Denne protokol demonstrerer brugen af opdelte mikrofluidiske chips, injektion støbt i en cyklisk olefin copolymer til dyrkede neuroner differentieret fra humane stamceller. Disse chips er færdigmonterede og lettere at bruge end traditionelle opdelte poly (dimethylsiloxan) enheder. Flere almindeligt eksperimentelle paradigmer er beskrevet her, herunder viral mærkning, Fluidic isolation, axotomi, og immun farvning.
Brug af mikrofluidisk-enheder til at opdele kulturperler er blevet en standardmetode i neurovidenskab. Denne protokol viser, hvordan man bruger en pre-monteret multi-rum chip lavet i en cyklisk olefin copolymer (COC) til at opdele neuroner differentieret fra humane stamceller. Fodaftryk af disse COC chips er de samme som en standard mikroskop slide og er lige kompatible med høj opløsning mikroskopi. Neuroner er differentieret fra humane neurale stamceller (NSCs) i glutamaterge neuroner i chippen og vedligeholdes i 5 uger, hvilket giver tilstrækkelig tid til disse neuroner til at udvikle synapser og dendritiske spines. Yderligere, vi demonstrere flere fælles eksperimentelle procedurer ved hjælp af disse multi-rum chips, herunder viral mærkning, etablering af mikromiljøer, axotomi, og immunocytochemistry.
Humane stamceller differentierede neuroner (hSC-neuroner) anvendes i stigende grad til biologisk forskning. Disse neuroner, som kan være afledt af menneskelige kildemateriale, er af stor interesse for Translationel forskning, herunder studiet af traumatiske hjerneskader og neurodegenerative lidelser såsom Alzheimers sygdom. Der er således behov for værktøjer til at forbedre og lette studiet af hSC-neuroner.
For at studere den unikke polariserede morfologi af neuroner, mange forskere bruger multi-opdelte mikrofluidisk enheder1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Disse enheder muliggør målinger og manipulationer af lang projektion neuroner med unik subcellulære adgang. Multi-opdelte mikrofluidisk enheder består af to parallelle mikrofluidisk rum adskilt af microgrooves, som fører axonal vækst. Neuroner eller neurale stamceller (NSCs) er belagt i det somatodendritiske rum, og derefter holde sig til bunden af rummets overflade efter minutter. Differentierede neuroner vokser og udvider deres axoner/projektioner gennem mikrogroove-regionen til et tilstødende og isoleret axonal rum. I fortiden, disse anordninger blev udelukkende lavet ved hjælp af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) replika Molding. PDMS-enheder har mange ulemper, der tidligere er beskrevet12, herunder vedvarende hydrofobicitet og behovet for at samle til en glas dækseddel umiddelbart før brug. Færdigmonterede sprøjtestøbte chips overvinde mange af disse ulemper og sælges kommercielt (Se tabel over materialer)12. Rummene af disse chips er permanent fremstillet hydrofile og hele chippen er indsprøjtning støbt i optisk transparent cyklisk olefin copolymer (COC).
Denne protokol demonstrerer, hvordan man bruger denne COC chip til at differentiere humane NSCs i excitatoriske neuroner, og til at adskille og fluidically isolere deres lange neuronal projektioner. Til denne demonstration blev neuroner differentieret fra NIH-godkendte H9 stamceller. Lignende procedurer kan anvendes til at differentiere menneskeskabte pluripotente stamceller.
Den præmonterede multi-rum COC chip er en nem at bruge opdelte platform til at differentiere og vedligeholde menneskelige NSCs i neuroner for langsigtede (> 4 uger). I denne protokol demonstrerer vi differentieringen af humane nscs i glutamaterge neuroner, tilbage label neuroner, udføre immunocytochemistry, visualisere dendritiske rygsøjle morfologi og udføre axotomi. Disse chips er kompatible med høj opløsning Imaging og der er ingen autofluorescens med COC12.
COC multi-rum chips er funktionelt ækvivalent til silikone-baserede opdelte enheder, og har fordele og ulemper som beskrevet tidligere12. Tabel 1 sammenligner multi-rum COC chips og silikone udstyr til dyrkning hSC-neuroner. COC-opdelte chips giver en bedre hydrofile overflade til fastgørelse og vedligeholdelse af stamceller over en lang kultur periode. PDMS-baserede enheder skal samles og fastgøres til glas dæksedler. Den hydrofobe karakter af PDMS-anordninger forårsager sammenlægning af stamceller5; Dette fører til begge udfordringer i Imaging på cellulært niveau og større modtagelighed for fysisk skade på grund af bevægelsen af celle aggregater under medieændringer. Plastik chippen overvinder disse udfordringer. COC er gas uigennemtrængelig, i modsætning til PDMS, så luftlommer fanget eller dannet i kanalerne skal fjernes af brugeren. Forbelægnings opløsningen mindsker muligheden for, at luften bliver fanget i kanalerne. Denne løsning består af ethanol og andre stoffer. En tidligere offentliggjort protokol til dyrkning af murine neuroner inden for disse plastik chips giver yderligere detaljer om pipette Rings celler og medier i chips12. NSCs er mere skrøbelige, at murine neuroner, så skal håndteres mere forsigtigt. Det er også vigtigt at blande stamcellerne grundigt før plating ved forsigtigt at pipettere dem op og ned.
Brug af neuroner afledt af in vitro-differentierede humane stamceller bliver mere og mere populære inden for medicin og forskning. Disse neuroner er vigtige for forskning og kliniske anvendelser for mange CNS lidelser, herunder neurodegenerative sygdomme og traumatiske hjerneskader. Disse neuroner ligner nøje humane føtal neuroner15. I fremtiden, passende alderen neuroner kunne genereres fra stamceller til efterligne aldersrelaterede neuronal funktion og anvendes i forbindelse med disse opdelte enheder. Disse anordninger vil lette forskning i sygdomme, der påvirker Axon sundhed og funktion såsom Axon underskud i neuroner af patienter diagnosticeret med autisme spektrum lidelser og axonal regenerering efter skade16,17.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender støtte fra Xona Microfluidics, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), og National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde (R41 NS108895, P30 NS045892). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
complete neural stem cell media: | |||
REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |