इस प्रोटोकॉल commentalized microfluidic चिप्स के उपयोग को दर्शाता है, मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लिए एक चक्रीय olefin copolymer में ढाला इंजेक्शन. इन चिप्स preassembled और आसान करने के लिए उपयोग पारंपरिक commentalized पाली (dimethylsiloxane) उपकरणों की तुलना में कर रहे हैं. एकाधिक आम प्रयोगात्मक प्रतिमान यहाँ वर्णित हैं, वायरल लेबलिंग सहित, fluidic अलगाव, axotomy, और इम्यूनोस्टेनिंग.
सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को कम्पार्टमेंटल करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों का उपयोग तंत्रिका विज्ञान में एक मानक विधि बन गया है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित न्यूरॉन्स commentalize करने के लिए एक चक्रीय olefin copolymer (COC) में किए गए एक पूर्व इकट्ठे बहु-कम्पार्टमेंट चिप का उपयोग करने के लिए। इन सीओसी चिप्स के पदचिह्न एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड के रूप में ही कर रहे हैं और उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ समान रूप से संगत कर रहे हैं. न्यूरॉन्स चिप के भीतर glutamatergic न्यूरॉन्स में मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) से विभेदित कर रहे हैं और 5 सप्ताह के लिए बनाए रखा, इन न्यूरॉन्स synapses और डेन्ड्रिटिक रीढ़ विकसित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति. इसके अलावा, हम वायरल लेबलिंग, माइक्रो-एसोटॉमी, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री की स्थापना सहित इन बहु-कम्पार्टमेंट चिप्स का उपयोग करके कई सामान्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं।
मानव स्टेम सेल विभेदित न्यूरॉन्स (एचएससी न्यूरॉन्स) तेजी से जैविक अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है. इन न्यूरॉन्स, जो मानव स्रोत सामग्री से प्राप्त किया जा सकता है, अनुवाद अनुसंधान के लिए बहुत रुचि के हैं, दर्दनाक मस्तिष्क की चोटों और अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative विकारों के अध्ययन सहित. इस प्रकार, सुधार और एचएससी न्यूरॉन्स के अध्ययन की सुविधा के लिए उपकरण मांग में हैं.
न्यूरॉन्स के अद्वितीय polarized आकारिकी का अध्ययन करने के लिए, कई शोधकर्ताओं बहु-compartmentalized microfluidic उपकरणों का उपयोगकरें 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. इन उपकरणों माप और अद्वितीय subcellular उपयोग के साथ लंबे प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के जोड़तोड़ सक्षम. बहु-compartmentalized microfluidic उपकरणों microgrooves द्वारा अलग दो समानांतर microfluidic डिब्बों से मिलकर बनता है, जो axonal विकास गाइड. न्यूरॉन्स या तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) somatodendritic डिब्बे में चढ़ाया जाता है, और फिर मिनट के बाद डिब्बे की सतह के नीचे का पालन करें. विभेदित न्यूरॉन्स बढ़ने और एक आसन्न और अलग axonal डिब्बे में microgroove क्षेत्र के माध्यम से अपने axons / अतीत में, इन उपकरणों को विशेष रूप से पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) प्रतिकृति मोल्डिंग का उपयोग कर बनाया गया था. PDMS उपकरणों कई कमियां पहले वर्णितहै 12, लगातार hydrophobicity और तुरंत उपयोग करने से पहले एक गिलास coverslip को इकट्ठा करने की जरूरत सहित. पूर्व इकट्ठे इंजेक्शन ढाला चिप्स इन कमियों के कई दूर और व्यावसायिक रूप से बेच रहे हैं (सामग्री की तालिकादेखें )12. इन चिप्स के डिब्बों को स्थायी रूप से हाइड्रोफिलिक बना दिया जाता है और पूरी चिप ऑप्टिकली पारदर्शी चक्रीय ओलिफिन कोपॉलीमर (सीओसी) में ढाला गया इंजेक्शन है।
इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे इस सीओसी चिप का उपयोग करने के लिए उत्तेजक न्यूरॉन्स में मानव NSCs अंतर करने के लिए, और अलग और fluidically उनके लंबे न्यूरॉन अनुमानों को अलग करने के लिए. इस प्रदर्शन के लिए, न्यूरॉन्स NIH से विभेदित थे मंजूरी दे दी H9 स्टेम कोशिकाओं. इसी तरह की प्रक्रियाओं मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
preassembled बहु-कम्पार्टमेंट सीओसी चिप एक आसान करने के लिए उपयोग commentalized मंच अंतर और लंबी अवधि के लिए न्यूरॉन्स में मानव NSCs बनाए रखने के लिए है (gt; 4 सप्ताह). इस प्रोटोकॉल में, हम glutamatergic न्यूरॉन्स में मानव NSCs के भेदभाव का प्रदर्शन, प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रदर्शन, डेन्ड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान कल्पना और एक्सोटोमी प्रदर्शन. इन चिप्स उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं और वहाँ सीओसी12के साथ कोई autofluorence है.
सीओसी बहु-कम्पार्टमेंट चिप्स कार्यात्मक सिलिकॉन आधारित कम्पार्टमेंटल उपकरणों के बराबर हैं, और लाभ और कमियां हैं जैसा कि पहले12वर्णित है। तालिका 1 एचएससी-न्यूरॉन्स को गढ़ने के लिए बहु-कंपार्टमेंट सीओसी चिप्स और सिलिकॉन उपकरणों की तुलना करता है। सीओसी commentalized चिप्स लगाव और एक लंबी संस्कृति अवधि में स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव के लिए एक बेहतर हाइड्रोफिलिक सतह प्रदान करते हैं. पीडीएमएस-आधारित उपकरणों को इकट्ठा करने और कांच के कवरलिप्स से जुड़े होने की आवश्यकता है। PDMS उपकरणों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति स्टेम कोशिकाओं के एकत्रीकरण का कारण बनताहै 5; यह सेलुलर स्तर पर इमेजिंग में दोनों चुनौतियों और मीडिया में परिवर्तन के दौरान सेल समुच्चय के आंदोलन के कारण शारीरिक क्षति के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता की ओर जाता है. प्लास्टिक चिप इन चुनौतियों पर काबू पा लिया. सीओसी PDMS के विपरीत गैस अपारगम्य है, तो हवा जेब फंस या चैनलों के भीतर गठित उपयोगकर्ता द्वारा हटाया जाना चाहिए. पूर्व-कोटिंग समाधान चैनलों में फंस जाने के लिए हवा की संभावना को कम कर देता है। इस विलयन में एथेनोल और अन्य एजेंट होते हैं। इन प्लास्टिक चिप्स के भीतर murine न्यूरॉन्स culturing के लिए एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल चिप्स12के भीतर pipeting कोशिकाओं और मीडिया के बारे में अतिरिक्त विवरण प्रदान करता है . NSCs अधिक नाजुक है कि murine न्यूरॉन्स रहे हैं, तो और अधिक धीरे से संभाला जाना चाहिए. यह भी धीरे उन्हें ऊपर और नीचे pipeting द्वारा चढ़ाना से पहले अच्छी तरह से स्टेम कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
इन विट्रो विभेदित मानव स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग चिकित्सा और अनुसंधान में तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है. इन न्यूरॉन्स अनुसंधान और कई सीएनएस विकारों के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं, neurodegenerative रोगों और दर्दनाक मस्तिष्क चोटों सहित. ये न्यूरॉन्स मानव भ्रूण न्यूरॉन्स के समान15. भविष्य में, उचित आयु वर्ग न्यूरॉन्स स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है उम्र से संबंधित न्यूरॉन समारोह की नकल और इन commentalized उपकरणों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया. इन उपकरणों से एक्सॉन स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाले रोगों में अनुसंधान की सुविधा होगी और ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकारों से पीड़ित रोगियों के न्यूरॉन्स में एक्सॉन की कमी जैसे कार्य 16,17.
The authors have nothing to disclose.
लेखकXona Microfluidics, LLC, राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (R42 MH097377) से समर्थन स्वीकार करते हैं, और न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान (R41 NS108895, P30 NS045892). सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
complete neural stem cell media: | |||
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |