Detta protokoll visar användningen av uppdelade mikroflödessystem chips, injektion gjuten i en cyklisk olefin sampolymer till odlade nervceller åtskilda från mänskliga stamceller. Dessa chips är förmonterade och lättare att använda än traditionella uppdelade poly (dimethylsiloxane) enheter. Flera vanliga experimentella paradigm beskrivs här, inklusive viral märkning, fluidic isolering, axotomy, och immunofärgning.
Användning av mikroflödessystem enheter för att kategoriserar odlade nervceller har blivit en standardmetod i neurovetenskap. Detta protokoll visar hur man använder en förmonterad multi-fack chip som gjorts i en cyklisk olefin sampolymer (COC) att kategoriserar nervceller åtskilda från mänskliga stamceller. Fotavtryck av dessa COC-chips är desamma som en vanlig Mikroskop bild och är lika kompatibla med högupplöst mikroskopi. Neuroner skiljer sig från mänskliga neurala stamceller (NSCs) i glutamatergic neuroner inom chip och underhålls i 5 veckor, vilket ger tillräcklig tid för dessa nervceller att utveckla synapser och dendritiska taggar. Vidare visar vi flera vanliga experimentella procedurer med hjälp av dessa multi-fack chips, inklusive viral märkning, upprättande av mikromiljöer, axotomy, och immunocytochemistry.
Mänskliga stamceller differentierade neuroner (hSC-neuroner) används alltmer för biologisk forskning. Dessa nervceller, som kan härledas från mänskligt källmaterial, är av stort intresse för translationell forskning, inklusive studiet av traumatiska hjärnskador och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Sålunda, verktyg för att förbättra och underlätta studiet av hSC-neuroner är efterfrågade.
För att studera den unika polariserade morfologin av nervceller, många forskare använder multi-compartmentalized mikroflödessystem enheter1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Dessa enheter möjliggör mätningar och manipulationer av långa projektion nervceller med unik subcellulär åtkomst. Multi-compartmentalized mikroflödessystem enheter består av två parallella mikroflödessystem fack åtskilda av microgrooves, som styr axonal tillväxt. Neuroner eller neurala stamceller (NSCs) är pläterade i somatodendritic facket, och sedan hålla sig till botten av utrymmet ytan efter minuter. Differentierade nervceller växa och utvidga sina axoner/projektioner genom Microgroove regionen i ett angränsande och isolerade axonal fack. Förr i tiden var dessa anordningar uteslutande görs med hjälp av poly (dimethylsiloxane) (PDMS) replika gjutning. PDMS enheter har många nackdelar som tidigare beskrivits12, inklusive ihållande vattenavvisande egenskaper och behovet av att montera till en glastäckslip omedelbart före användning. Förmonterade formsprutade chips övervinna många av dessa nackdelar och säljs kommersiellt (se tabell över material)12. De delar av dessa chips är permanent tillverkade hydrofila och hela chip är formsprutade i optiskt transparent cyklisk olefin sampolymer (COC).
Detta protokoll visar hur man använder detta COC-chip för att skilja mänskliga NSCs i excitatoriska nervceller, och att separera och fluidiskt isolera sina långa neuronala projektioner. För denna demonstration, neuroner differentierades från NIH-godkända H9 stamceller. Liknande procedurer kan användas för att differentiera humana inducerade pluripotenta stamceller.
Den förmonterade multi-kupé COC chip är en enkel att använda uppdelade plattform för att differentiera och underhålla mänskliga nscs i nervceller för långsiktig (> 4 veckor). I detta protokoll visar vi differentiering av mänskliga NSCs i glutamaterga neuroner, retrograd etikett nervceller, utföra immunocytokemi, visualisera dendritiska ryggraden morfologi och utföra axotomy. Dessa chips är kompatibla med högupplöst avbildning och det finns ingen autofluorescence med COC12.
COC multi-kupé chips är funktionellt likvärdiga med silikon-baserade uppdelade enheter, och har fördelar och nackdelar som beskrivs tidigare12. Tabell 1 jämför multi-fack COC chips och silikon enheter för odling HSC-neuroner. COC uppdelade chips ger en bättre hydrofila yta för fastsättning och underhåll av stamceller under en lång kultur period. PDMS-baserade enheter måste monteras och fästas på glas täckband. Den hydrofoba karaktären av PDMS enheter orsakar aggregering av stamceller5; Detta leder till både utmaningar i Imaging på cellnivå och större känslighet för fysiska skador på grund av förflyttning av cell aggregat under Media förändringar. Plastchip övervinner dessa utmaningar. COC är gas ogenomtränglig, till skillnad från PDMS, så luftfickor fångade eller bildas inom kanalerna måste tas bort av användaren. Pre-Coating lösning minskar möjligheten för luft att fastna i kanalerna. Denna lösning består av etanol och andra agenter. Ett tidigare publicerat protokoll för odling av murina neuroner inom dessa plast chips ger ytterligare information om Pipettera celler och media inom markerna12. NSCs är mer bräckliga att murina nervceller, så måste hanteras mer försiktigt. Det är också viktigt att blanda stamcellerna grundligt före pläteringen genom att försiktigt Pipettera dem upp och ner.
Användning av nervceller som härrör från in vitro-differentierade mänskliga stamceller blir allt populärare inom medicin och forskning. Dessa nervceller är viktiga för forskning och kliniska tillämpningar för många CNS-sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar och traumatiska hjärnskador. Dessa nervceller liknar nära mänskliga foster nervceller15. I framtiden, lämpligt åldrade nervceller kan genereras från stamceller för att efterlikna åldersrelaterade neuronala funktion och används i samband med dessa uppdelade enheter. Dessa enheter kommer att underlätta forskning om sjukdomar som påverkar Axon hälsa och funktion såsom Axon underskott i nervceller av patienter som diagnostiserats med autismspektrumstörningar och axonal förnyelse efter skada16,17.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner stöd från Xona microfluidics, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), och det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
complete neural stem cell media: | |||
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |