transkriptionell startwebbplats (figur 1A). Därför användes gärna sekvenser som var 10 och 100 bp borta från webbplatsen transkriptionell start och hade en ”NGG” sekvens uppströms för att styra Cas9-aktiverande anläggningen till det transkriptionell locus av IFNG-AS1 (figur 1A). Ett två-plasmid-system användes för att transduce antingen dCas9 eller gRNAs/förstärkare i celler som en enda plasmid ensam gör virus-partikeln generation svårt på grund av Plasmiden storlek (figur 1B). För att aktivera dubbel-sensorik cellmarkeringen, dCas9 vector innehöll en puromycin (aminonucleoside) motstånd gen, och gärna innehåller plasmiden innehöll en hygromycin (aminoglykosid) motstånd gen. gRNAs fixerades till en sekvens av MS2-byggnadsställning som aktiverade MS2 byggnadsställning proteinet att binda till gRNAs. Smält till MS2 protein är ytterligare transkriptionell aktivatorer att förbättra överuttryck av IFNG-AS17. Använder dessa vektorer, kan viruspartiklar skapas för att transduce detta överuttryck system i de flesta mänskliga cellinjer.
Viral patientserumprov och kolonin screening
Efter genererar de dCas9 - och gärna-innehållande plasmidsna, plasmid reningar utfördes och lentiviruses skapades. Som lentiviruses integrera slumpmässigt deras kassetter i genomet, en kvantifiering av antalet viruspartiklar möjliggör minst antal integrationer som möjligt. För att åstadkomma detta, luftkonditionering-media-innehållande virus mättes med en p24 ELISA kit, möjliggör beräkning av antalet virioner per milliliter. Efter mätning hade båda viral supernatanterna nästan 1 µg/mL p24, som tillät användning av 100 µL av virus till transduce de Jurkat cellerna. Efter transduktion, antibiotikum är markerade celler späddes seriellt och kloner utökades. Cas9 uttryck var sedan analyseras av realtids-PCR och agaros gel-elektrofores (figur 2B). Båda kloner som valts var positiva för Cas9 uttryck. För att bekräfta mRNA uttryck, utelämnades omvänt transkriptas från cDNA reaktionen (figur 2B). Primers mot HPRT1 användes för att bekräfta förekomsten av RNA i de nontransduced cellerna.
Mäta IFNG-AS1 genuttryck
Använda dCas9 kloner som en Föräldrakontroll cell fodrar, celler var sensorik med antingen en nontargeting gärna innehållande virus eller ett virus som innehåller gRNAs mot IFNG-AS1. Efter gärna transduktion, urval och klon skapande analogt med dCas9 cell linje skapande mättes IFNG-AS1 uttrycket för att verifiera överuttryck. IFNG-AS1 producerar tre skarv varianter, som kan detekteras individuellt med avskrift-specifika primers (röd) eller mot alla kända IFNG-AS1 avskrifter (blå) (figur 3A). Alla fluorescens kurvor var exponentiell HPRT1 för att nå den exponentiella fasen (eller Ct) inom en halv cykel mellan kontroll och IFNG-AS1-gärna-uttryckande celler (figur 3BC). Primers mot alla kända IFNG-AS1 avskrifter var den mest detekterbara mellan experiment med mätningar av 20-fold ökningar av IFNG-AS1 (figur 3B). Medan primers mot avskrifter mot 1 och 2 förstärks framgångsrikt i perifera mononukleära blodceller (PBMC), var dessa avskrifter inte detekterbar i Jurkat celler (inga data anges). Men när den tredje avskriften av IFNG-AS1 var detekterbart i koncentrerad RNA, sågs en fem-till tiofaldig betydande ökning IFNG-AS1 nivåer. Dessa data tyder antingen alternativ splitsning av IFNG-AS1 i Jurkat finns celler jämfört med primära celler. Primers mot IFNG-AS1 upptäckt stora ökningar i denna gen, därmed validera aktiverande CRISPR överuttryck systemet.
Figur 1: en dubbel vector systemet till överuttrycka lncRNA IFNG-AS1. (A) A Schematisk bild av IFNG-AS1 genstruktur och förhållandet mellan guide RNA (gärna) bindande platser och webbplatsen transkriptionell start (TSS). (B) funktioner i de gärna och dCAS9 vektorerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Viral patientserumprov och kolonin screening. (A) ett exempel p24 ELISA Standardkurvan för lentivirus-innehållande, luftkonditionerade medier. De svarta prickarna representerar standardproven och röda prickar okända prover. (B) efter transducing, välja och generera kolonier, realtids-PCR och gelelektrofores mot dCas9 genomfördes på RNA från antingen nontransduced Jurkat celler (föräldrarnas) eller dCas9-sensorik kloner. Inga omvänt transkriptas (nr RT) kontroller utfördes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mäta IFNG-AS1 genuttryck. (A) A diagram över förhållandet mellan primer uppsättningar och avskrift varianter. De röda pilarna representerar avskrift-specifika primrar, medan de blå pilarna visar primers mot alla kända avskrifter. (B och C) representativt genomsnitt PCR-kurvorna och -faldig förändring kvantifieringar för kontroll och IFNG-AS1-överuttryck celler. RFU = relativ fluorescens enheter. N = 3 prover per grupp. Menar ± SD. *p < 0,05, ***p < 0,001. En students t-test användes för att beräkna de p-värden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur1: gärna design Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande figur 2: BLAT Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande tabell 1: lösningar Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Kompletterande Tabell2: ELISA utspädningar Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript presenterar ett protokoll för att aktivera CRISPR överuttrycka lncRNAs in vitro. Detta är en särskilt viktig teknik när man studerar länge icke-kodande RNAs eftersom den transcriptomic produkten är den funktionella enheten. Efter överuttryck, kan forskaren sedan använda dessa celler att öka signal-brus-förhållandet när man studerar bindande partner och även mäta cellulära följderna av ökade nivåer av lncRNAs. Dessutom, eftersom lncRNAs ofta agerar på cis-gener, möjliggör denna endogena överuttryck teknik dessa händelser studerade11,12.
Detta manuskript belyser en generaliserad protokoll för gärna skapandet och lentivirus generation, transduktion och urval, och ett representativt exempel på lncRNA överuttryck i ett perifert blod T cell fodrar skissades. Denna teknik har dessutom redan visat sig vara framgångsrika i ben-märg-härledda immunceller13, nervceller7, mus embryonala stamceller14och njure epitelceller4. Medan detta protokoll gäller generellt för de flesta cellinjer, kan celler som är svåra att transduce kräva enskilda titrar att möjliggöra högre infektionsfrekvensen. Dessutom är det viktigt att utföra antibiotika döda kurvor när du använder ny cellinjer, eftersom detta protokoll använder tredjeparts en positiva urval strategi.
Notera har detta protokoll flera tekniska aspekter som kräver särskild uppmärksamhet. Reproducerbar och konsekvent pipettering för realtids-PCR är avgörande för att fastställa reproducerbara resultat. Även små skillnader i volymer kommer att orsaka mycket varierande värden, vilket försvårar tolkning. Förutom en ordentlig kvantitativa PCR primer design är kontroller, inklusive nr-transkriptas kontroll för realtids PCR primers, kritisk, eftersom de bekräftar att RNA att kvantifieras inte är genomiskt DNA. Urvalet av städning gener för realtids-PCR är också viktigt för att på ett adekvat sätt utföra dessa experiment. Medan HPRT1 valdes i detta protokoll, kan andra gener intressen riktade genom denna teknik påverka HPRT115. Ett noggrant urval av städning gener utifrån dessa faktorer bör beaktas.
Det finns några nackdelar att aktivera CRISPR och särskilda aspekter av detta protokoll. En potentiell begränsning är ett uttryck för avskrifter i mycket gene-rika regioner som andra närliggande gener aktiveras. Det är möjligt att angränsande gener i närheten kan aktiveras och kontroller bör utföras för att bedöma detta. Dessutom är andra begränsningar avsaknad av bindande för viss gRNAs till en viss DNA-sekvens. Val av flera gRNAs kan behöva identifiera den lämpliga gärna till drive uttryck. En annan varning till systemet är att cellen av intresse har kapacitet att köra initiativtagarna i korgarna för att driva ett uttryck för den gRNAs och dCas9. Studierna presenteras här, var den Jurkat T-cell modellen kunna köra uttrycket av dessa komponenter för ett lyckat överuttryck system.
Protokollet beskrivs här bör helst paras ihop med andra bekräftande information, såsom enda avskrift överuttryck data och funktionella effekter från knockdown eller knockout studier, att stärka fallet för någon av de efterföljande resultaten. Denna teknik erbjuder en robust sätt att överuttryck någon gen i en viss celltyp. Med tanke på begränsningarna av lncRNA biologi, såsom dålig arter bevarande, är tekniker såsom det som beskrivs här kritiska för att utforska deras funktion i relevanta celltyper. Denna studie fokuserar på ett lncRNA som har varit inblandade i inflammatoriska tarm sjukdomar patofysiologi men tjänar som modell för att studera funktionen av andra lncRNAs i mänskliga sjukdomar biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
C.P. stöds av RO1 DK60729 och P30 DK 41301-26. D.P. stöds av en Crohns & kolit Foundation (CCFA) karriär development award, botemedel: mag sjukdomar Research Center (DDRC) DK41301, och UCLA klinisk och translationell Science Institute (CTSI) UL1TR0001881. UCLA virologi kärnan finansierades genom centrum av AIDS forskning (CFAR) bevilja 5P 30 AI028697. Den UCLA integrerad molekylär teknik core stöddes av botemedel/P30 bevilja DK041301. Detta arbete fick också stöd av UCLA AIDS Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
