Summary
يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لشل الحركة الخالية من الملصقات من الحويصلات الخارجية والحويصلات خارج الخلية من العينات السائلة وتصويرها عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). وتستخدم الصور AFM لتقدير حجم الحويصلات في الحل وتميز الخصائص البيوفيزيائية الأخرى.
Abstract
إكسوسومات وغيرها من الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المجمعات الجزيئية تتكون من حويصلة غشاء الدهون، والديكور السطحي من قبل بروتينات الغشاء والجزيئات الأخرى، والمحتوى الإنارة المتنوعة الموروثة من الخلية الأم، والتي تشمل RNAs، البروتينات، وDNAs. وقد أصبح توصيف الأحجام الهيدرودينامية للمركبات الكهربائية، الذي يعتمد على حجم الحويصلة وطبقته الإكليلية التي تشكلها الزخارف السطحية، أمرا روتينيا. بالنسبة للاكسوسوسوم، أصغر المركبات الكهربائية، الفرق النسبي بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلات كبير. ولا يزال توصيف أحجام الحويصلات بواسطة التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (cryo-TEM)، وهو تقنية قياسية ذهبية، يشكل تحدياً بسبب تكلفة الأداة، والخبرة المطلوبة لإجراء إعداد العينة، والتصوير، و تحليل البيانات، وعدد قليل من الجسيمات التي غالبا ما لوحظت في الصور. وثمة بديل متاح على نطاق واسع ويمكن الوصول إليه هو الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)، الذي يمكن أن ينتج بيانات متعددة الاستخدامات عن الهندسة ثلاثية الأبعاد، والحجم، وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية للحويصلات خارج الخلية. ويرشد البروتوكول المطور المستخدمين في استخدام هذه الأداة التحليلية ويحدد سير العمل لتحليل المركبات الكهربائية من قبل AFM، والذي يتضمن إعداد عينة لتصوير المركبات الكهربائية في شكل رطب أو المجففة، والجمود الكهروستاتيكي لل الحويصلات على الركيزة، والحصول على البيانات، وتحليلها، والتفسير. وتبين النتائج التمثيلية أن تثبيت المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل يمكن التنبؤ به، ويمكن تخصيصه، ويسمح للمستخدم بالحصول على نتائج تغيير الحجم لعدد كبير من الحويصلات. وقد تبين أن تغيير حجم الحويصلة استنادا إلى بيانات AFM يتسق مع التصوير بالتبريد- TEM.
Introduction
توجد الحويصلات خارج الخلية (EVs) في جميع سوائل الجسم، بما في ذلك الدم والبول واللعاب والحليب والسائل السلوي. تشكل Exosomes فئة منطقة من المركبات الكهربائية المتمايزة عن المركبات الكهربائية الأخرى عن طريق التكوين الحيوي الأنبي، وعلامات المسار الأنبي، وأصغر حجم بين جميع المركبات الكهربائية. وكثيرا ً ما يتم الإبلاغ عن حجم الاكسوسوسوم مع تباين كبير بين الدراسات. تم العثور على نتائج التحجيم لتكون تعتمد على طريقة، مما يعكس الفرق في المبادئ المادية المستخدمة من قبل تقنيات تحليلية مختلفة لتقدير أحجام EV1،2. على سبيل المثال، يقدر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) - وهو تقنية توصيف الحجم الأكثر استخداماً - حجم المركبات الكهربائية كأقطار هاديدينامية، والتي تميز مقاومة حركة البراونيان للمركبات الكهربائية في الحل. قطر هيدرودينامي أكبر من الحويصلة ينطوي على انخفاض حركتها في السائل. الطبقة الإكليلية حول الحويصلات، تتكون من البروتينات السطحية والجزيئات الأخرى الراسية أو الممتزة على سطح الغشاء، تعيق إلى حد كبير التنقل وتزيد من الحجم الهيدرودينامي للمركبات الكهربائية. ومن الناحية النسبية، فإن هذه الزيادة كبيرة بشكل خاص بالنسبة للإكسوسوم3، كما هو موضح في الشكل 1.
التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (CRYO-TEM) هو تقنية نهائية في تحديد أحجام الحويصلات ومورفولوجيا في حالاتها المرطبة. ومع ذلك، فإن التكلفة العالية للأجهزة والخبرة المتخصصة اللازمة لاستخدامها بشكل صحيح تحفيز استكشاف التقنيات البديلة التي يمكن أن تصور المركبات الكهربائية رطب. وهناك عدد صغير نسبيا من المركبات الكهربائية التي لوحظت أو تتميز في الصور المكتسبة بالتبريد TEM هو عيب ملحوظ آخر من هذه التقنية.
تصور مجهرية القوة الذرية (AFM) الطوبوغرافيا ثلاثية الأبعاد للمركبات الكهربائية المرطبة أو المجففة4و5و6عن طريق مسح مسبار عبر الركيزة لتنقيط صورة الجسيمات على السطح. وترد في هذه الدراسة الخطوات الأساسية للبروتوكول الذي يميز المركبات الكهربائية من جانب AFM. قبل تصوير الحويصلات في السائل، يجب أن تكون معطلة على الركيزة إما عن طريق الربط إلى سطح وظيفي، ومحاصرة في مرشح، أو عن طريق الجذب الكهروستاتيكي7. التثبيت الكهروستاتيكي على الركيزة المشحونة بشكل إيجابي هو خيار مناسب بشكل خاص لشل من exosomes المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية. ومع ذلك، فإن نفس القوى الكهروستاتيكية التي تعطل الحويصلات خارج الخلية على السطح تشوه أيضا شكلها، مما يجعل تحليل البيانات بعد التصوير ضروريًا. نقوم بتفصيل هذه النقطة من خلال وصف الخوارزمية التي تقدر حجم الحويصلات الكروية في الحل استناداً إلى بيانات AFM على الشكل المشوه للاكسوسوم اتّبأ على السطح.
في البروتوكول المطور، يتم عرض إجراء تجميد الحويصلات الكهروستاتيكي القوي، وتليه الخطوات اللازمة لإجراء تصوير القوة الذرية في الدول المرطبة أو المجففة. يتم تحديد العوامل التي تؤثر على التركيز السطحي للحويصلات المعطلة. وتُعطى الإرشادات بشأن كيفية إجراء عملية التعطيل الكهروستاتيكي للعينات ذات التركيزات المختلفة للمركبات الكهربائية في الحل. ويناقش اختيار الظروف التجريبية التي تسمح بتقدير توزيعات الاحتمالات التجريبية لمختلف الخصائص البيوفيزيائية استنادا إلى عدد كبير بما فيه الكفاية من الحويصلات المعطلة. وترد أمثلة على تحليل ما بعد التصوير لبيانات AFM. وعلى وجه التحديد، يتم وصف خوارزمية لتحديد حجم الحويصلات في الحل استناداً إلى توصيف AFM للمركبات الكهربائية المعطلة. وتظهر النتائج التمثيلية اتساق التحجيم الحويصلة من قبل AFM مع نتائج التصوير بالتبريد TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عزل المركبات الكهربائية من السوائل الحيوية
- عزل المركبات الكهربائية بإحدى الطرق المعمول بها، مثل التفاضل الفائقجداً 8، هطول الأمطار، أو الكروماتوغرافيا ذات الاستبعاد الكبير9.
- تأكيد وجود العلامات الحيوية السطحية والقطنية المتوقعة وعدم وجود علامات بيولوجية تشير إلى التلوث المتبادل للإعداد. تأكيد مورفولوجيا ثنائية الطبقات من الجسيمات المعزولة عن طريق المجهر الإلكتروني.
ملاحظة: عند عزل الاكسوسوم، يجب أن يكون توزيع الحجم الهيدرودينامي الذي يقاس بتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أو تشتت الضوء الديناميكي في النطاق المتوقع. تفاصيل EV والعزلة الخارجية خارج نطاق هذا البروتوكول. تعتمد الطريقة المختارة على الأسئلة التجريبية والهدف من الدراسة10. توفر الخطوات التالية توضيحًا ملموسًا لإجراء إثراء الاكسوسوسوم عن طريق هطول الأمطار من وسط نمو خلايا سرطان الثدي MCF-7 باستخدام مجموعة هطول الأمطار المتاحة تجارياً(جدول المواد). - قبل توسيع زراعة الخلايا، تخزين خلايا سرطان الثدي MCF-7 في النيتروجين السائل. إذابة الخلايا إلى الثقافة الفرعية.
- بعد ممارسات العقيم، وأداء طلاء الخلايا على لوحات 150 ملم. استخدام متوسط النمو يتكون منالحدالأدنى من المتوسط الأساسية النسر، 0.01 ملغ / مل الأنسولين المؤتلف الإنسان، و 10٪ خارج اكسسوم المصل البقري الجنين.
- تُنير الثقافة بنسبة 95% من الهواء و5% من ثاني أكسيد الكربون2 وحضانة في 37 درجة مئوية.
- بعد تسوية الخلايا (حوالي 24 ساعة بعد الطلاء)، تغيير وسائل الإعلام. تقسيم لوحة في نسبة 1:10 والثقافة عشر لوحات، كل منها تحتوي على 20 مل من وسائل الإعلام.
- حصاد وجمع وسائل الإعلام من 9 من هذه اللوحات (180 مل) في ~ 70-80٪ التقاء عندما الخلايا لا تزال في مرحلة النمو.
- تقسيم وسائل الإعلام إلى 60 مل و 120 مل، وتنقسم إلى مزيد من 30 مل / أنبوب، والطرد المركزي في 3000 × ز لمدة 15 دقيقة.
- نقل supernatant من كل أنبوب إلى أنبوب معقمة جديدة 50 مل وأداء العزلة الخارجية.
- عزل exosomes عن طريق هطول الأمطار وفقا للبروتوكولات المنشورة (انظر، على سبيل المثال، المرجع11) أو اتبع تعليماتالشركةالمصنعة في حالة استخدام مجموعة العزل التجاري(جدول المواد). وكخطوة أولى في الحالة الأخيرة، تبلغ تكلفة خلايا الطرد المركزي المتوسطة 000 3 x غرام لمدة 15 دقيقة.
- إضافة حل هطول الأمطار (1:5 نسبة الحجم) إلى supernatant، مزيج، وتبريد بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي في 1500 × ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من الـ supernatant بعد الطرد المركزي.
- تدور بيليه exosome المتبقية لمدة 5 دقائق أخرى في 1500 × ز. دون إزعاج بيليه، وإزالة الحل هطول الأمطار المتبقية عن طريق الطموح.
- إعادة تعليق بيليه في 100-500 درجة مئوية من 1X الفوسفات المخزنة العازلة المالحة (PBS) العازلة وتقسيمها إلى aliquots متعددة حسب الحاجة لتحليل المصب.
- المضي قدما على الفور إلى تجميد سطح exosomes معزولة لتصوير AFM. إذا لزم الأمر، تجميد aliquots في -80 درجة مئويةللاستخدام في وقت لاحق مع اتخاذ الاحتياطات لتجنب الأضرار التي لحقت العينة خلال دورة تجميد ذوبان.
2. تثبيت السطح من الحويصلات خارج الخلية
- استخدام شريط قوي على الوجهين، الايبوكسي، أو لاصقبديل لإرفاق بحزم قرص الميكا إلى AFM / المسح الضوئي نفق المجهر (STM) المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ عينة القرص.
- شق قرص الميكا باستخدام شفرة حلاقة حادة أو سكين فائدة، أو عن طريق إرفاق شريط لاصق على السطح العلوي ومن ثم pealing تشغيله لإزالة طبقة من المواد.
ملاحظة: يجب أن تكشف أي طريقة سطح عذراء عن طريق إزالة طبقة رقيقة من الميكا التي تعرضت سابقا للبيئة. بعد الإجراء، يجب أن يبقى مرفق الميكا إلى قرص عينة معدنية AFM/STM ثابتًا. - في درجة حرارة الغرفة، علاج السطح العلوي من الميكا لمدة 10 ثانية مع 100 درجة مئوية من 10 مل من 10 مل NiCl2 الحل، الذي يعدل شحنة السطح من السلبية إلى الإيجابية.
- محلول من اللطخة NiCl2 مع ورق مسح أو نشاف خالي من الوبر. اغسل سطح الميكا 3x بالماء منزوع الأيونات (DI) وجففه بتيار من النيتروجين الجاف.
ملاحظة: من الممارسات الجيدة مسح السطح المعدل مع AFM للتأكد من خلوه من الملوثات. - ضع قرص عينة AFM مع الميكا المرفقة المعدلة على السطح في طبق بيتري.
- تخفيف العينة الخارجية من الخطوة 1.14 مع PBS 1X للحصول على تركيز بين 4.0 × 109 و 4.0 ×10 10 الجسيمات لكل مل من الحل. التحقق من تركيز الجسيمات المخففة باستخدام NTA.
- تشكيل قطرة sessile على سطح الميكا عن طريق إفراغ 100 درجة مئوية من محلول خارجي مخفف من ماصة.
- ضع الغطاء على طبق بيتري وختمه مع فيلم البارافين للحد من التبخر عينة. احتضان العينة لمدة 12-18 ساعة في 4 درجةمئوية.
ملاحظة: سوف تزيد الكثافة السطحية للاكسوسومات المعطلة مع وقت الحضانة وتركيز المركبات الكهربائية في السائل. قد يكون من الضروري وقت حضانة أطول إذا كانت exosomes موجودة في العينة بتركيزات أقل. - بعد الحضانة، يستنشق 80-90٪ من العينة دون إزعاج السطح. عند هذه النقطة، سيتم تعطيل exosomes كهربائيا على الركيزة الميكا.
- قبل تصوير المركبات الكهربائية المرطبة، اشطف السطح بـ 1x PBS. كرر 3x. الحرص على الحفاظ على عينة رطبة طوال عملية الرين.
- بعد غسل سطح الميكا مع 1X PBS، وإزالة 80٪-90٪ من السائل، وماصة ~ 40 درجة مئوية من PBS 1X الطازجة لتغطية العينة.
- عند تصوير المركبات الكهربائية المجففة، اشطف الركيزة بالماء DI. كرر 3x.
ملاحظة: الرينينغ مع المياه DI منع تشكيل بلورات الملح وترسب من solutes على السطح كما يجف الركيزة. - قبل تصوير المركبات الكهربائية المجففة، يستنشق أكبر قدر ممكن من السائل دون لمس السطح وتجفيف الباقي مع تيار من النيتروجين الجاف.
3. AFM التصوير
- لتصوير المركبات الكهربائية المجففة، حدد cantilever مصممة للمسح الضوئي في الهواء في أوضاع التصوير التنصت وعدم الاتصال وتركيبها على حامل المسبار.
ملاحظة: يمكن استخدام خصائص الكانتيلفيت المثال المدرجة في جدول المواد (طول 123 ميكرومتر، وعرض 40 ميكرومتر، و7 نانومتر دائرة نصف قطرها طرف، و37 نيوتن/م ثابت الربيع) كدليل عند اختيار مسبار متوافق مع أجهزة AFM المتاحة.- ضع الإعداد من الخطوة 2.13 على مرحلة AFM. سوف المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ عينة القرص تعطيل العينة على خشبة المسرح. السماح بالوقت لإعداد والمرحلة لتحقيق التوازن حراريا.
- استخدم وضع النقر لمسح مساحة كبيرة بما فيه الكفايةمن سطح الميكا. على سبيل المثال، اختر مساحة 5 × 5 ميكرومتر، نقطية في 512 سطرًا بمعدل مسح يبلغ ~1 هرتز.
ملاحظة: سوف يزيد وقت الفحص مع منطقة الصورة وعدد الأسطر المحددة لتشكيل الصورة ولكن إنقاص مع معدل المسح الضوئي المحدد كعدد الأسطر الممسوحة ضوئيًا في الثانية. قد تؤثر معدلات المسح السريع على جودة الصورة. ولذلك، فإن سرعة التنقيط ينبغي أن توازن قضائيا المفاضلة بين وقت الاقتناء وجودة الصورة.
- لتصوير الحويصلات المرطبة، حدد cantilever مناسبة لمسح عينات ناعمة ورطبة وجبل الكانتيلفير على حامل مسبار مصمم للمسح الضوئي في السوائل.
ملاحظة: عند اختيار مسبار متوافق مع أجهزة AFM المتاحة، مواصفات التحقيق المدرجة في جدول المواد (الكانتيلفير الثلاثي مع 175 ميكرومتر طول اسمي، 22 ميكرومتر العرض، 20 نانومتر دائرة نصف قطرها طرف، 0.07 N / M ثابت الربيع، و يمكن استخدام الأمثل للتصوير مع تردد محرك الأقراص في النطاق بين 4 إلى 8 كيلوهرتز) كدليل.- الرطب غيض من cantilever مع 1X PBS للحد من احتمال إدخال فقاعات الهواء في السائل أثناء المسح الضوئي.
- ضع الإعداد من الخطوة 2.11 على مرحلة AFM. سوف المغناطيسي الفولاذ المقاوم للصدأ قرص عينة تعطيل الميكا المرفقة التي تحتوي على المركبات الكهربائية المعطلة على سطحه.
- السماح بالوقت لإعداد ومرحلة AFM لمعادلة حراريا.
- صورة سطح الميكا رطب في وضع التنصت. الحصول على كل من ارتفاع ومرحلة الصور.
ملاحظة: تتأثر جودة التصوير بالأجهزة ومعلمات الفحص المحددة والمسح الضوئي. عند تحسين ظروف المسح الضوئي، يمكن استخدام الخيارات التالية كنقطة بداية: 5 × 5 ميكرومتر منطقة ممسوحة ضوئيًا في 512 سطرًا بمعدل المسح الضوئي وتردد محرك الأقراص بسرعة 0.8-1.0 هرتز تقريبًا.
4. تحليل الصور
ملاحظة: يتم تطبيق خطوات معالجة البيانات وتحليلها التالية على صور الارتفاع المكتسبة. ويمكن تكييف إجراء مماثل لتحليل بيانات المرحلة. هذا الوصف أدناه محدد لGwyddion12،وهو برنامج حر ومفتوح المصدر متاح بموجب رخصة غنو العامة. وتتوفر قدرات مماثلة في أدوات البرمجيات البديلة.
- انتقل إلى عملية البيانات، أوضاع SPM، تلميح واختر تلميح النموذج (الشكل 2). حدد الهندسة وأبعاد الطرف المستخدم لمسح العينة وانقر فوق موافق.
- تصحيح القطع الأثرية تآكل طرف عن طريق إجراء إعادة بناء السطح. افتح الصورة. من القائمة، حدد عملية البيانات، أوضاع SPM، تلميح،ثم اختر إعادة إنشاء Surface وانقر فوق موافق (الشكل 3).
- محاذاة مستوى التصوير لمطابقة مستوى XY المختبر عن طريق إزالة الميل في الركيزة من بيانات المسح الضوئي. لإنجاز هذه المهمة، حدد عملية البيانات والمستوى واختر مستوى المستوى (الشكل 4).
- محاذاة صفوف الصورة عن طريق تحديد عملية البياناتوتصحيح البيانات ثم اختر محاذاة الصفوف. تتوفر العديد من خيارات المحاذاة(الشكل 5). على سبيل المثال، الوسيط هو خوارزمية تعثر على متوسط ارتفاع كل سطر مسح وتطرحه من البيانات.
- انتقل إلى عملية البيانات، وتصحيح البيانات واختر إزالة الندوب (الشكل 6) ، الذي يزيل أخطاء المسح الضوئي الشائعة المعروفة باسم الندوب.
- محاذاة سطح الميكا عند ارتفاع الصفر، Z = 0، عن طريق تحديد قاعدة مسطحة في القائمة المنسدلة المستوى التي يمكن الوصول إليها من عملية البيانات (الشكل 7).
- تحديد المركبات الكهربائية على السطح الممسوح ضوئيًا باستخدام علامة حسب العتبة في القائمة المنسدلة الحبوب (الشكل 8A). وتحدد هذه الخوارزمية الاكسوسومات المعطلة على السطح على أنها جسيمات جاحظة من الركيزة ذات السطح الصفري عند الارتفاع فوق العتبة التي يختارها المستخدم. حدد عتبة في النطاق بين 1 و 3 نانومتر، والتي سوف تقضي على معظم تداخل الخلفية. وتستخدم عتبات أصغر مع خلفية أنظف.
ملاحظة: العتبة في الشكل 8A هي 1.767 نانومتر. وترد في الشكل 8 باءنتائج تحديد الرقم الخارجي للـ MCF-7 مع هذا الحد الأدنى. Gwyddion يقدم العديد من البدائل للعتبة كخوارزمية لتحديد تلقائيا الحويصلات في الصورة، بما في ذلك العتبات الآلية (طريقة أوتسو)، والكشف عن الحافة، وخوارزمية مستجمعات المياه.
ملاحظة: قد تكون تجمعات الجسيمات، إذا كانت موجودة في صورة AFM، مقنعة ومستبعدة من التحليل. - إجراء توصيف هندسي وأبعاد للمركبات الكهربائية المحددة باستخدام خوارزميات التوزيعات المتوفرة التي يمكن الوصول إليها من قائمة الحبوب.
ملاحظة: Gwyddion يوفر أدوات لتقييم توزيع الخصائص ذات القيمة العددية، والواقعية، الحجمية، وغيرها من الخصائص من المركبات الكهربائية المعطلة في حالة رطبة أو dessicated. يظهر مثال لخاصية القيم العددية في الشكل 9، الذي يعطي توزيع الارتفاعات القصوى ضمن بصمة كل خارجي محدد. - تصدير بيانات AFM من Gwyddion لتحليل متخصص بواسطة أدوات حسابية أخرى وبرامج كمبيوتر مخصصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تثبيت سطح المركبات الكهربائية هو خطوة حاسمة في تسلسل التصوير. سوف يحدث تجميد السطح الكهروستاتيكي من exosomes، المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية، بقوة بعد تعديل الركيزة الميكا أن يكون لها شحنة سطح إيجابية. دون العلاج مع NiCl2 لنقل التغيرات السطحية الإيجابية، تم العثور على تجميد المركبات الكهربائية على الركيزة لتكون غير فعالة. صورة الارتفاع في الشكل 10A، التي تم الحصول عليها في الهواء بعد عينة MCF-7 exosome تحتوي على 2.59 × 1010 الحويصلات لكل مل من PBS تم احتضانها لمدة 12 ساعة على سطح غير معدل من الميكا مخطوف حديثا، ويظهر عدد قليل جدا من الحويصلات المتبقية على السطح بعد تنظيفها بالماء DI. الحويصلات المرئية في الشكل 10A هي، على الأرجح، نتيجة لطموح غير كامل من المياه DI، التي علقت الحويصلات غير ثابتة على السطح ومن ثم خلعها على الركيزة لأنها تبخرت.
بعد تعديل الشحنة السطحية مع كلوريد النيكل، من المستحسن التأكد من أن السطح لا يزال خاليا من الملوثات بعد المعالجة. صورة الارتفاع في الشكل 10B (التي تم الحصول عليها في الهواء) يعطي مثالا على سطح نظيف بعد أن تم التعامل مع NiCl2 ثم غسلها ثلاث مرات مع المياه DI. وكان خشونة سطح الموجبة المستمدة أقل من 0.3 نانومتر، وهو ما يتسق مع التقرير السابق13.
ويتضح الأثر الإيجابي الهائل لتعديل الشحنة السطحية على كفاءة تثبيت الاكسوسومات MCF-7 من خلال الشكل 10C,D. وتظهر هاتان اللوحتان مسح الارتفاع الذي تم الحصول عليه في الهواء بعد العينة، التي تم تصويرها سابقاً في الشكل 10A،وتم احتضانها لمدة 24 ساعة و12 ساعة، على التوالي، على السطح المعالجة بكلوريد النيكل.
الوقت الذي يتم فيه احتضان عينة معينة على السطح المعالج يحدد تركيز السطح (الحويصلات لكل منطقة) من المركبات الكهربائية المعطلة. توضح صورة الارتفاع في الشكل 10C حالة التغطية السطحية الكثيفة بشكل مفرط بواسطة الحويصلات التي تم الحصول عليها بعد أن تم احتضان عينة MCF-7 الخارجية الموصوفة لمدة 24 ساعة. يعتمد عدد من الخوارزميات على وجود ما يكفي من الركيزة غير المشغولة بين الحبوب لإجراء تصحيح الصورة وتحليل البيانات. على سبيل المثال، التسوية وتحويل الركيزة إلى مستوى الصفر، وتصحيح الخط، وتقدير حجم الحبوب تحتاج إلى سطح مستو التدخل لإجراء حسابات دقيقة. عندما يكون تركيز الحويصلات المعطلة عالية كما هو الحال في الشكل 10C، فإن هذه الخوارزميات لا تعمل بشكل موثوق به. ويرد مثال على تركيز سطحي كاف من الحويصلات المعطلة من نفس عينة MCF-7 في صورة الارتفاع في الشكل 10D، والتي تم الحصول عليها بعد أقصر (12 ساعة) الحضانة.
وثمة حاجة إلى معالجة بيانات AFM الخام المكتسبة لتصحيح أخطاء المسح الضوئي الشائعة. الوصف التالي خاص بـ Gwyddion. تتوفر وظائف مماثلة في أدوات تحليل بيانات AFM/SPM الأخرى.
داخل Gwyddion، يتم استخدام وظيفة مستوى الطائرة لتصحيح لإمالة في الركيزة. يتم إجراء تصحيح الخلفية هذا عن طريق العثور أولاً على مستوى الركيزة باستخدام كافة نقاط البيانات في الصورة ثم طرحها من البيانات الأولية. يتم إجراء التصحيح على طول خطوط المسح الضوئي بواسطة دالة محاذاة الصفوف. على سبيل المثال، تقوم إحدى الخوارزميات المنفذة بإجراء المحاذاة عن طريق حساب الارتفاع المتوسط لكل سطر مسح ثم طرح النتيجة من الصف المقابل لبيانات الصورة. يمكن إزالة مساهمة الأخطاء المحلية في حلقة التغذية المرتدة عن طريق تطبيق وظيفة إزالة الندوب، والتي تملأ الثغرات في البيانات المحاذية وتزيل الندوب عن طريق مقارنة البيانات في خطوط المسح الضوئي المجاورة. يمكن تحقيق التحول من الركيزة إلى الارتفاع Z = 0 عن طريق مزيج من الوجه والتسوية متعددة الحدود من السطح بعد إخفاء الحبوب وغيرها من الميزات. تقوم أداة قاعدة التسوية الخاصة بـ Gwyddion بتنفيذ هذه المهمة بشكل مستقل أو باستخدام قناع محدد من قبل المستخدم. بعد تصحيحات الخلفية والخطوط الموصوفة، يمكن تحديد الحويصلات المثبتة كهربائياً على الركيزة عن طريق تنفيذ وظيفة مارك غرينز.
ويبين الشكل 11ألف والشكل 11باء ارتفاع ومرحلة الصور من exosomes MCF-7 المرطبة المعطلة على سطح الميكا والمكتسبة في PBS باستخدام وضع التنصت. تم تحديد ما مجموعه 561 حويصلات رطبة في المنطقة الممسوحة ضوئيًا باستخدام خوارزمية عتبة وظيفة مارك غرينز مع تعيين قيمة العتبة إلى ~20%. ويكون تأخر المرحلة في استجابة المسبار على تردد محرك الأقراص حساساً لتغيرات التصلب الموضعية في العينات اللينة. الاتساق بين الارتفاع والمرحلة الصور، ينظر في الشكل 11A،B، هو ، لذلك ، تأكيد مهم على أن الحبوب المصورة هي ، في الواقع ، الحويصلات الناعمة المعطلة على الركيزة.
ويبين الشكل 11C المقطع العرضي لصورة الارتفاع من خلال الاكسوسوم الموجودة على الخط الأبيض في الشكل 11A. في حين أن exosomes في biofluid لديها هندسة كروية1،14،15،16، يتم تشويه شكلها على الركيزة بشدة من قبل الجذب الكهروستاتيكي إلى مشحونة بشكل إيجابي السطح. ويتضح كذلك في الشكل 11D من خلال صورة الارتفاع عن قرب (والمقطع العرضي الخاص بها) من الحويصلات الخارجية المعبأة في الشكل 11A. تظهر صورة المرحلة المقابلة في الشكل 11E. تظهر وظيفة كثافة الاحتمال التجريبية (pdf) لارتفاعات الذروة فوق السطح لجميع الحويصلات المرطبة 561 المحددة في مسح AFM في الشكل 12A. القيمة المتوسطة لهذا التوزيع هو 7.9 نانومتر، وهو ما يعادل تقريبا ضعف سمك ثنائي ة فوسفوليبيد17 في غياب قوات تشويه.
تم تقريب المنطقة على الركيزة التي يشغلها exosome معطلة كدائرة مع قطر يساوي متوسط المسافة من "مركز الكتلة" الحويصلة إلى حدودها على سطح الميكا. ويرد توزيع أقطار الإسقاط هذه في الشكل 12ألف ويساوي المتوسط 69.6 نانومتر. كما أن الارتفاع الذي تم الحصول عليه وتوزيعات القطر تحدد الأثر الكبير لشدة سطح الكهروستاتيكي على الشكل المشوه للاكسوسومات المعطلة.
وقد تأكدت قوة إجراءات البروتوكول وتكرارها عن طريق إعادة تحليل نفس عينة MCF-7 ثلاث مرات، من إعداد العينة إلى التصوير، مع كل تكرار ينتج نتائج مماثلة إحصائيالتلكات المبينة في الشكل 12.
ويمكن تعويض أو تفسير تشوه الحويصلات المعطلة الناجمة عن القوى الكهروستاتيكية لتوفير نظرة ثاقبة على خصائص المركبات الكهربائية المصوّجة. على سبيل المثال، يمكن استخدام بيانات AFM لتقدير الحجم الكروي للحويصلات في الحل. كنقطة انطلاق، يمكننا حساب حجم مغلفة من قبل مغلفات غشاء من الحويصلات المعطلة. تم العثور على حجم من خلال دمج الفرق بين مستوى سطح الحويصلات المحددة وارتفاع الركيزة تحتها. مستوى الركيزة تحت الحويصلات لا يمكن الوصول إليها مباشرة ولكن يمكن تقديرها من قبل Laplace أو الاستيفاء البديل لنقاط البيانات للركائز غير المشغولة المحيطة الحويصلات. داخل Gwyddion، يتم إجراء حساب حجم هذا باستخدام توزيع مختلف خصائص الحبوب وظيفة. ويمكن بعد ذلك تعيين النتيجة المصدرة من غويديون إلى أقطار المجالات المكافئة للحجم.
أدى تطبيق الخوارزمية الموصوفة على بيانات AFM لـ 561 حويصلات MCF-7 المرطبة التي تم تحليلها إلى توزيع أقطار المجالات المكافئة للحجم الموضحة في الشكل 12B. يقدر هذا التوزيع حجم حويصلات الغشاء في شكلها الكروي الفطري في سائل حيوي قبل تثبيتها الكهروستاتيكي على سطح الميكا. تمت مقارنة حجم الحويصلة التي تم الحصول عليها من تحليل بيانات AFM مع نتائج التصوير بالتبريد TEM لنفس العينة ووجد أن في اتفاق وثيق3 (الشكل 12B). تشير مقارنة الأقطار الهيدروديناميكية التي تقاس بأحجام الحويصلات التي تم الحصول عليها(الشكل 1)إلى أن حركة الاكسوسوم أصغر بكثير مما كان متوقعاً من حجم الحويصلات التي يحددها مقياس الحمى القلاعية والهيكل الجليدي -TEM القياسات. الفرق بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلة يميز سمك الطبقة الإكليلية المحيطة الحويصلات الخارجية.
الشكل 1: مقارنة بين أقطار المركبات الكهربائية الهيدروديناميكية والهندسية. الحجم الهندسي للحويصلة الخارجية أصغر بكثير من حجمه الهيدرودينامي المحدد من انتشاره في سائل. الفرق هو الطبقة الإكليلية التي شكلتها الجزيئات المموّرة والممسة الغشاء ية التي تعوق حركة المركبات الكهربائية. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع3 وإعادة طباعته بإذن.
الشكل 2: خصائص مسبار AFM. يمكن تحديد الهندسة وأبعاد مسبار AFM باستخدام وظيفة تلميح الطراز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تصحيح القطع الأثرية التصويرية الناجمة عن الإلتواء عينة طرف. من خلال تنفيذ "إعادة إنشاء Surface"، يمكن تصحيح بيانات AFM المكتسبة للنتائج الملموسة للأطراف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تصحيح للإمالة في الركيزة. يحدد مستوى المستوى مستوى الركيزة ويطرحها من بيانات AFM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصحيح المحاذاة في صفوف المسح الضوئي. خوارزمية تقليدية لمحاذاة بيانات المسح الضوئي هو العثور على متوسط الارتفاع على طول كل خط المسح الضوئي ويطرح النتيجة من الصف المقابل من نقاط البيانات في الصورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تصحيح الثغرات في البيانات المحاذية. يمكن إزالة أخطاء المسح الضوئي الشائعة، المعروفة باسم الندوب، من بيانات AFM عن طريق تطبيق وظيفة إزالة الندوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: محاذاة الركيزة عند ارتفاع صفري. يتيح خيار تسوية الأساس في قائمة المستوى للمستخدم وضع سطح الركيزة عند مستوى الأساس المقابل لارتفاع الصفر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: تحديد الحويصلات المعطلة على السطح الممسوح ضوئياً. (أ)يتم تحديد الاكسوسومات المعطلة على السطح على أنها حبوب جاحظة فوق الركيزة بواسطة عتبة ارتفاع يختارها المستخدم والمحددة في Mark by Threshold. (ب)نتيجة تحديد الهوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تحليل بيانات الموجات فوق السّهف. يتم عرض توزيع الارتفاعات القصوى فوق الركيزة داخل المنطقة التي تشغلها exosomes المحددة كما تم تجميعها من قبل أداة توزيع الحبوب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: تأثير تعديل السطح وتركيز EV للكثافة السطحية للحويصلات المعطلة. (أ)صورة ارتفاع AFM من الركيزة ميكا مخطوف ة حديثا بعد 12 ح الحضانة مع MCF-7 عينة exosome تليها التنظيف بالماء DI والتجفيف. إن تجميد المركبات الكهربائية من السائل إلى الركيزة غير فعال دون نقل شحنة إيجابية إلى سطح الميكا. ومن المرجح أن يكون عدد قليل من الجسيمات التي يُرى في الفحص نتيجة لإزالة غير كاملة للعينة MCF-7 قبل أن يجف الركيزة. (ب)مسح ارتفاع سطح الميكا في الهواء بعد العلاج مع كلوريد النيكل يظهر الركيزة خالية من التلوث. لوحات(C)و(D)تظهر مسح ارتفاع AFM التي تم الحصول عليها بعد تعديل الشحنة السطحية والحضانة مع نفس عينة MCF-7 كما هو الحال في لوحة(A)لمدة 24 ساعة و 12 ساعة على التوالي. التركيز السطحي للحويصلات المعطلة كثيفة بشكل مفرط بعد حضانة 24 ساعة. يؤدي الحضانة 12 ساعة إلى عدد أقل من exosomes المعطلة على السطح وبيانات المسح الضوئي التي هي أسهل لتحليل بدقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: صور AFM لـ MCF-7 exosomes مُموَّلم ة معطلة كهربائياً على سطح الميكا المعدل. (أ)صورة الارتفاع. (ب)صورة المرحلة AFM المقابلة تؤكد أن الحبوب في صورة الارتفاع هي جسيمات نانوية لينة، كما ينبغي أن يتوقع للحويصلات الغشاء. (C)بيانات الارتفاع للحويصلات الثلاثة التي عبرها الخط المبين في لوحة(أ)توضح شكل مسطح الناجمة عن جاذبية الكهروستاتيكي من exosomes إلى سطح مشحونة بشكل إيجابي من الميكا المعدلة. (D)تشويه الشكل واضح في عرض الموسع الحويصلة المعطلة محاصر في لوحة(A)والمقطع العرضي لها. وتظهر صورة المرحلة من نفس الحويصلة في(E). يتم تعديل هذا الرقم من المرجع3 وإعادة طباعته بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: التوصيف الأبعادي للحويصلات المرطبة المعطلة على السطح وتقدير حجمها الكروي في الحل. (أ)توزيع ارتفاعات الذروة فوق السطح (منحنى أحمر) لديه متوسط يساوي 7.9 نانومتر. المنطقة التي تشغلها exosomes المعطلة لديها 69.6 نانومتر متوسط القطر (منحنى أزرق). (B)صورة ارتفاع AFM لواحدة من exosomes المعطلة يوضح شكله منحرف للغاية الناجمة عن القوى الكهروستاتيكية. ويمكن تقدير الحجم الكروي للحويصلات الخارجية في الحل عن طريق مطابقة الأحجام المغلقة بمغلفات غشاءية معطلة على السطح وكروية. (C)تم تحديد حجم توزيع الحويصلات الكروية في الحل (منحنى أحمر) من بيانات AFM من 561 الحويصلات المعطلة. أحجام الحويصلة في الصور بالتبريد TEM (منحنى أزرق) متسقة مع نتائج AFM. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع3 وإعادة طباعته بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 13: التركيز السطحي والقطع الأثرية للفصل في الحجم أثناء ترسب المركبات الكهربائية السلبية من سائل التبخر. (أ)تظهر صورة الفحص المجهري للإلكترون (SEM) أن التركيز السطحي للاكسوسوم المودعة بشكل سلبي من سائل التجفيف متغير مكانياً عندما لا يتم إجراء تجميد السطح من سائل حيوي مُعلّق. (ب)ترسب سلبي من المركبات الكهربائية من عينة التجفيف يسبب الحويصلات حجم العزل. يتم قياس تباين الحجم الكبير بواسطة وظائف كثافة الاحتمال (pdf) للحويصلات في مناطق مختلفة في الصورة (A) التي تحددها الخطوط القطرية البيضاء. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع1 وإعادة طباعته بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 14: هندسة على شكل كأس من الحويصلات المجففة المودعة بشكل سلبي على السطح أثناء التبخر السائل. ومن المعروف أن جفاف سطح الحويصلات التي لم يتم تعطيلها من قبل القوى الكهروستاتيكية يؤدي إلى ظهور على شكل كوب لوحظ في كثير من الأحيان في صور SEM من المركبات الكهربائية. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع1 وإعادة طباعته بإذن. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إن تجميد المركبات الكهربائية من سائل بيولوجي، ومسح سطحي، وتحليل الصور هي الخطوات الأساسية للبروتوكول المطور لتوصيف AFM للمركبات الكهربائية في السائل. عدد الحويصلات القابلة لموازين التصوير AFM مع المساحة السطحية المصورة والتركيز السطحي للحويصلات المعطلة على الركيزة. نظرا لإمكانات زيتا السلبية من المركبات الكهربائية وexosomes18،ونحن ندعو إلى تثبيت كهرباء من المركبات الكهربائية من العينات السائلة إلى الركيزة AFM. يكون تجميد الحركة فعالاً عندما يتم شحن السطح بشكل إيجابي. قبل تجميد EV، قد تحتاج إلى نقل الشحنة السطحية الإيجابية إلى الركيزة، كما هو الحال في الميكا - معدن سيليكات الطبقات مع الصيغة العامة KAl2(AlSi3O10)(OH)2. سطح الميكا المشقق حديثا هو قريب من شقة تماما، وهو مثالي لتصوير الجسيمات النانوية من قبل AFM، ولكن شحنة سطحه سلبية، وبالتالي، يجب تعديلها. يصف البروتوكول الإجراء لنقل تغيير سطح إيجابي إلى الركيزة AFM. تظهر النتائج التمثيلية تحسنا ملحوظا في تثبيت EV من السوائل الحيوية إلى الركيزة الميكا المعدلة.
عند تصوير الحويصلات المائية، من المهم تقليل تبخر العينة الذي يسبب القطع الأثرية ترسب السطح والتدفقات الحرارية ويزيد من تركيز السائل من الحويصلات مع مرور الوقت، مما يؤدي إلى تركيز سطح أعلى من المركبات الكهربائية المعطلة مما كان متوقعا، وخاصة خلال عمليات الحضانة لفترات طويلة. أصحاب التحقيق مصممة صراحة لعينات السائل القضاء أو التبخر البطيء، وينبغي أن تستخدم لصورة المركبات الكهربائية رطب. يتم تقليل الروابط غير المحددة لمسبار المسح الضوئي في وجود الأنواع الأيونية. لذلك، عند تصوير المركبات الكهربائية المرطبة، فمن الأفضل تغطية الركيزة مع وسيط المخزنة مؤقتا، مثل PBS، بدلا من المياه DI.
أهمية تجميد السطح
يؤدي تجميد المركبات الكهربائية بشكل متسق ويمكن التنبؤ به على الركيزة المعدلة إلى إزالة المصدر الرئيسي للتباين في نتائج AFM. يتم التحكم بسهولة أكبر في جميع خطوات المصب، بدءًا من المسح الضوئي وحتى تحليل البيانات، من خلال اختيار الأجهزة والمسبارات ومعلمات المسح الضوئي وتسلسل تحليل البيانات والخوارزميات. وينبغي أن يكون المستخدم على علم بتقلب المراحل الأولية في العينات البيولوجية وبروتوكولات عزل المركبات الكهربائية، وهي مسائل هامة تتجاوز نطاق هذا العمل.
نوصي بإجراء تجميد سطح EV على سطح الميكا المعدل من العينات السائلة حتى عندما يكون الهدف هو توصيف الحويصلات المجففة في الهواء - والحاجة أقل وضوحا منذ الحويصلات سوف تودع لا مفر منه على أي الركيزة كما السائل يتبخر. في الواقع، تم الإبلاغ عن نتائج AFM لEV المجففة التي تم الحصول عليها دون تعديل الشحنات السطحية الميكا، وهو خطوة مسبقة لشل الكهرباء من المركبات الكهربائية من سائل، في الماضي19،20،21 . عندما لا يتم إصلاح المركبات الكهربائية على السطح من العينة السائلة، ومع ذلك، فإن ترسبها السلبي عن طريق التبخر تنتج القطع الأثرية المعروفة مجتمعة باسم تأثير حلقة القهوة22. اثنين من هذه القطع الأثرية، التي تحدث كسائل التجفيف ينحسر، موضحة في صورة SEM(الشكل 13A)من exosomes المصل المودعة عن طريق التبخر على سطح زجاجي مشحونة سلبا. وهناك اختلافات كبيرة في التركيز السطحي للحويصلات المعبَّلة واضحة على الفور. والقطعة الأثرية الثانية، التي تم قياسها كمياً في الشكل 13باء،هي التباين الكبير في أحجام الحويصلات في مناطق مختلفة داخل محيط العينة المجففة. وبالنظر إلى هذه القطع الأثرية، فإن توصيف الحويصلات المودعة بشكل سلبي من سائل التجفيف قد يؤدي إلى نتائج متحيزة أو غير متسقة ما لم يتم مسح المساحة السطحية بأكملها التي كانت تشغلها في البداية عينة سائلة مجففة الآن.
وينبغي النظر في مسألتين إضافيتين عند تصوير العينات المجففة التي تم الحصول عليها دون تجميد ثابت للحويصلات على الركيزة. أذكر أن بروتوكولنا يوعز للمستخدمين لغسل تماما السطح مع المياه DI بعد أن يتم تعطيل الحويصلات من عينة سائلة. وتهدف هذه الخطوة إلى منع الأيونيين وغيرها من الحويصليات غير الحويصلية من تشكيل الرواسب السطحية أثناء تبخر السوائل الحيوية المعقدة مع التناضح الكبير. إذا لم يتم إصلاح المركبات الكهربائية، فإن الغسيل الشامل سيفصل عدداً كبيراً من الحويصلات عن السطح، مما قد يؤدي إلى تحيز النتائج وترك عدد قليل جداً من الجسيمات للتحليل. وثمة صعوبة شائعة أخرى، يتم تقليلها عن طريق تعطيل المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل قبل تصوير AFM، وهي تصاق الجسيمات بالمسبار23 والقطع الأثرية المضللة الناجمة عن هذه الظاهرة.
السيطرة على الكثافة السطحية للمركبات الكهربائية المعطلة
يسمح العاملان اللذان يمكن التحكم فيهما بسهولة في البروتوكول للمستخدم بتخصيص التركيز السطحي للمركبات الكهربائية المعطلة على الركيزة الميكا المعدلة: تركيز الحويصلات في العينة السائلة والوقت الذي يتم فيه احتضان العينة على الركيزة. زيادة الكثافة العالية للحويصلات المعطلة، التي تحققت مع فترات حضانة أطول وتركيز أعلى للمركبات الكهربائية في السائل، من عدد الحويصلات التي تم تحليلها أثناء المسح الضوئي والقوة الإحصائية للاستنتاجات التي تم التوصل إليها من خلال تحليل AFM البيانات. وفي الوقت نفسه، فإن التركيز السطحي الكثيف بشكل مفرط، كما هو الحال في الشكل 10C حيث تغطي الجسيمات بإحكام السطح بأكمله دون وجود مناطق تدخل ية من الركيزة، يعقد تحليل الصورة وتفسير النتائج وقد يؤدي إلى مسح القطع الأثرية الناجمة عن التفاعل بين الجسيمات المتباعدة عن كثب.
تأثير الفحص الكهروستاتيكي والتنقل الهيدرودينامي للمركبات الكهربائية
إن التحكم الشفاف في التركيز السطحي للمركبات الكهربائية المعطلة كدالة للعوامل التي تؤثر عليه اسمح للمستخدم بتخصيص الظروف التجريبية لتلبية الاحتياجات المحددة للدراسة. عند إجراء التخصيص، من المهم أن ندرك أن تجميد السطح الكهروستاتيكي هو عملية محدودة النقل تتأثر بالقوة الأيونية للسائل الحيوي.
ويؤثر تركيز الأنواع الأيونية والمشحونة بشكل إيجابي عكسيا ً على طول ديبي الذي يتم فحص السطح ورسوم الحويصلة. وإلى ما وراء هذا الطول، فإن القوى الكهروستاتيكية لا تذكر. ستكون الطبقة الحدودية من جاذبية الكهرباء الساكنة للطبقة الساكنة أصغر بكثير في PBS الغنية بالبيانات ية من المياه DI. وهذا الفرق يعني أنه بعد حضانة قصيرة تقابل الوقت اللازم لاستنفاد طبقة السائل حيث يشعر الجذب الكهربائي، فإن الكثافة السطحية للمركبات الكهربائية المعطلة من التعليق في مياه DI ستكون أعلى من PBS التعليق، على افتراض تركيز المركبات الكهربائية هو نفسه في كل من السوائل. وبشكل مختلف، يجب تعطيل المزيد من الحويصلات لاستنفاد طبقة جاذبية أكثر سمكاً في مياه DI مما هي عليه في PBS في ظل ظروف متطابقة.
بعد استنفاد الحويصلات من طبقة الحدود، يصبح الجمود عملية محدودة النقل بالكامل. وفي هذا النظام، لن يعتمد معدل الترسيب على الوسيلة اليعلقة (مثل مياه DI أو PBS) ما دامت اللزوجة هي نفسها وأن النقل غير مُعلِّق تماماً. ومع ذلك، فإن نقل الحويصلات إلى طبقة حدود الجذب قد لا يكون غير مُقَدَّم تماماً. على سبيل المثال، إذا كانت العينة في قطرة sessile على الركيزة AFM يتبخر جزئيا أثناء الحضانة، فإن السائل داخل قطرة سوف تخضع لتدفق التبخر يحركها، ونقل الحويصلات نحو الركيزة سيكون، على حد سواء، مساهمات غير مُقَدِّمة وعملية. وعندما لا يتم التحكم في التبخر على نحو كاف، تكون مساهمة النقل الحراري كبيرة، وسيكون معدل التعطيل أعلى مما كان متوقعا. وسوف يتغير تأثير النقل الحراري مع سمك طبقة الجذب، والتي تعتمد في حد ذاتها على المحتوى الأيوني للسائل. وعلاوة على ذلك، فإن التبخر تعزيز تجميد الحويصلة على الركيزة من خلال تركيز المركبات الكهربائية في الحل. في تركيزات EV أعلى، فإن تدرج التركيز بين طبقة الجذب والسائل المجاور سوف تزيد، وخلق قوة دافعة أكبر دينامية حرارية لهجرة الحويصلات نحو الركيزة.
قد تمثل الحويصلات المعطلة عينة سائلة مع تحيز. بالنسبة للحالة التي يكون فيها معدل التعطيل محدوداً بالانتشار، فإن الحويصلات ذات الأحجام الهيدرودينامية الأصغر حجماً، التي يحددها الجمع بين حجم الحويصلة وسمك الطبقة الإكليلية المحيطة بها(الشكل 1)،هي أكثر عرضة للدخول في طبقة الجذب بسبب ارتفاع حركتهم. وبالتالي، بعد فترة الاستنفاد الأولية، سيتم تمثيل المركبات الكهربائية الصغيرة الهيدروديناميكية تمثيلاً زائداً على الركيزة مقارنة بمساهمتها في مجموعة مركبات المركبات الكهربائية في العينة السائلة. لاحظ أن الحجم الهيدرودينامي الأصغر لا يشير تلقائيًا إلى المركبات الكهربائية ذات أحجام الحويصلة الأصغر بسبب عدم التجانس في سمك الطبقة الإكليلية3. يتم تجنب التمثيل المتحيز مع الحضانة الطويلة التي تستنفد جميع السكان من المركبات الكهربائية في السائل من خلال تجميدها على الركيزة. عندما يهدف المستخدم إلى شل حركة جميع المركبات الكهربائية من السوائل الحيوية، لتجنب التغطية الكثيفة المفرطة للسطح مع الحويصلات المعطلة، قد يكون من الضروري تقليل تركيز EV في السائل تحت النطاق المقترح في البروتوكول.
تشوه المركبات الكهربائية على الركيزة
يمكن أن تتميز الحويصلات خارج الخلية في حالتها المرطبة الأصلية وبعد الجفاف بـ AFM، كما هو موضح في البروتوكول. القوى الكهروستاتيكية24 التي تعطل EVs على سطح الميكا أيضا تشويه شكلها من الهندسة الكروية التي توجد في الحل. ويمكن تحليل تأثير الجفاف على حجم ومورفولوجيا المركبات الكهربائية المعطلة عن طريق إعادة مسح نفس المساحة السطحية قبل وبعد السماح للعينة بالجفاف.
ومن المفيد دراسة تأثير إعداد العينة على شكل المركبات الكهربائية المجففة. تحافظ المركبات الكهربائية المعطلة على الهندسة المنبسطة للغاية بعد التجفيف ولكن يتم تسطيحها أكثر من خلال الجفاف. يصبح الارتفاع فوق سطح الحويصلات المجففة أصغر مما هو عليه في الشكل 12A، في حين أن مساحة البصمة الخاصة بهم تزداد (البيانات غير المعروضة). من ناحية أخرى، عندما يتم إيداع الحويصلات بشكل سلبي أثناء التبخر السائل ودون تجميد مسبق على السطح، فإنها تميل إلى تحقيق هندسة على شكل كوب عند الجفاف، كما لوحظ منذ فترة طويلة في الصور SEM، ومؤخرا، في AFM مسح. هذا الشكل المقبب معترف به الآن كقطعة أثرية إعداد عينة25 الناجمة عن عدم التوحيد في القوى الشعرية أثناء جفاف السطح، كما هو موضح ميكانيكيا في الشكل 141.
تحليل الصور وتفسير بيانات AFM
توفر الاستجابات للقوى الكهروستاتيكية والشعرية التي تعمل على تشويه شكل المركبات الكهربائية معلومات قيمة عن الخصائص الهيكلية والتركيبية للمركبات الكهربائية. على سبيل المثال، تم استخدام مجموعة متعددة الأبعاد من الخصائص البيوفيزيائية، مثل الحجم المشوه والشكل المستخرج من بيانات AFM، مؤخرًا لإثبات الجدوى للتمييز بين الاكسوسوم التي تفرزها الخلايا المضيفة المختلفة5. ويمكن أيضا أن تؤخذ التشوهات في الاعتبار وتعويضها. على سبيل المثال، أظهرنا كيفية استخدام بيانات AFM لتوصيف الحجم الكروي للحويصلات في الحل من خلال تقدير أقطار المجالات التي تغلف نفس الحجم مثل exososmes المعطلة3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وينوه المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة IGERT-0903715)، وجامعة يوتا (منحة بذور الهندسة الكيميائية وجائزة زمالة بحوث الدراسات العليا)، ومعهد سكولكوفو للعلوم والتكنولوجيا (زمالة سكولتيك).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
