يتم وصف إجراء خطوة بخطوة لشل الحركة الخالية من الملصقات من الحويصلات الخارجية والحويصلات خارج الخلية من العينات السائلة وتصويرها عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM). وتستخدم الصور AFM لتقدير حجم الحويصلات في الحل وتميز الخصائص البيوفيزيائية الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إكسوسومات وغيرها من الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي المجمعات الجزيئية تتكون من حويصلة غشاء الدهون، والديكور السطحي من قبل بروتينات الغشاء والجزيئات الأخرى، والمحتوى الإنارة المتنوعة الموروثة من الخلية الأم، والتي تشمل RNAs، البروتينات، وDNAs. وقد أصبح توصيف الأحجام الهيدرودينامية للمركبات الكهربائية، الذي يعتمد على حجم الحويصلة وطبقته الإكليلية التي تشكلها الزخارف السطحية، أمرا روتينيا. بالنسبة للاكسوسوسوم، أصغر المركبات الكهربائية، الفرق النسبي بين أحجام الهيدروديناميكا والحويصلات كبير. ولا يزال توصيف أحجام الحويصلات بواسطة التصوير المجهري الإلكتروني للإرسال المبرد (cryo-TEM)، وهو تقنية قياسية ذهبية، يشكل تحدياً بسبب تكلفة الأداة، والخبرة المطلوبة لإجراء إعداد العينة، والتصوير، و تحليل البيانات، وعدد قليل من الجسيمات التي غالبا ما لوحظت في الصور. وثمة بديل متاح على نطاق واسع ويمكن الوصول إليه هو الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM)، الذي يمكن أن ينتج بيانات متعددة الاستخدامات عن الهندسة ثلاثية الأبعاد، والحجم، وغيرها من الخصائص الفيزيائية الحيوية للحويصلات خارج الخلية. ويرشد البروتوكول المطور المستخدمين في استخدام هذه الأداة التحليلية ويحدد سير العمل لتحليل المركبات الكهربائية من قبل AFM، والذي يتضمن إعداد عينة لتصوير المركبات الكهربائية في شكل رطب أو المجففة، والجمود الكهروستاتيكي لل الحويصلات على الركيزة، والحصول على البيانات، وتحليلها، والتفسير. وتبين النتائج التمثيلية أن تثبيت المركبات الكهربائية على سطح الميكا المعدل يمكن التنبؤ به، ويمكن تخصيصه، ويسمح للمستخدم بالحصول على نتائج تغيير الحجم لعدد كبير من الحويصلات. وقد تبين أن تغيير حجم الحويصلة استنادا إلى بيانات AFM يتسق مع التصوير بالتبريد- TEM.
المقدمة
توجد الحويصلات خارج الخلية (EVs) في جميع سوائل الجسم، بما في ذلك الدم والبول واللعاب والحليب والسائل السلوي. تشكل Exosomes فئة منطقة من المركبات الكهربائية المتمايزة عن المركبات الكهربائية الأخرى عن طريق التكوين الحيوي الأنبي، وعلامات المسار الأنبي، وأصغر حجم بين جميع المركبات الكهربائية. وكثيرا ً ما يتم الإبلاغ عن حجم الاكسوسوسوم مع تباين كبير بين الدراسات. تم العثور على نتائج التحجيم لتكون تعتمد على طريقة، مما يعكس الفرق في المبادئ المادية المستخدمة من قبل تقنيات تحليلية مختلفة لتقدير أحجام EV1،2. على سبيل المثال، يقدر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) - وهو تقنية توصيف الحجم الأكثر استخداماً - حجم المركبات....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عزل المركبات الكهربائية من السوائل الحيوية
- عزل المركبات الكهربائية بإحدى الطرق المعمول بها، مثل التفاضل الفائقجداً 8، هطول الأمطار، أو الكروماتوغرافيا ذات الاستبعاد الكبير9.
- تأكيد وجود العلامات الحيوية السطحية والقطنية المتوقعة وعدم وجود علامات بيولوجية تشير إلى التلوث المتبادل للإعداد. تأكيد مورفولوجيا ثنائية الطبقات من الجسيمات المعزولة عن طريق المجهر الإلكتروني.
ملاحظة: عند عزل الاكسوسوم، يجب أن يكون توزيع الحجم الهيدرودينامي الذي يقاس بتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أو تشتت الضوء الديناميكي في النطاق المتوقع. تفاصيل EV والعزلة الخارجية خارج نطاق هذا البروتوكول. تعتمد الط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تثبيت سطح المركبات الكهربائية هو خطوة حاسمة في تسلسل التصوير. سوف يحدث تجميد السطح الكهروستاتيكي من exosomes، المعروف أن لديها إمكانات زيتا سلبية، بقوة بعد تعديل الركيزة الميكا أن يكون لها شحنة سطح إيجابية. دون العلاج مع NiCl2 لنقل التغيرات السطحية الإيجابية، تم العثور على تجميد المركبات الكهربائية على الركيزة لتكون غير فعالة. صورة الارتفاع في الشكل 10A، التي تم الحصول عليها في الهواء بعد عينة MCF-7 exosome تحتوي على 2.59 × 1010 الحويصلات لكل مل من PBS تم احتضانها لمدة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
إن تجميد المركبات الكهربائية من سائل بيولوجي، ومسح سطحي، وتحليل الصور هي الخطوات الأساسية للبروتوكول المطور لتوصيف AFM للمركبات الكهربائية في السائل. عدد الحويصلات القابلة لموازين التصوير AFM مع المساحة السطحية المصورة والتركيز السطحي للحويصلات المعطلة على الركيزة. نظرا لإمكانات زيتا السلبية من المركبات الكهربائية وexosomes18،ونحن ندعو إلى تثبيت كهرباء من المركبات الكهربائية من العينات السائلة إلى الركيزة AFM. يكون تجميد الحركة فعالاً عندما يتم شحن السطح بشكل إيجابي. قبل تجميد EV، قد تحتاج إلى نقل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وينوه المؤلفون بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (رقم الجائزة IGERT-0903715)، وجامعة يوتا (منحة بذور الهندسة الكيميائية وجائزة زمالة بحوث الدراسات العليا)، ومعهد سكولكوفو للعلوم والتكنولوجيا (زمالة سكولتيك).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدة تحكم AFM/STM | Bruker | Multimode Nanoscope V | تدعم وحدة التحكم AFM هذه تصوير العينات البيولوجية في السائل والهواء. |
| أقراص عينة معدنية AFM / STM (10 مم) | TedPella | 16207 | قرص عينة معدني يتم توصيل قرص الميكا عليه بشريط على الوجهين أو أي وسيلة أخرى. |
| أقراص الميكا AFM/STM (10 مم) | TedPella | 50 | ميكا V1 عالية الجودة، بسمك 0.21 مم (0.0085 بوصة). متشابكة ، في عبوات من 10. يمكن تركيبه على أقراص AFM / STM. متوفر بأربعة أقطار مسبار |
| AFM للتصوير في الهواء Bruker | TESP-V2 | مجسات سيليكون محفورة عالية الجودة لوضع التنصت ووضع عدم الاتصال للمسح في الهواء. | |
| مسبار AFM لتصوير العينة الناعمة في | ناتئ نيتريد السيليكون الناعم Bruker MLCT السائل مع أطراف نيتريد السيليكون ، وهي مناسبة تماما للتشغيل السائل. يتيح النطاق في ثوابت القوة للمستخدمين تصوير عينات ناعمة للغاية في وضع التلامس بالإضافة إلى التحليل الطيفي للحمل العالي مقابل المسافة. | ||
| شريط مزدوج الوجهين | طيف | 360-77705 | يستخدم لإصلاح قرص الميكا على قرص العينة المعدنية. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC عبارة عن مجموعة مملوكة تعتمد على البوليمر مصممة لعزل الإكسوسوم عن وسائط زراعة الأنسجة. |
| مسبار زجاجي حامل AFM للتصوير في السائل | Bruker | MTFML-V2 | تصميم حامل المسبار الزجاجي هذا للمسح الضوئي في السوائل باستخدام MultiMode AFM. يمكن استخدام الحامل في وضع التنصت على قوة الذروة ، ووضع الاتصال ، ووضع التنصت ، وتعديل القوة. يتم تشغيل المسبار صوتيا بواسطة مذبذب بيزو منفصل لتعديل سعة أكبر. يتم تزويد الحامل بمنفذين ، والتركيبات المطلوبة ، ومجموعة الملحقات لإضافة السوائل وإزالتها. |
| جويديون | التشيكي للمترولوجيا. | الإصدار 2.52 | برنامج مفتوح المصدر لتصور وتحليل حقول البيانات التي تم الحصول عليها عن طريق تقنيات الفحص المجهري للمسح. |
| ورق نشاف خال من الوبر | GE Healthcare Whatman | ورق النشاف من الدرجة GB003 | استخدم ورق النشاف هذا لإزالة NiCl2< / sub> بعد تعديل ركيزة الميكا. |
| مناديل غرف الأبحاث الخالية من الوبر | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | استخدم مناديل البوليستر هذه لتنظيف الأسطح. |
| كلوريد النيكل (II) (NiCl 2< / sub>) مسحوق | Sigma-Aldrich | 339350 | يستخدم لصنع 10 ملي مولار NiCl 2< / sub > في محلول ملحي مخزن بفوسفات الماء |
| DI (1x) | Gibco | 10010023 | PBS ، درجة الحموضة 7.4 |
المراجع
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
