Denne protokollen demonstrerer bruken av compartmentalized mikrovæskebasert chips, injeksjon støpt i en syklisk olefin kopolymer til kultivert neurons differensiert fra menneskelige stamceller. Disse brikkene er forhåndsmonterte og enklere å bruke enn tradisjonelle compartmentalized Poly (dimethylsiloxane) enheter. Flere vanlige eksperimentelle paradigmer er beskrevet her, inkludert viral merking, fluidic isolering, axotomy, og immunostaining.
Bruk av mikrovæskebasert enheter til fordeler kultivert neurons har blitt en standard metode i nevrovitenskap. Denne protokollen viser hvordan du bruker en pre-montert multi-kupé chip gjort i en syklisk olefin kopolymer (COC) til fordeler neurons differensiert fra humane stamceller. Fotavtrykket til disse COC-prosessorene er de samme som et standard objektglass, og er like kompatible med mikroskopi med høy oppløsning. Neurons er differensiert fra menneskelige nevrale stamceller (NSCs) inn glutamatergic neurons innenfor chip og vedlikeholdes i 5 uker, slik at tilstrekkelig tid for disse neurons å utvikle synapser og dendrittiske pigger. Videre viser vi flere vanlige eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av disse multi-kupé chips, inkludert viral merking, etablering microenvironments, axotomy, og immuncytokjemi.
Human stilk cellen differensiert neurons (hSC-neurons) blir stadig mer brukt for biologisk forskning. Disse neurons, som kan utledes fra humant kildemateriale, er av stor interesse for translational forskning, inkludert studiet av traumatiske hjerne skader og nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom. Dermed verktøy for å forbedre og tilrettelegge studiet av hSC-neurons er etterspurt.
For å studere den unike polarisert morfologi av neurons, mange forskere bruker multi-compartmentalized mikrovæskebasert enheter1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Disse enhetene muliggjør målinger og manipulasjoner av lange projeksjons neurons med unik subcellulære tilgang. Multi-compartmentalized mikrovæskebasert enheter består av to parallelle mikrovæskebasert rom adskilt av microgrooves, som veileder axonal vekst. Neurons eller nevrale stamceller (NSCs) er belagt i somatodendritic kupé, og deretter holde seg til bunnen av kupé overflaten etter minutter. Differensiert neurons vokse og utvide sine axons/anslag gjennom Mikrokuttspor regionen til en tilstøtende og isolert axonal kupé. I det siste, disse enhetene ble utelukkende laget ved hjelp av Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) kopi molding. PDMS enheter har mange ulemper tidligere beskrevet12, inkludert vedvarende hydrofobisiteten og behovet for å montere til et glass dekkglass umiddelbart før bruk. Pre-montert sprøytestøpte chips overvinne mange av disse ulempene og selges kommersielt (se tabell av materialer)12. Seksjonene av disse brikkene er permanent gjort hydrofile og hele brikken er injeksjon støpt i optisk transparent syklisk olefin kopolymer (COC).
Denne protokollen demonstrerer hvordan du bruker denne COC chip å skille menneskelige NSCs inn eksitatoriske neurons, og å skille og fluidically isolere sine lange neuronal anslag. For denne demonstrasjonen var neurons differensiert fra NIH-godkjente H9 stamceller. Lignende prosedyrer kan brukes til å differensiere humant indusert Pluripotent stamceller.
Den forhåndsmonterte multi-kupé COC chip er en lett-å-bruke compartmentalized plattform for å differensiere og vedlikeholde menneskelige NSCs i neurons for langsiktig (> 4 uker). I denne protokollen, viser vi differensiering av menneskelige NSCs inn glutamatergic neurons, retrograd Label neurons, utføre immuncytokjemi, visualisere dendrittiske ryggraden morfologi og utføre axotomy. Disse brikkene er kompatible med høyoppløselig bildebehandling og det er ingen autofluorescence med COC12.
COC multi-kupé chips er funksjonelt tilsvarende silikon-baserte compartmentalized enheter, og har fordeler og ulemper som beskrevet tidligere12. Tabell 1 sammenligner multi-kupé COC chips og silikon enheter for dyrking hSC-neurons. COC compartmentalized chips gir en bedre hydrofile overflate for festing og vedlikehold av stamceller over en lang kultur periode. PDMS-baserte enheter må monteres og festes til glass coverslips. Hydrofobe natur PDMS enheter forårsaker aggregering av stamceller5; Dette fører til både utfordringer i Imaging på cellenivå og større mottakelighet for fysisk skade på grunn av bevegelse av celle aggregater under Media endringer. Plast brikken overvinner disse utfordringene. COC er gass ugjennomtrengelig, i motsetning til PDMS, så luftlommer fanget eller dannet i kanalene må fjernes av brukeren. Den pre-belegg løsning reduserer muligheten for luft å bli fanget i kanalene. Denne løsningen består av etanol og andre agenter. En tidligere publisert protokoll for dyrking murine neurons innenfor disse plast chips gir ytterligere detaljer om pipettering celler og Media innenfor chips12. NSCs er mer skjøre at murine neurons, så må håndteres mer forsiktig. Det er også viktig å blande stamcellene grundig før plating ved å forsiktig pipettering dem opp og ned.
Bruk av neurons avledet fra in vitro differensiert menneskelige stamceller blir stadig mer populært i medisin og forskning. Disse neurons er viktig for forskning og kliniske anvendelser for mange CNS lidelser, inkludert nevrodegenerative sykdommer og traumatisk hjerne skader. Disse neurons ligner menneskets fosterets neurons15. I fremtiden, hensiktsmessig alderen neurons kan genereres fra stamceller å etterligne alder-relaterte neuronal funksjon og brukes i forbindelse med disse compartmentalized enheter. Disse enhetene vil lette forskning i sykdommer som berører axon helse og funksjon som axon underskudd i neurons av pasienter diagnostisert med Autism Spectrum lidelser og axonal regenerering etter skade16,17.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner støtte fra Xona materialer, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), og National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
complete neural stem cell media: | |||
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |