Summary
描述了一个分步程序，用于从液体样品中分离体和细胞外囊泡的无标签固定，并通过原子力显微镜（AFM）进行成像。AFM 图像用于估计溶液中囊泡的大小，并描述其他生物物理特性。
Abstract
外体和其他细胞外囊泡 （EV） 是分子复合物，由脂质膜囊泡、其表面装饰（由膜蛋白和其他分子）和从母细胞（包括RNA）继承的多种发光含量组成，蛋白质和DNA。EV的流体动力学尺寸的表征，取决于由表面装饰形成的囊泡和其冠状层的大小，已成为常规。对于最小EV的外生体，水动力和囊泡大小之间的相对差异显著。低温透射电子显微镜（低温-TEM）成像（低温-TEM）成像对囊泡尺寸的表征仍然是一项挑战，因为仪器的成本、执行样品制备、成像和样品制备所需的专业知识数据分析，以及图像中经常观察到的少量粒子。原子力显微镜（AFM）是一个广泛提供且易于获取的替代方法，它可以生成关于细胞外囊泡的三维几何形状、尺寸和其他生物物理特性的通用数据。开发的协议指导用户使用此分析工具，并概述了 AFM 分析 EV 的工作流程，其中包括水合或干燥形式的成像 EV 的样品制备、静电固定基板上的囊泡、数据采集、分析和解释。具有代表性的结果表明，EV在修改后的云母表面的固定是可预测的、可定制的，并允许用户获得大量囊泡的尺寸调整结果。根据AFM数据进行囊泡尺寸的尺寸与低温-TEM成像一致。
Introduction
细胞外囊泡 （EV） 存在于所有体液中，包括血液、尿液、唾液、牛奶和羊水。外体体形成一个区域类别的EV与其他EV不同，通过内生，内生子途径的标记，和所有EV中最小的尺寸。外体体的大小经常被报告，在研究之间有很大的变异性。大小调整结果与方法相关，反映了不同分析技术用于估计EV尺寸1，2的物理原理的差异。例如，纳米粒子跟踪分析 （NTA） 是使用最广泛的尺寸表征技术，它估计了 EV 的大小作为流体动力学直径，该直径描述了溶液中 EV 对布朗流动性的阻力。囊泡的流体动力学直径越大，意味着它在液体中的流动性较低。囊泡周围的冠状层，由表面蛋白质和其他固定在膜表面或吸附的分子组成，严重阻碍流动性，增加EV的流体动力学尺寸。相对而言，这种增加对于外体体3来说特别大，如图1所示。
低温透射电子显微镜（低温-TEM）成像是描述囊泡大小和形态在其水合状态的明确技术。然而，仪器的高成本和使用它所需的专业知识正确地激发了对可成像水合电动汽车的替代技术的探索。在采集的低温-TEM 图像中观察到或特征的 EV 数量相对较少，是该技术的另一个显著缺点。
原子力显微镜（AFM）通过扫描基板上的探针来栅格显示表面粒子的图像，从而可视化水合或干燥EV4、5、6的三维地形。本研究概述了协议对AFM的EV特征的基本步骤。在液体中成像囊泡之前，必须将其固定在基板上，通过系绳到功能化表面、困在过滤器中或静电吸引力7。在带正电基板上的静电固定是一种特别方便的选择，用于对已知具有负Zeta电位的外体体进行固定。然而，固定表面细胞外囊泡的同样的静电力也会扭曲其形状，这使得成像后数据分析变得至关重要。我们通过描述基于固定在表面上的外体体变形形状的AFM数据估计溶液中球状囊泡大小的算法来阐述这一点。
在已开发的协议中，介绍了囊泡强稳定处理程序，并随后介绍了在水合或干燥状态下执行原子力成像所需的步骤。确定了影响固定囊泡表面浓度的因素。指导如何对溶液中不同浓度的EV样品进行静电固定。讨论了基于足够数量的固定囊泡估计不同生物物理特性的经验概率分布的实验条件的选择。给出了AFM数据成像后分析的例子。具体来说，描述了一种算法，用于根据固定性EV的AFM特征来确定溶液中囊泡的大小。具有代表性的结果表明AFM的囊泡大小与低温-TEM成像结果的一致性。
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Protocol
1. 将EV与生物流体分离
- 通过一种既定方法隔离电动汽车，如差分超离心8、降水或尺寸排除色谱学9。
- 确认是否存在预期的表面和发光生物标志物，以及没有表明制剂交叉污染的生物标志物。通过电子显微镜确认分离粒子的脂质双层形态。
注：在隔离外生体时，由纳米粒子跟踪分析（NTA）或动态光散射测量的水动力大小分布应处于预期范围内。EV 和外体隔离的详细信息超出了此协议的范围。所选方法取决于实验问题和研究目标10。以下步骤提供了通过从MCF-7乳腺癌细胞的生长培养基中沉淀来丰富外体的过程的具体例证，使用市售的沉淀试剂盒（材料表）。 - 在细胞培养扩张之前，将MCF-7乳腺癌细胞储存在液氮中。将细胞解冻至亚培养。
- 遵循无菌做法，在 150 mm 板上执行电池电镀。使用由Eagle的最小必需介质、0.01mg/mL人体重组胰岛素和10%不含外泌体胎儿牛血清组成的生长培养基。
- 以95%的空气和5%的CO2使培养基，并在37°C下孵育。
- 细胞沉淀后（电镀后约24小时），更换介质。以 1：10 的比例分割板，并培养 10 个板，每个板包含 20 mL 的介质。
- 当细胞仍处于生长阶段时，从其中9个板（180 mL）以±70~80%汇合的收集光组和池介质。
- 将介质分成 60 mL 和 120 mL，进一步拆分为 30 mL/管，并在 3，000 x g下离心 15 分钟。
- 将上清液从每个管转移到新的无菌 50 mL 管，并执行外体隔离。
- 如果使用了商业隔离套件（材料表），则根据已公布的协议（例如，参见参考文献表 11）通过沉淀分离外泄体，或按照制造商的说明进行分离。作为后一种情况的第一步，在3，000 x g下，离心细胞培养基为15分钟。提取上清液并丢弃细胞和细胞碎片。
- 将沉淀溶液（1：5体积比）添加到上清液中，混合并冷藏过夜。
- 在室温下以1，500 x g离心30分钟。离心后丢弃上清液。
- 在1，500 x g下再旋转剩余的外兆颗粒5分钟。在不干扰颗粒的情况下，通过吸入去除剩余的沉淀溶液。
- 将颗粒重新悬浮在 100×500 μL 的 1x 磷酸盐缓冲盐 （PBS） 缓冲液中，并根据需要分成多个等分，以便进行下游分析。
- 立即对分离的外体体进行表面固定，进行AFM成像。如有必要，将等分在-80°C冷冻，以便日后使用，同时采取预防措施，避免在冷冻-解冻周期期间损坏样品。
2. 细胞外囊泡的表面固定
- 使用坚固的双面胶带、环氧树脂或替代粘合剂将云母盘牢固地连接到 AFM/扫描隧道显微镜 （STM） 磁性不锈钢试样盘上。
- 使用锋利的剃须刀或实用刀，或将胶带固定在顶部表面，然后将其剥离以去除一层材料，从而切割云母圆盘。
注： 这两种方法都应通过去除以前暴露于环境中的薄层云母来显示原始表面。手术后，云母与 AFM/STM 金属试样盘的附件必须保持牢固。 - 在室温下，使用 100 μL 的 10 mM NiCl2溶液处理云母的顶面 10 s，从而将表面电荷从负数修改为正。
- Blot NiCl2溶液，无绒擦拭或印迹纸。用去离子 （DI） 水清洗云母表面 3x，用干氮流将其干燥。
注：最好使用 AFM 扫描修改后的表面，以确认其无污染物。 - 将 AFM 试样盘与附加的表面改性云母放在培养皿中。
- 用1x PBS稀释步骤1.14中的外体样品，以获得4.0 x 109和4.0 x10 10颗粒之间的浓度。每mL溶液。使用 NTA 验证稀释的颗粒浓度。
- 从移液器中排空100 μL稀释的外在体溶液，在云母表面形成顺流滴。
- 将盖子放在培养皿上，用石蜡薄膜密封，以减少样品蒸发。在4°C下孵育样品12~18小时。
注：固定外体的表面密度会随着孵育时间和液体中EV的浓度而增加。如果样品中存在浓度较低的外体，则可能需要更长的孵育时间。 - 孵育后，吸出80~90%的样品，而不会干扰表面。此时，外体将静电固定在云母基板上。
- 在成像水合性 EV 之前，使用 1x PBS 冲洗表面。重复 3 次。注意在整个击球过程中保持样品水分。
- 用 1x PBS 清洗云母表面后，取出 80%~90% 的液体，并移液器 +40 μL 的新鲜 1x PBS 覆盖样品。
- 对干燥EV进行成像时，用DI水冲洗基板。重复 3 次。
注：用DI水稀释会防止盐晶体的形成和基底干燥时溶质在表面上沉积。 - 在成像干燥 EV 之前，在不接触表面的情况下吸收尽可能多的液体，用干氮流干燥其余部分。
3. AFM成像
- 要对干燥 EV 进行成像，请选择用于在攻丝和非接触式成像模式下在空中扫描的悬臂，并将其安装到探头支架上。
注： 在选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，可作为选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，使用材料表中列出的悬臂示例特性（123 μm 长度、40 μm 宽度、7 nm 尖端半径和 37 N/m 弹簧常数）。- 将步骤 2.13 的准备放在 AFM 阶段。磁性不锈钢试样盘将固定样品在舞台上。留出时间进行准备，让舞台以热平衡。
- 使用攻丝模式扫描云母表面足够大的区域。例如，选择5 x 5 μm的面积，以±1 Hz的扫描速率在512条线中栅格。 获取高度和相位图像，因为它们提供有关样品地形和表面特性的补充信息。
注： 扫描时间会随着图像区域和选择形成图像的行数而增加，但随着扫描速率定义为每秒扫描的行数，扫描时间将减小。快速扫描速率可能会影响图像质量。因此，栅格的速度应在采集时间和图像质量之间在司法上平衡。
- 要成像水合体囊泡，请选择适合扫描柔软、水合样品的悬臂，并将悬臂安装到用于液体扫描的探头支架上。
注： 在选择与可用 AFM 仪器兼容的探头时，材料表中列出的探头规格（标称长度为 175 μm、宽度 22 μm、20 nm 尖端半径、0.07 N/m 弹簧常数的三角形悬臂）和优化了在 4 到 8 kHz 范围内的驱动器频率的成像，可作为指南。- 用 1x PBS 将悬臂的尖端湿润，以减少在扫描过程中将气泡引入液体的可能性。
- 将步骤 2.11 的准备放在 AFM 阶段。磁性不锈钢试样盘将固定在其表面的装有固定 EV 的所连接的云母。
- 留出时间进行准备，让 AFM 级以热平衡。
- 在攻丝模式下对水合的云母表面进行成像。获取高度和相位图像。
注： 成像质量受仪器、所选探头和扫描参数的影响。优化扫描条件时，以下选项可作为起点：512 条线路扫描的 5 x 5 μm 区域，扫描速率为 +0.8-1.0 Hz，驱动频率介于 4 到 8 kHz 之间。
4. 图像分析
注： 以下数据处理和分析步骤应用于采集的高度图像。可以调整类似的过程来分析相位数据。下面的描述是特定于Gwydion12，一个根据GNU通用公共许可证提供的自由和开源软件。其他软件工具也有类似的功能。
- 转到数据处理，SPM模式，提示并选择模型提示（图2）。选择用于扫描样本的几何体和尖端的尺寸，然后单击"确定"。
- 通过执行曲面重建来校正尖端侵蚀伪影。打开图像。从菜单中，选择"数据处理"、"SPM模式"提示，然后选择"曲面重建"并单击"确定"（图 3）。
- 通过从扫描数据中删除基板中的倾斜，对齐成像平面以匹配实验室 XY 平面。要完成此任务，请选择"数据处理""级别"并选择平面级别（图 4）。
- 通过选择"数据处理""更正数据"对齐图像行，然后选择"对齐行"。有几个对齐选项可用 （图 5）。例如，Median是一种算法，用于查找每个扫描线的平均高度并从数据中减去它。
- 转到数据处理，更正数据，然后选择"删除疤痕"（图6），这可消除常见的扫描错误，称为疤痕。
- 通过选择从数据处理中访问的"水平"下拉菜单中的"拼合基"，在零高度 Z = 0 处对齐云母表面（图 7）。
- 使用"按阈值在颗粒中标记"下拉菜单（图 8A）识别扫描表面上的 EV。该算法将表面固定外在体体识别为从零表面基底伸出的粒子，其高度高于用户选择的阈值。选择 1 到 3 nm 范围内的阈值，这将消除大多数背景干扰。较小的阈值用于更清洁的背景。
注：图 8A中的阈值为 1.767 nm。具有此阈值的 MCF-7 外在体识别的结果如图8B所示。Gwydion 提供了几种阈值的替代方法，作为自动识别图像中囊泡的算法，包括自动阈值（Otsu 方法）、边缘检测和分水岭算法。
注： 粒子聚集物（如果存在于 AFM 图像中）可能被屏蔽并从分析中排除。 - 使用从"颗粒"菜单访问的可用分布算法，对已识别的 EV 执行几何和尺寸特征化。
注： Gwydion 提供工具，用于评估在水合或干燥状态下固定式 EV 的标量值、areal、体积和其他特性的分布情况。如图 9所示的标量值属性示例，它给出了每个已识别的外显体足迹内的最大高度分布。 - 从 Gwydion 导出 AFM 数据，以便其他计算工具和自定义计算机程序进行专门分析。
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Representative Results
电动汽车的表面固定是成像序列中的关键步骤。外体体静电表面固定（已知具有负齐塔电位）将在云母基板被修改为具有正表面电荷后发生。如果不使用NiCl2进行表面正变化的处理，则发现基板上的EV固定作用无效。图10A中的高度图像，在含有2.59 x10 10囊泡的MCF-7体外体样品后在空气中获得，每mL的PBS囊泡在未修改的云母表面孵育了12小时，显示在表面后，它用DI水清洗。图10A中可见的囊泡很可能是DI水未解吸入的结果，水重新悬浮的囊泡没有固定在表面，然后在蒸发时将其放在基板上。
使用氯化镍修改表面电荷后，建议在处理后确认表面无污染物。图10B中的高度图像（在空气中获得）给出了一个使用NiCl2处理后表面清洁的示例，然后用DI水洗涤了三次。阳离子衍生表面的粗糙度低于0.3纳米，这与上一份报告13一致。
图10C，D说明了表面电荷修改对MCF-7外体固定效率的巨大积极影响。这两个面板显示样品在空气中采集的高度扫描，以前如图10A所示，分别在氯化镍表面孵育24小时和12小时。
给定样品在已处理表面孵育的时间决定了固定内动EV的表面浓度（每个区域的囊泡）。图10C中的高度图像说明了在所述MCF-7外体样品孵育24小时后获得的固定囊泡表面覆盖过密的情况。许多算法依赖于在颗粒之间有足够的未占用基板来执行图像校正和数据分析。例如，对基板进行调平和将基板移至零平面、线校正和估计颗粒体积需要中间的平面进行精确计算。当固定囊泡的浓度与图10C一样高时，这些算法将不能可靠地工作。图10D中的高度图显示了从同一MCF-7样品中固定的囊泡表面浓度的足够实例，这是在较短（12小时）孵育后获得的。
需要对采集的原始 AFM 数据进行后处理，以纠正常见的扫描错误。以下描述特定于格维迪翁。其他 AFM/SPM 数据分析工具也提供类似的功能。
在Gwydion内，平面水平函数用于校正基板中的倾斜。这种背景校正是先使用图像中的所有数据点查找基板的平面，然后从原始数据中减去它来完成的。沿扫描线的校正通过对齐行函数完成。例如，一个实现的算法通过计算每个扫描线的中值高度，然后从相应的图像数据行中减去结果来执行对齐。通过应用"删除疤痕"功能，可以消除反馈回路中局部故障的贡献，该函数可填补对齐数据中的空白，并通过比较相邻扫描线中的数据来消除疤痕。基板向高程 Z = 0 的偏移可以通过在遮蔽颗粒和其他特征后将曲面的面和多项式平平组合来实现。Gwydion的"扁平化基础"工具可自动执行此任务，或者使用用户指定的掩码执行此任务。在描述的背景和线路修正后，通过执行Mark Grains函数，可以在基板上识别静电固定囊泡。
图11A和图11B显示了水合MCF-7外体在云母表面固定并在PBS中使用攻丝模式获取的高度和相位图像。使用Mark Grains函数阈值算法在扫描区域中共识别了 561 个水合囊泡，阈值设置为 ±20%。探头在驱动频率下响应的相位滞后对软样品中的局部刚度变化很敏感。因此，如图11A（B）所示，高度和相位图像之间的一致性是一个重要的确认，证明图像颗粒确实固定在基板上。
图11C显示了高度图像的横截面，通过位于图11A白线上的外显体。虽然生物流体中的体外体具有球状几何体1、14、15、16，但基板上的形状被静电吸引到正电荷时严重扭曲表面。图11D中进一步说明了静电固定囊泡的倾斜煎饼状几何形状，图11D中图11A中盒装的外显体近身高度图像（及其横截面）进一步说明了该几何体。相应的相位图像如图11E所示。AFM扫描中识别的所有561个水合囊泡在地表以上的峰值高度的经验概率密度函数（pdf）如图12A所示。此分布的平均值为 7.9 nm，在无变形力的情况下，该值大约等于磷脂双层17厚度的两倍。
固定外兆体占据的基板上的区域近似为直径等于从囊泡的"质量中心"到云母表面边界的平均距离的圆。这些投影直径的分布如图12A所示，平均值等于 69.6 nm。得到的高度和直径分布进一步量化了静电表面固定对固定外体变形形状的重大影响。
通过三次重新分析相同的MCF-7样品（从样品制备到成像，每个重复产生的结果在统计上与图12所示的结果相似），证实了协议程序的鲁棒性和可重复性。
静电引起的固定囊泡变形可以补偿或解释，以便深入了解成像 EV 的特性。例如，AFM 数据可用于估计溶液中囊泡的球状大小。作为起点，我们可以计算固定囊泡膜包络所封装的体积。体积通过集成已识别的囊泡的表面水平与其下方的基板高程之间的差异来发现。囊泡下的基板水平不能直接访问，但可以通过拉普放置或替代数据点插值来估计囊泡周围的未占用基板。在Gwydion中，这种体积计算使用各种颗粒特征分布函数执行。然后，从 Gwydion 导出的结果可以映射到体积等效球体的直径中。
所述算法在AFM数据中的应用为561分析的水分MCF-7囊泡，产生了图12B所示体积等效球体的直径分布。这种分布估计膜囊泡在云母表面静电固定之前，以生物流体中的先天球状形式的大小。通过分析AFM数据分析获得的囊泡大小与同一样品的低温-TEM成像结果进行了比较，发现其接近一致3（图12B）。NTA 测量的水动力直径与获得的囊泡尺寸（图 1）的比较表明，从AFM和Cryo-TEM测定的囊泡大小来看，体外体的流动性比预期要小得多。测量。水动力和囊泡大小之间的差异是外体囊泡周围日冕层的厚度。
图1：电动汽车水动力和几何直径的比较。外体囊泡的几何尺寸大大小于其流体动力学尺寸，从它在液体中的扩散确定。区别在于由膜结合和吸附分子形成的日冕层，这些分子阻碍电动汽车的流动性。此图从引用3中修改，并经许可重印。
图 2：AFM 探头的属性。可以使用"模型提示"函数指定 AFM 探头的几何体和尺寸。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：由尖端样品卷积引起的成像伪影的校正。通过执行曲面重建，可以校正获取的 AFM 数据以进行尖端伪影。 请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：基板倾斜的修正。平面电平确定基板的平面，并从 AFM 数据中减去它。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：扫描行中不对齐的更正。对齐扫描数据的常规算法是沿每条扫描线查找平均高度，并从图像中的相应数据点行中减去结果。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6：对对齐数据中的间隙进行修正。通过应用"删除疤痕"功能，可以从 AFM 数据中删除常见的扫描错误（称为疤痕）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图7：基板在零高程下对齐。"水平"菜单中的"平展基础"选项允许用户将基板表面放置在与零高度相对应的基层。 请点击此处查看此图的较大版本。
图8：在扫描表面识别固定囊泡。（A） 表面固定外体被识别为通过用户选择的高度阈值在"阈值标记"中指定的颗粒突出在基板上方的颗粒。（B） 鉴定结果.请点击此处查看此图的较大版本。
图 9：分析 AFM 数据。在已识别的外体所占据区域内，基板上方最大高度的分布由谷物分布工具编制显示。 请点击此处查看此图的较大版本。
图10：固定囊泡表面密度的表面修饰和EV浓度的影响。（A） 用MCF-7外体样品孵育12小时后，新鲜切割的云母基质的AFM高度图像，然后用DI水清洗和干燥。在未向云母表面提供正电荷的情况下，将 EV 从液体固定到基板的效率很低。在扫描中看到的颗粒很少可能是在基板干燥之前未完全去除MCF-7样品的结果。（B） 氯化镍处理后，空气中云母表面的高度扫描显示基材无污染。面板 （C） 和 （D） 显示表面电荷和孵育后获得的 AFM 高度扫描，其与面板 （A） 相同的 MCF-7 样本分别为 24 小时和 12 小时。24小时孵育后，固定囊泡的表面浓度过高。12 h 孵育导致更少的外体体固定在表面和扫描数据更容易准确分析。 请点击此处查看此图的较大版本。
图11：水合MCF-7外体在经过修改的云母表面静电固定的AFM图像。（A） 高度图像.（B） 相应的AFM相图像确认高度图像中的颗粒是软纳米颗粒，正如膜囊泡所应预料到的。（C） 面板 （A） 中所示线所穿过的三个囊泡的高度数据，显示外体对改性云母正带表面的静电吸引导致的扁平形状。（D） 形状变形在放大视图中明显存在，固定的囊泡盒装在面板 （A） 及其横截面中。同一囊泡的相位图像显示在 （E） 中。此图从引用3中修改，并经许可重印。请点击此处查看此图的较大版本。
图12：水合囊泡在表面固定的尺寸特征，以及溶液中球状大小的估计。（A） 表面以上峰值高度的分布（红色曲线）的平均值等于 7.9 nm。固定外体所占据的区域平均直径为69.6nm（蓝色曲线）。（B） 其中一个固定外体体的AFM高度图像说明了其由静电力引起的高度倾斜形状。溶液中外体囊泡的球状尺寸可以通过匹配表面固定膜和球膜包络的体积来估计。（C） 溶液（红色曲线）中球状囊泡的大小分布是由561个固定囊泡的AFM数据确定的。低温-TEM 图像（蓝色曲线）中的囊泡大小与 AFM 结果一致。此图从引用3中修改，并经许可重印。请点击此处查看此图的较大版本。
图13：EV从蒸发液体中被动沉积期间的表面浓度和尺寸分离伪影。（A） 扫描电子显微镜 （SEM） 图像显示，当不执行悬浮生物流体的表面固定时，从干燥液体中被动沉积的外体体的表面浓度在空间上是可变的。（B） 从干燥样品中被动沉积EV会导致囊泡大小分离。大量大小变异性由由白色对角线定义的图像（A）中不同区域的囊泡概率密度函数 （pdf） 进行量化。此图从引用1中修改，并经许可重印。请点击此处查看此图的较大版本。
图14：在液体蒸发过程中，干燥囊泡的杯形几何体被动沉积在表面。已知未被静电力固定的囊泡表面干燥会导致在 EV 的 SEM 图像中经常观察到的杯形外观。此图从引用1中修改，并经许可重印。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
从生物流体、表面扫描和图像分析中固定 EV 是开发中 EV 在液体中的 AFM 表征协议的基本步骤。与图像表面积和固定在基板上的囊泡的表面浓度一起，可适应AFM成像的囊泡数量。鉴于EV和外兆体18的负zeta电位，我们提倡将EV从液体样品静态固定到AFM基板。当表面充满正电荷时，固定是有效的。在EV固定之前，可能需要向基材提供正表面电荷，如云母-一般公式KAl 2（AlSi3O10）（OH）2的分层硅酸盐矿物。新鲜切合的云母表面接近完全平坦，非常适合用AFM成像纳米粒子，但其表面电荷为负电荷，因此必须加以修改。该协议描述了对AFM基板进行正向表面变化的过程。具有代表性的结果表明，从生物流体到改性云母基板的EV固定效果明显改善。
在成像水合体囊泡时，必须尽量减少样品蒸发，因为样品蒸发会导致表面沉积伪影和对流流动，并随着时间的推移增加囊泡的液体浓度，从而导致表面浓度升高。固定的EV比预期的，特别是在长期孵化期间。专为液体样品设计的探头支架可消除或缓慢蒸发，并应用于成像水合的 EV。在离子物种存在的情况下，扫描探针的非特异性结合会减少。因此，当成像水合性EV时，最好用缓冲介质（如PBS）覆盖基板，而不是DI水。
表面固定的重要性
在改性基板上一致且可预测的 EV 固定可消除 AFM 结果中的主要变异性来源。从扫描到数据分析的所有下游步骤都可以通过仪器、探头、扫描参数以及数据分析序列和算法的选择更轻松地控制。用户应了解生物样品和 EV 隔离协议的上游变异性，这是超出本工作范围的重要问题。
我们建议从液体样品对经过修饰的云母表面执行 EV 表面固定，即使目标是在空气中描述干燥囊泡的特征 - 需求不那么明显，因为囊泡将不可避免地沉积在任何基板上，因为液体蒸发。事实上，在过去19、20、21中，已经报道了在不修改云母表面电荷的情况下获得的干燥EV的AFM结果，这是从液体中静电固定EV的先决条件步骤。.然而，当EV不从液体样品固定在表面时，蒸发产生的被动沉积会产生一种称为咖啡环效应22的伪影。在SEM图像（图13A）中说明了两种这样的伪影，它们被蒸发沉积在负电荷玻璃表面。沉淀囊泡表面浓度的显著变化立即显现出来。图13B中量化的第二个伪影是干燥样品周围不同区域的囊泡大小相当大的变异性。鉴于这些伪影，除非扫描最初由现在干燥的液体样品占据的整个表面积，否则干燥液体中被动沉积的囊泡的AFM特性可能会产生有偏差或不一致的结果。
在成像在基板上没有牢固固定囊泡的情况下获得的干燥样品时，应考虑另外两个问题。回想一下，我们的协议指示用户在囊泡从液体样品中固定后，用DI水彻底清洗表面。此步骤旨在防止离子和其他非眼溶质在具有相当渗透性的复杂生物流体蒸发期间形成表面沉积物。如果 EV 不固定，彻底洗涤会从表面分离大量囊泡，从而可能使结果偏置，并留下太少的颗粒进行分析。另一个常见的困难是，在AFM成像之前，在经过修改的云母表面固定EV，减少的是粒子附着在探针23上，以及这种现象造成的误导性伪影。
固定电动汽车表面密度控制
协议中确定的两个易于控制的因子允许用户定制经过改造的云母基板上固定EV的表面浓度：液体样品中囊泡的浓度和样品孵育的时间基材。高密度的固定囊泡，具有更长的孵育时间和液体中EV的较高浓度，增加了扫描过程中分析的囊泡数量，以及通过分析AFM得出的结论的统计能力数据。同时，表面浓度过高，如图10C所示，粒子紧密覆盖整个表面，没有基板的干涉区域，使图像分析和结果解释复杂化并可能导致由紧密间隔粒子之间的相互作用引起的扫描伪影。
电动汽车静电筛选及流体动力学流动性的影响
对固定内动EV表面浓度的透明控制是影响其因素的函数，允许用户定制实验条件以满足研究的特定需求。执行定制时，必须认识到静电表面固定是受生物流体离子强度影响的传输受限过程。
离子和带正电荷的物种浓度反其道影响表层和囊泡电荷筛选的Debye长度。超过此长度，静电能可以忽略不计。基材静电吸引力的边界层在富电的PBS中将比DI水小得多。这种差异意味着，经过短的孵育，与消耗静电吸引力的液体层所需的时间相对应，从DI水中悬浮液中固定的EV的表面密度将高于PBS悬浮，假设EV的浓度在两种液体中是相同的。换一种不同，更多的囊泡必须固定，以耗尽在DI水中比在PBS在否则相同的条件更厚的吸引力层。
从边界层耗尽囊泡后，固定性成为完全受传输限制的过程。在此制度下，只要粘度相同，运输完全扩散，沉积速率就不取决于悬浮介质（例如DI水或PBS）。然而，囊泡到景点边界层的运输可能并不完全具有扩散性。例如，如果 AFM 基板上的液滴中的样品在孵育过程中部分蒸发，则跌落内的流体将受到蒸发驱动的流动的影响，并且囊泡向基板的传输将同时具有，扩散和对流贡献。当蒸发不能得到充分控制时，对流迁移的贡献将相当大，固定率将高于预期。对流传输的影响会随着吸引层的厚度而变化，而吸引层本身取决于液体的离子含量。此外，蒸发通过将EV集中在溶液中，增强基底上的囊泡固定性。在EV浓度较高时，吸引层和相邻液体之间的浓度梯度将增加，从而形成更大的热力学驱动力，使囊泡向基板迁移。
固定囊泡可能代表有偏置的液体样品。在固定率受扩散限制的情况下，由囊泡大小和周围日冕层厚度的组合决定的具有较小水动力尺寸的囊泡更有可能进入吸引力层，因为它们的流动性更高。因此，在初始耗尽期之后，与液体样品中对EV总体的贡献相比，流体动力学的小型EV在基板上的代表性将过高。请注意，由于冠状3的厚度异质性，较小的流体动力学尺寸不会自动指向具有较小囊泡尺寸的EV。由于长期孵育，通过在基材上的固定，使液体中的全部EV消耗殆强，从而避免了偏置的表示。当用户旨在固定所有EV从生物流体，以避免过度密集的覆盖表面与固定的囊泡，可能有必要降低液体中的EV浓度低于协议建议的范围。
基板上的EV变形
细胞外囊泡在其原生水合状态和干燥后可以由AFM，如协议中所述。在云母表面上固定 EV 的静电24也从存在于溶液中的球状几何形状扭曲其形状。干燥对固定内动EV的大小和形态的影响可以通过在样品干燥前后重新扫描相同的表面积来分析。
研究样品制备对干燥EV形状的影响是很有启发性的。静电固定EV在干燥后保持高倾斜几何形状，但干燥进一步变平。干燥囊泡表面上方的高度比图12A中要小得多，而其足迹面积增加（未显示数据）。另一方面，当囊泡在液体蒸发过程中被动沉积，且表面没有事先固定，它们往往在干燥时达到杯形几何形状，正如在 SEM 图像中以及最近 AFM 中观察到的一样扫描。此杯状形状现已被确认为样品制备伪影25，其原因是表面干燥过程中毛细管力不均匀，如图141中的机械解释。
AFM数据的图像分析和解释
对静电和毛细管力的反应扭曲了EV的形状，提供了关于电动汽车结构和成分特性的宝贵信息。例如，最近使用一组多维的生物物理特性，如从AFM数据中提取的变形大小和形状，来证明区分由不同宿主细胞分泌的外泌体5的可行性。也可以考虑和补偿扭曲。例如，我们展示了如何使用 AFM 数据通过估计封装与固定外显物3相同体积的球体直径来描述溶液中囊泡球体的大小。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢国家科学基金会（奖励号IGERT-0903715）、犹他大学（化学工程系种子赠款和研究生研究奖学金）和斯科尔科沃科学研究所的财政支持。与技术（科技奖学金）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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