Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Summary

Zur etikettenfreien Immobilisierung von Exosomen und extrazellulären Vesikeln aus flüssigen Proben und deren Bildgebung mittels Atomkraftmikroskopie (AFM) wird ein Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben. Die AFM-Bilder werden verwendet, um die Größe der Vesikel in der Lösung zu schätzen und andere biophysikalische Eigenschaften zu charakterisieren.

Abstract

Exosomen und andere extrazelluläre Vesikel (EVs) sind molekulare Komplexe, die aus einem Lipidmembranvesikel, seiner Oberflächendekoration durch Membranproteine und anderen Molekülen und einem vielfältigen Luminalgehalt bestehen, der von einer übergeordneten Zelle geerbt wird, zu der RNAs, Proteine und DNAs. Die Charakterisierung der hydrodynamischen Größen von Elektrofahrzeugen, die von der Größe des Vesikels und seiner durch Oberflächendekorationen gebildeten koronalen Schicht abhängt, ist zur Routine geworden. Bei Exosomen, dem kleinsten EVs, ist der relative Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße signifikant. Die Charakterisierung von Vesikelgrößen durch die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM), eine Goldstandard-Technik, bleibt aufgrund der Kosten des Instruments, des für die Probenvorbereitung, Bildgebung und Datenanalyse und eine kleine Anzahl von Partikeln, die häufig in Bildern beobachtet werden. Eine weit verbreitete und zugängliche Alternative ist die Atomkraftmikroskopie (AFM), die vielseitige Daten über dreidimensionale Geometrie, Größe und andere biophysikalische Eigenschaften extrazellulärer Vesikel erzeugen kann. Das entwickelte Protokoll führt die Anwender bei der Nutzung dieses Analysetools und skizziert den Workflow für die Analyse von Elektrofahrzeugen durch den AFM, der die Probenvorbereitung für bildgebende Elektrofahrzeuge in hydratisierter oder ausgetrockneter Form, die elektrostatische Immobilisierung von Vesikel auf einem Substrat, Datenerfassung, deren Analyse und Interpretation. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Fixierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vorhersagbar und anpassbar ist und es dem Benutzer ermöglicht, Größenergebnisse für eine große Anzahl von Vesikeln zu erhalten. Die Vesikelgröße auf Basis der AFM-Daten stellte sich heraus, dass sie mit der Kryo-TEM-Bildgebung übereinstimmt.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind in allen Körperflüssigkeiten vorhanden, einschließlich Blut, Urin, Speichel, Milch und der Fruchtwasser. Exosomen bilden eine Bezirksklasse von Elektrofahrzeugen, die sich durch endosomale Biogenese, die Marker des endosomalen Weges und die kleinste Größe unter allen Elektrofahrzeugen von anderen Elektrofahrzeugen unterscheiden. Die Größe der Exosomen wird oft mit erheblichen Schwankungen zwischen den Studien berichtet. Die Größenergebnisse waren methodisch abhängig, was den Unterschied in den physikalischen Prinzipien widerspiegelt, die von verschiedenen Analysetechniken zur Schätzung der EV-Größen^1,2verwendet werden. Beispielsweise schätzt die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) – die am weitesten verbreitete Größencharakterisierungstechnik – die Größe von Elektrofahrzeugen als ihre hydrodynamischen Durchmesser, die den Widerstand gegen die Brownsche Mobilität von Elektrofahrzeugen in der Lösung charakterisieren. Ein größerer hydrodynamischer Durchmesser eines Vesikels impliziert seine geringere Beweglichkeit in Flüssigkeit. Die koronale Schicht um Vesikel, bestehend aus Oberflächenproteinen und anderen Molekülen, die an der Membranoberfläche verankert oder adsorbiert werden, behindert die Beweglichkeit erheblich und erhöht die hydrodynamische Größe von Elektrofahrzeugen. Relativ gesehen ist dieser Anstieg besonders groß für die Exosomen³, wie in Abbildung 1dargestellt.

Die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) ist eine definitive Technik zur Charakterisierung von Vesikelgrößen und Morphologie in ihren hydratisierten Zuständen. Die hohen Kosten der Instrumentierung und das für ihre korrekte Verwendung erforderliche Fachwissen motivieren jedoch die Erforschung alternativer Techniken, die hydratisierte Elektrofahrzeuge abbilden können. Eine relativ kleine Anzahl von EVs, die in den erfassten Kryo-TEM-Bildern beobachtet oder charakterisiert werden, ist ein weiterer bemerkenswerter Nachteil dieser Technik.

Die Atomkraftmikroskopie (AFM) visualisiert die dreidimensionale Topographie hydratisierter oder ausgetrockneter Elektrofahrzeuge^4,5,6, indem eine Sonde über das Substrat gescannt wird, um das Bild der Partikel auf der Oberfläche zu rastern. Die wesentlichen Schritte des Protokolls zur Charakterisierung von Elektrofahrzeugen durch AFM werden in dieser Studie beschrieben. Bevor die Vesikel in Flüssigkeit abgeglichen werden, müssen sie auf einem Substrat immobilisiert werden, indem sie entweder an eine funktionalisierte Oberfläche binden, in einem Filter einfangen oder durch elektrostatische Anziehung⁷. Die elektrostatische Fixierung auf einem positiv geladenen Substrat ist eine besonders praktische Option zur Immobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat. Die gleichen elektrostatischen Kräfte, die die extrazellulären Vesikel auf der Oberfläche immobilisieren, verzerren jedoch auch ihre Form, was eine post-imaging-Datenanalyse unerlässlich macht. Wir erarbeiten diesen Punkt, indem wir den Algorithmus beschreiben, der die Größe der Kugelbläschen in der Lösung auf der Grundlage der AFM-Daten über die verzerrte Form der auf der Oberfläche immobilisierten Exosomen schätzt.

Im entwickelten Protokoll wird das Verfahren zur robusten elektrostatischen Immobilisierung von Vesikeln vorgestellt und mit den Schritten verfolgt, die für die Durchführung der Atomkraft-Bildgebung in den hydratisierten oder ausgetrockneten Zuständen erforderlich sind. Die Faktoren, die die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Vesikel beeinflussen, werden identifiziert. Es wird die Anleitung gegeben, wie die elektrostatische Immobilisierung für Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen von Elektrofahrzeugen in der Lösung durchgeführt werden kann. Diskutiert wird die Auswahl von Versuchsbedingungen, die die Schätzung empirischer Wahrscheinlichkeitsverteilungen verschiedener biophysikalischer Eigenschaften auf der Grundlage einer ausreichend großen Anzahl von immobilisierten Vesikeln ermöglichen. Beispiele für die nach-Imaging-Analyse der AFM-Daten werden angeführt. Insbesondere wird ein Algorithmus zur Bestimmung der Größe von Vesikeln in der Lösung beschrieben, basierend auf der AFM-Charakterisierung von immobilisierten Elektrofahrzeugen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Konsistenz der Vesikelgröße durch AFM mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung.

Protocol

1. Isolierung von Elektrofahrzeugen aus einem Biofluid

1. Isolieren Sie Elektrofahrzeuge nach einer der etablierten Methoden, z. B. der Differenz-Ultrazentrifugation⁸, Derfällung oder Größenausschlusschromatographie⁹.
2. Bestätigen Sie das Vorhandensein von erwarteten Oberflächen- und Luminal-Biomarkern und das Fehlen von Biomarkern, die auf eine Kreuzkontamination der Zubereitung hinweisen. Bestätigen Sie die Lipid-Bilayer-Morphologie der isolierten Teilchen durch Elektronenmikroskopie.
   HINWEIS: Bei der Isolierung der Exosomen sollte die hydrodynamische Größenverteilung, die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) oder dynamische Lichtstreuung gemessen wird, im erwarteten Bereich liegen. Die Details der Ev- und Exosomenisolierung gehen über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Die gewählte Methode hängt von experimentellen Fragen und dem Ziel der Studie¹⁰ab. Die folgenden Schritte liefern eine konkrete Darstellung des Verfahrens zur Anreicherung der Exosomen durch Niederschlag aus dem Wachstumsmedium von MCF-7 Brustkrebszellen mit einem handelsüblichen Niederschlagssatz (Materialtabelle).
3. Vor der Zellkulturexpansion, speichern MCF-7 Brustkrebszellen in flüssigem Stickstoff. Tauen Sie Zellen in Subkultur.
4. Führen Sie nach aseptischen Übungen die Zellbeschichtung auf 150 mm Platten durch. Verwenden Sie das Wachstumsmedium, das aus dem minimalen essentiellen MediumdesAdlers, 0,01 mg/ml humanem rekombinantem Insulin und 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum besteht.
5. Belüften Sie die Kultur um 95% Luft und 5%_CO2 und brüten bei 37 °C.
6. Nachdem die Zellen sesshaft (ca. 24 h nach der Beschichtung) abgerechnet wurden, ändern Sie das Medium. Teilen Sie die Platte bei 1:10 Verhältnis und Kultur zehn Platten, die jeweils 20 ml Medien enthalten.
7. Ernte- und Poolmedien von 9 dieser Platten (180 ml) bei einem Zusammenfluss von 70bis80 %, wenn sich die Zellen noch in der Wachstumsphase befinden.
8. Teilen Sie die Medien in 60 ml und 120 ml auf, weiter aufgeteilt in 30 ml/Rohr und Zentrifuge bei 3.000 x g für 15 min.
9. Übertragen Sie den Überstand von jedem Rohr auf ein neues steriles 50 ml Rohr und führen Sie die exosome Isolierung durch.
10. Isolieren Sie Exosomen durch Niederschlag gemäß veröffentlichten Protokollen (siehe z. B. Referenz¹¹) oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, wenn einkommerzielles Isolationskit(Tabelle der Materialien) verwendet wird. Als ersten Schritt im letzteren Fall, Zentrifugenzellmedium bei 3.000 x g für 15 min. Rückzug Überstand und Entsorgen von Zellen und Zellablagerungen.
11. Fügen Sie die Niederschlagslösung (1:5 Volumenverhältnis) dem Überstand hinzu, mischen und über Nacht kühlen.
12. Zentrifuge bei 1.500 x g für 30 min bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation.
13. Drehen Sie das verbleibende Exosomepellet für weitere 5 min bei 1.500 x g. Ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie die verbleibende Niederschlagslösung durch Aspiration.
14. Setzen Sie das Pellet in 100x500 l 1x Phosphat-gepufferter Salzsäurepuffer (PBS) aus und teilen Sie es bei Bedarf für die nachgeschaltete Analyse in mehrere Aliquots auf.
15. Gehen Sie sofort zur Oberflächenimmobilisierung der isolierten Exosomen für die AFM-Bildgebung über. Falls erforderlich, frieren Sie die Aliquots bei -80 °Cfür die spätere Verwendung ein, während Sie Vorsichtsmaßnahmen treffen, um Schäden an der Probe während des Frost-Tau-Zyklus zu vermeiden.

2. Oberflächenfixierung von extrazellulären Vesikeln

1. Verwenden Sie starkes doppelseitiges Klebeband, Epoxid oder einen alternativen Klebstoff, um eine Glimmerscheibe fest an einem AFM/Scanning Tunneling Microscope (STM) magnetischer Edelstahl-Probenscheibe zu befestigen.
2. Cleave Glimmerscheibe mit einem scharfen Rasiermesser oder Gebrauchsmesser, oder durch Befestigen eines Klebebandes an der Oberseite und dann Pealing es aus, um eine Schicht von Material zu entfernen.
   HINWEIS: Beide Methoden sollten eine unberührte Oberfläche offenbaren, indem eine dünne Schicht Glimmer entfernt wird, die zuvor der Umgebung ausgesetzt war. Nach dem Eingriff muss die Befestigung von Glimmer an der AFM/STM-Metallprobenscheibe fest bleiben.
3. Bei Raumtemperatur die Oberfläche des Glimmers für 10 s mit 100 l von 10 mM NiCl₂ Lösung behandeln, die die Oberflächenladung von negativ in positiv ändert.
4. Blot NiCl₂ Lösung mit einem fusselfreien Wisch- oder Blotting-Papier. Waschen Sie die Glimmeroberfläche 3x mit entionisiertem (DI) Wasser und trocknen Sie sie mit einem Strom trockenen Stickstoffs.
   HINWEIS: Es ist eine gute Praxis, die modifizierte Oberfläche mit AFM zu scannen, um zu bestätigen, dass sie frei von Verunreinigungen ist.
5. Legen Sie die AFM-Probenscheibe mit dem angehängten oberflächenmodifizierten Glimmer in eine Petrischale.
6. Verdünnen Sie die Exosomenprobe aus Schritt 1.14 mit 1x PBS, um eine Konzentration zwischen 4,0 x 10⁹ und 4,0 x 10¹⁰ Partikel pro ml Lösung zu erhalten. Validieren Sie die verdünnte Partikelkonzentration mit NTA.
7. Bilden Sie einen sessilen Tropfen auf der Oberfläche des Glimmers, indem Sie 100 l der verdünnten Exosomenlösung aus einer Pipette entleeren.
8. Deckel auf die Petrischale legen und mit einem Paraffinfilm versiegeln, um die Probenverdunstung zu reduzieren. Inkubieren Sie die Probe für 12x18 h bei 4 °C.
   HINWEIS: Die Oberflächendichte der immobilisierten Exosomen wird mit der Inkubationszeit und der Konzentration von Elektrofahrzeugen in der Flüssigkeit zunehmen. Eine längere Inkubationszeit kann erforderlich sein, wenn Exosomen in der Probe in niedrigeren Konzentrationen vorhanden sind.
9. Nach der Inkubation 80bis90 % der Probe aspirieren, ohne die Oberfläche zu stören. An dieser Stelle werden die Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf dem Glimmersubstrat.
10. Vor der Abbildung hydratisierter Elektrofahrzeuge spülen Sie die Oberfläche mit 1x PBS ab. Wiederholen Sie 3x. Achten Sie darauf, die Probe während des Spülvorgangs hydratisiert zu halten.
11. Nach dem Waschen der Glimmeroberfläche mit 1x PBS, entfernen Sie 80%90%der Flüssigkeit, und Pipette 40 l frische 1x PBS, um die Probe zu bedecken.
12. Bei der Abbildung der ausgetrockneten Elektrofahrzeuge spülen Sie das Substrat mit DI-Wasser ab. Wiederholen Sie 3x.
    HINWEIS: Das Spülen mit DI-Wasser verhindert die Bildung von Salzkristallen und die Ablagerung von Gelösten auf der Oberfläche, wenn das Substrat trocknet.
13. Vor der Abbildung ausgetrocknete Elektrofahrzeuge, aspirieren Sie so viel Flüssigkeit wie möglich, ohne die Oberfläche zu berühren und trocknen Sie den Rest mit einem Strom von trockenem Stickstoff.

3. AFM-Bildgebung

1. Um die ausgetrockneten Elektrofahrzeuge abzubilden, wählen Sie einen Freischwinger aus, der für das Scannen in der Luft in abstichenden und berührungslosen Bildgebungsmodi entwickelt wurde, und montieren Sie ihn auf den Sondenhalter.
   ANMERKUNG: Die Merkmale eines Beispielauslegers, der in der Stofftabelle aufgeführt ist (123 m Länge, 40 m Breite, 7 nm Spitzenradius und 37 N/m Federkonstante), können als Richtschnur bei der Auswahl einer Sonde verwendet werden, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist.
   1. Platzieren Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.13 auf der AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die Probe auf der Bühne immobilisieren. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die Bühne, um thermisch auszueinemt.
   2. Verwenden Sie den Tippmodus, um eine ausreichendgroße Fläche der Glimmeroberfläche zu scannen. Wählen Sie z. B. eine Fläche von 5 x 5 m aus, gerastert in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 1 Hz. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder, da sie ergänzende Informationen über die Topographie und die Oberflächeneigenschaften der Probe liefern.
      HINWEIS: Die Scanzeit wird mit dem abgebildeten Bereich und der Anzahl der Linien, die für die Bildbildung ausgewählt wurden, erhöht, verringert sich jedoch mit der Scanrate, die als Anzahl der pro Sekunde gescannten Zeilen definiert ist. Schnelle Scanraten können sich auf die Bildqualität auswirken. Daher sollte die Geschwindigkeit des Rasterns den Kompromiss zwischen der Erfassungszeit und der Bildqualität juristisch ausgleichen.
2. Um hydratisierte Vesikel abzubilden, wählen Sie einen Ausleger aus, der zum Scannen weicher, hydratisierter Proben geeignet ist, und montieren Sie den Ausleger auf einen Sondenhalter, der für das Scannen in Flüssigkeiten entwickelt wurde.
   ANMERKUNG: Bei der Auswahl einer Sonde, die mit der verfügbaren AFM-Instrumentierung kompatibel ist, werden die Spezifikationen der Sonde in der Tabelle der Werkstoffe aufgeführt (dreieckiger Ausleger mit 175 m Nennlänge, 22 m Breite, 20 nm Spitzenradius, 0,07 N/m Federkonstante und optimiert für die Bildgebung mit der Antriebsfrequenz im Bereich zwischen 4 und 8 kHz) kann als Leitfaden verwendet werden.
   1. Befeuchten Sie die Spitze des Auslegers mit 1x PBS, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass Luftblasen während des Scannens in die Flüssigkeit eingeführt werden.
   2. Stellen Sie die Vorbereitung ab Schritt 2.11 auf die AFM-Bühne. Die magnetische Edelstahl-Probenscheibe wird die befestigte Glimmer mit immobilisierten Elektrofahrzeugen auf ihrer Oberfläche immobilisieren.
   3. Geben Sie Zeit für die Vorbereitung und die AFM-Stufe, um thermisch auszueinem.
   4. Stellen Sie die hydratisierte Glimmeroberfläche im Abstichmodus ab. Erfassen Sie sowohl die Höhen- als auch die Phasenbilder.
      HINWEIS: Die Bildqualität wird durch die Instrumentierung, die ausgewählten Sonden- und Scanparameter beeinflusst. Bei der Optimierung der Scan-Bedingungen können die folgenden Optionen als Ausgangspunkt verwendet werden: 5 x 5 m Fläche, die in 512 Zeilen mit einer Scanrate von 0,8-1,0 Hz und einer Laufwerksfrequenz zwischen 4 und 8 kHz gescannt wird.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Die folgenden Datenverarbeitungs- und Analyseschritte werden auf die erfassten Höhenbilder angewendet. Ein ähnliches Verfahren kann angepasst werden, um die Phasendaten zu analysieren. Die folgende Beschreibung ist spezifisch für Gwyddion¹², eine kostenlose und Open-Source-Software, die unter GNU General Public License verfügbar ist. Ähnliche Funktionen sind in alternativen Software-Tools verfügbar.

1. Gehen Sie zu Datenprozess, SPM-Modi, Tipp und wählen Sie Modelltipp (Abbildung 2). Wählen Sie die Geometrie und die Bemaßungen der Spitze aus, mit der das Beispiel scannt, und klicken Sie auf OK.
2. Korrigieren Sie die Spitzenerosionsartefakte, indem Sie die Oberflächenrekonstruktion durchführen. Öffnen Sie das Bild. Wählen Sie im Menü Datenprozess, SPM-Modi, Tipp, dann wählen Sie Oberflächenrekonstruktion und klicken Sie auf OK (Abbildung 3).
3. Richten Sie die Bildebene an die XY-Ebene des Labors aus, indem Sie die Neigung im Substrat aus den Scandaten entfernen. Um diese Aufgabe zu erfüllen, wählen Sie Datenprozess, Ebene und Ebene Ebene (Abbildung 4).
4. Richten Sie Die Zeilen des Bildes aus, indem Sie Data Process, Correct Data and then choose Align Rows auswählen. Es stehen mehrere Ausrichtungsoptionen zur Verfügung (Abbildung 5). Median ist z. B. ein Algorithmus, der eine durchschnittliche Höhe jeder Scanzeile findet und von den Daten subtrahiert.
5. Wechseln Sie zu Datenprozess, Korrigieren von Daten und wählen Sie Narben entfernen (Abbildung 6), wodurch häufige Scanfehler entfernt werden, die als Narben bezeichnet werden.
6. Richten Sie die Glimmeroberfläche auf der Nullhöhe, Z = 0, aus, indem Sie im Dropdown-Menü Ebene abflachen, auf das sie über den Datenprozess zugreifen kann (Abbildung 7).
7. Identifizieren Sie EVs auf der gescannten Oberfläche mithilfe des Dropdown-Menüs Markierung nach Schwellenwert im Dropdown-Menü Körner (Abbildung 8A). Dieser Algorithmus identifiziert oberflächenimmobilisierte Exosomen als Partikel, die aus dem Null-Oberflächen-Substrat durch die Höhe über dem vom Benutzer gewählten Schwellenwert herausragen. Wählen Sie einen Schwellenwert im Bereich zwischen 1 und 3 nm aus, wodurch die meisten Hintergrundinterferenzen eliminiert werden. Kleinere Schwellenwerte werden mit saubererem Hintergrund verwendet.
   HINWEIS: Der Schwellenwert in Abbildung 8A beträgt 1.767 nm. Das Ergebnis der MCF-7-Exosomenidentifikation mit dieser Schwelle ist in Abbildung 8Bdargestellt. Gwyddion bietet mehrere Alternativen zum Schwellenwert als Algorithmus zur automatischen Identifizierung von Vesikel nakelten Im bilden, einschließlich automatisierter Schwellenwerte (Otsu-Methode), Kantenerkennung und dem Wendepunktalgorithmus.
   HINWEIS: Partikelagglomerate, sofern sie im AFM-Bild vorhanden sind, können maskiert und von der Analyse ausgeschlossen werden.
8. Führen Sie die geometrische und dimensionale Charakterisierung der identifizierten Elektrofahrzeuge mithilfe der verfügbaren Verteilungsalgorithmen durch, auf die über das Menü Körner zugegriffen werden kann.
   HINWEIS: Gwyddion bietet Werkzeuge zur Bewertung der Verteilung von skalaren, arealen, volumetrischen und anderen Eigenschaften von immobilisierten Elektrofahrzeugen in einem hydratisierten oder dessikierten Zustand. Ein Beispiel für eine Skalarwerteigenschaft ist in Abbildung 9dargestellt, die die Verteilung der maximalen Höhen innerhalb des Footprints jedes identifizierten Exosomens angibt.
9. Exportieren Sie die AFM-Daten aus Gwyddion für eine spezielle Analyse durch andere Rechenwerkzeuge und benutzerdefinierte Computerprogramme.

Representative Results

Die Oberflächenfixierung von Elektrofahrzeugen ist ein wichtiger Schritt in der Bildsequenz. Die elektrostatische Oberflächenimmobilisierung von Exosomen, von der bekannt ist, dass sie ein negatives Zeta-Potenzial hat, wird robust auftreten, nachdem das Substrat des Glimmers modifiziert wurde, um eine positive Oberflächenladung zu haben. Ohne die Behandlung mit NiCl_2, um positive Oberflächenveränderungen zu vermitteln, erwies sich die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf dem Substrat als unwirksam. Das Höhenbild in Abbildung 10A, das in der Luft aufgenommen wurde, nachdem die MCF-7-Exosomenprobe mit 2,59 x 10¹⁰ Bläder pro ml PBS für 12 h auf der unveränderten Oberfläche von frisch gespaltetem Glimmer inkubiert wurde, zeigt nur noch sehr wenige Vesikel auf dem nach der Reinigung mit DI-Wasser. Die in Abbildung 10A sichtbaren Vesikel sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer unvollständigen Aspiration von DI-Wasser, das die Nichtanhänge von Vesikeln an der Oberfläche resuspended und sie dann beim Verdampfen auf dem Substrat absetzte.

Nach der Änderung der Oberflächenladung mit Nickelchlorid ist es ratsam zu bestätigen, dass die Oberfläche nach der Behandlung frei von Verunreinigungen bleibt. Das Höhenbild in Abbildung 10B (in der Luft erhalten) gibt ein Beispiel für eine saubere Oberfläche, nachdem sie mit NiCl₂ behandelt und dann dreimal mit DI-Wasser gewaschen wurde. Die Rauheit der kationenvermittelten Oberfläche lag unter 0,3 nm, was mit dem vorherigen Bericht¹³übereinstimmt.

Die dramatischen positiven Auswirkungen der Oberflächenladungsmodifikation auf die Effizienz der Fixierung von MCF-7-Exosomen werden durch Abbildung 10C,Dveranschaulicht. Diese beiden Panels zeigen die Höhenscans, die in der Luft erfasst wurden, nachdem die Probe, die zuvor in Abbildung 10Aabgebildet war, für 24 h bzw. 12 h auf der mit Nickelchlorid behandelten Oberfläche inkubiert wurde.

Die Zeit, zu der eine bestimmte Probe auf der behandelten Oberfläche inkubiert wird, bestimmt die Oberflächenkonzentration (Vesikel pro Fläche) der immobilisierten Elektrofahrzeuge. Das Höhenbild in Abbildung 10C veranschaulicht den Fall einer übermäßig dichten Oberflächenabdeckung durch die Bewegungsvesiken, die nach der Inkubation der beschriebenen MCF-7-Exosomenprobe für 24 h erhalten wurden. Eine Reihe von Algorithmen verlassen sich darauf, dass sie über genügend unbesetztes Substrat zwischen den Körnern verfügen, um Bildkorrekturen und Datenanalysen durchzuführen. Zum Beispiel, Nivellierung und Verschiebung des Substrats auf die Nullebene, Linienkorrektur, und Schätzung des Volumens der Körner benötigen die dazwischen liegende flache Oberfläche, um genaue Berechnungen durchzuführen. Wenn die Konzentration der immobilisierten Vesikel so hoch ist wie in Abbildung 10C, funktionieren diese Algorithmen nicht zuverlässig. Ein Beispiel für eine ausreichende Oberflächenkonzentration von Vesikeln, die aus derselben MCF-7-Probe immobilisiert wurden, ist im Höhenbild in Abbildung 10Ddargestellt, das nach einer kürzeren (12 h) Inkubation erhalten wurde.
 
Die Nachbearbeitung der erfassten Roh-AFM-Daten ist erforderlich, um häufige Scanfehler zu korrigieren. Die folgende Beschreibung ist spezifisch für Gwyddion. Ähnliche Funktionen sind in anderen AFM/SPM-Datenanalysetools verfügbar.

Innerhalb von Gwyddion wird die Plane Level-Funktion verwendet, um eine Neigung im Substrat zu korrigieren. Eine solche Hintergrundkorrektur wird erreicht, indem zuerst die Ebene des Substrats unter Verwendung aller Datenpunkte im Bild gefunden und dann von den Rohdaten subtrahiert wird. Die Korrektur entlang der Scanlinien erfolgt über die Funktion Zeilen ausrichten. Beispielsweise führt einer der implementierten Algorithmen die Ausrichtung aus, indem er die mittlere Höhe jeder Scanzeile berechnet und dann das Ergebnis von der entsprechenden Zeile der Bilddaten subtrahiert. Der Beitrag der lokalen Fehler in der Rückkopplungsschleife kann durch die Anwendung der Funktion "Scars entfernen" entfernt werden, die die Lücken in den ausgerichteten Daten füllt und die Narben durch den Vergleich der Daten in den angrenzenden Scanlinien eliminiert. Die Verschiebung des Substrats auf die Höhe Z = 0 kann durch eine Kombination aus einer Facette und polynomiader Nivellierung der Oberfläche nach dem Maskieren von Körnern und anderen Merkmalen erreicht werden. Das Tool Flatten Base von Gwyddion führt diese Aufgabe autonom oder mit einer benutzerdefinierten Maske aus. Nach den beschriebenen Hintergrund- und Linienkorrekturen können die elektrostatisch fixierten Vesikel auf dem Substrat durch Ausführen der Mark Grains-Funktion identifiziert werden.

Abbildung 11A und Abbildung 11B zeigen Höhen- und Phasenbilder von hydratisierten MCF-7-Exosomen, die auf einer Glimmeroberfläche immobilisiert und in PBS mit dem Abstichmodus aufgenommen wurden. Insgesamt wurden 561 hydratisierte Vesikel im gescannten Bereich mit dem Schwellenwertalgorithmus der Mark Grains-Funktion identifiziert, wobei der Schwellenwert auf 20 % festgelegt wurde. Die Phasenverzögerung des Ansprechs der Sonde bei der Antriebsfrequenz ist empfindlich gegenüber lokalisierten Steifigkeitsschwankungen in weichen Proben. Die Konsistenz zwischen den Höhen- und Phasenbildern, die in Abbildung 11A,Bzu sehen sind, ist daher eine wichtige Bestätigung dafür, dass die abgebildeten Körner tatsächlich weiche Vesikel auf dem Substrat immobilisiert sind.
 
Abbildung 11C zeigt den Querschnitt des Höhenbildes durch Exosomen, die sich auf der weißen Linie in Abbildung 11Abefinden. Während die Exosomen in einem Biofluid eine Kugelgeometrie^{haben 1,14,15,16}, wird ihre Form auf dem Substrat durch die elektrostatische Anziehung auf die positiv geladene oberfläche. Die oblate Pfannkuchen-ähnliche Geometrie elektrostatisch immobilisierter Vesikel wird in Abbildung 11D durch das Nahaufnahmehöhenbild (und seinen Querschnitt) eines in Abbildung 11Averpackten Exosomens weiter veranschaulicht. Das entsprechende Phasenbild ist in Abbildung 11Edargestellt. Die empirische Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (pdf) der Spitzenhöhen über der Oberfläche für alle 561 hydratisierten Vesikel, die im AFM-Scan identifiziert wurden, ist in Abbildung 12Adargestellt. Der Mittelwert für diese Verteilung beträgt 7,9 nm, was bei fehlender Verformungskräften etwa der doppelten Dicke einer Phospholipid-Doppelschicht¹⁷ entspricht.
 
Die Fläche auf dem Substrat, die von einem immobilisierten Exosom belegt wird, wurde als Kreis mit dem Durchmesser angenähert, der dem mittleren Abstand vom "Massenzentrum" des Vesikels bis zu seiner Grenze auf der Oberfläche des Glimmers entspricht. Die Verteilung dieser Projektionsdurchmesser ist in Abbildung 12A dargestellt und hat einen Mittelwert von 69,6 nm. Die erhaltene Höhe und die Durchmesserverteilungen quantifizieren die signifikanten Auswirkungen der elektrostatischen Oberflächenimmobilisierung auf die verzerrte Form von immobilisierten Exosomen weiter.
 
Die Robustheit und Wiederholbarkeit der Protokollverfahren wurde durch die dreimale Analyse derselben MCF-7-Probe bestätigt, von der Probenvorbereitung bis zur Bildgebung, wobei jede Wiederholung statistisch den in Abbildung 12dargestellten Ergebnissen entspricht.

Die Verformung von immobilisierten Vesikeln, die durch elektrostatische Kräfte verursacht werden, kann kompensiert oder interpretiert werden, um einen Einblick in die Eigenschaften der abgebildeten Elektrofahrzeuge zu geben. Beispielsweise können die AFM-Daten verwendet werden, um die Kugelgröße der Vesikel in der Lösung zu schätzen. Als Ausgangspunkt können wir das Volumen berechnen, das durch die Membranhüllen von immobilisierten Vesikeln gekapselt wird. Das Volumen wird durch die Integration der Differenz zwischen der Oberflächenebene der identifizierten Vesikel und der Substrathöhe darunter gefunden. Der Substratgehalt unter den Vesikeln ist nicht direkt zugänglich, kann aber durch die Laplace oder alternative Interpolation von Datenpunkten für unbesetztes Substrat um die Vesikel geschätzt werden. Innerhalb von Gwyddion wird eine solche Volumenberechnung mit der Funktion Verteilung verschiedener Korneigenschaften durchgeführt. Das aus Gwyddion exportierte Ergebnis kann dann den Durchmessern volumenäquivalenter Kugeln zugeordnet werden.

Die Anwendung des beschriebenen Algorithmus auf die AFM-Daten für 561 analysierte hydratisierte MCF-7-Vesikel ergab die Verteilung der Durchmesser volumenäquivalenter Kugeln, die in Abbildung 12Bdargestellt sind. Diese Verteilung schätzt die Größe der Membranbläschen in ihrer angeborenen Kugelform in einem Biofluid vor ihrer elektrostatischen Fixierung auf der Glimmeroberfläche. Die aus der Analyse der AFM-Daten gewonnene Vesikelgröße wurde mit den Ergebnissen der Kryo-TEM-Bildgebung derselben Probe verglichen und war in enger Übereinstimmung^{mit 3} (Abbildung 12B). Der Vergleich der von der NTA gemessenen hydrodynamischen Durchmesser mit den erhaltenen Vesikelgrößen (Abbildung 1) zeigt, dass die Mobilität von Exosomen viel geringer ist, als von der Größe ihrer vesikeln, die aus dem AFM und kryo-TEM bestimmt werden, zu erwarten wäre. Messungen. Der Unterschied zwischen der hydrodynamischen und der Vesikelgröße charakterisiert die Dicke der koronalen Schicht, die exosomale Vesikel umgibt.

Abbildung 1: Vergleich der hydrodynamischen und geometrischen Durchmesser von Elektrofahrzeugen. Die geometrische Größe des exosomalen Vesikels ist wesentlich kleiner als seine hydrodynamische Größe, die durch seine Diffusion in einer Flüssigkeit bestimmt wird. Der Unterschied ist die koronale Schicht, die durch membrankonjugierte und adsorbierte Moleküle gebildet wird, die die Mobilität von Elektrofahrzeugen behindern. Diese Abbildung wird von Referenz³ geändert und mit Genehmigung neu gedruckt.

Abbildung 2: Eigenschaften der AFM-Sonde. Die Geometrie und die Abmessungen der AFM-Sonde können mit der Modellspitze-Funktion angegeben werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Korrektur des bildgebenden Artefakts, das durch die Faltung der Spitze der Probe verursacht wird. Durch die Oberflächenrekonstruktionkönnen die erfassten AFM-Daten für Spitzenartefakte korrigiert werden.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Korrektur für eine Neigung im Substrat. Ebenenebene bestimmt die Ebene des Substrats und subtrahiert es von den AFM-Daten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Korrektur von Fehlausrichtungen in Scanzeilen. Ein herkömmlicher Algorithmus zum Ausrichten der Scandaten besteht darin, entlang jeder Scanlinie eine durchschnittliche Höhe zu finden und das Ergebnis von der entsprechenden Reihe von Datenpunkten im Bild zu subtrahieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Korrektur der Lücken in den ausgerichteten Daten. Häufige Scanfehler, so genannte Narben, können aus den AFM-Daten entfernt werden, indem die Funktion Narben entfernen angewendet wird.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Ausrichtung eines Substrats in Nullhöhe. Die Option Basis im Menü Ebene abflachen ermöglicht es dem Benutzer, die Substratoberfläche auf der Basisebene zu platzieren, die der Nullhöhe entspricht.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Identifizierung von immobilisierten Vesikeln auf der gescannten Oberfläche. (A) Die oberflächenimmobilisierten Exosomen werden als Körner identifiziert, die über dem Substrat durch einen vom Benutzer ausgewählten Höhenschwellenwert gemäß Markierung nach Schwellenwertherausragen. (B) Das Ergebnis der Identifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Analyse der AFM-Daten. Die Verteilung der maximalen Höhen über dem Substrat innerhalb des von den identifizierten Exosomen belegten Bereichs wird wie das Werkzeug Getreideverteilungen dargestellt.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Auswirkungen der Oberflächenmodifikation und DER EV-Konzentration der Oberflächendichte von immobilisierten Vesikeln. (A) Das AFM-Höhenbild des frisch gespalteten Glimmersubstrats nach 12 h Inkubation mit MCF-7-Exosomenprobe, gefolgt von Reinigung mit DI-Wasser und Trocknung. Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen von der Flüssigkeit zum Substrat ist ineffizient, ohne der Oberfläche des Glimmers eine positive Ladung zu geben. Nur wenige Partikel, die im Scan gesehen werden, sind wahrscheinlich das Ergebnis einer unvollständigen Entfernung der MCF-7-Probe, bevor das Substrat getrocknet wurde. (B) Der Höhenscan der Glimmeroberfläche in der Luft nach der Behandlung mit Nickelchlorid zeigt das Substrat frei von Verunreinigungen. Die Panels (C) und (D) zeigen AFM-Höhenscans, die nach der Änderung der Oberflächenladung und der Inkubation mit der gleichen MCF-7-Probe wie in Panel (A) für 24 h bzw. 12 h erhalten wurden. Die Oberflächenkonzentration von immobilisierten Vesikeln ist nach 24 h Inkubation übermäßig dicht. Die 12-Stunden-Inkubation führt zu weniger Exosomen, die auf der Oberfläche immobilisiert sind, und zu den Scandaten, die leichter genau zu analysieren sind.  Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 11: AFM-Bilder von hydratisierten MCF-7-Exosomen elektrostatisch immobilisiert auf der modifizierten Glimmeroberfläche. (A) Das Höhenbild. (B) Das entsprechende AFM-Phasenbild bestätigt, dass es sich bei den Körnern im Höhenbild um weiche Nanopartikel handelt, wie es bei Membranbläschen zu erwarten ist. (C) Die Höhendaten für die drei Vesikel, die durch die in Tafel (A) dargestellte Linie gekreuzt werden, veranschaulichen eine abgeflachte Form, die durch die elektrostatische Anziehung von Exosomen auf die positiv geladene Oberfläche des modifizierten Glimmers verursacht wird. (D) Die Formverzerrung ist in einer vergrößerten Ansicht der immobilisierten Vesikel in Panel (A) und seinem Querschnitt zu erkennen. Das Phasenbild des gleichen Vesikels ist in (E )dargestellt. Diese Abbildung wird von Referenz³ geändert und mit Genehmigung neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 12: Dimensionale Charakterisierung von hydratisierten Vesikeln, die auf der Oberfläche immobilisiert sind, und die Schätzung ihrer Kugelgröße in der Lösung. (A) Die Verteilung der Spitzenhöhen über der Oberfläche (rote Kurve) hat den Mittelwert von 7,9 nm. Die Fläche, die von immobilisierten Exosomen belegt wird, hat einen durchschnittlichen Durchmesser von 69,6 nm (blaue Kurve). (B) Das AFM-Höhenbild für eines der immobilisierten Exosomen veranschaulicht seine stark oblate Form, die durch elektrostatische Kräfte verursacht wird. Die Kugelgröße der exosomalen Vesikel in der Lösung kann durch übereinstimmende Volumina geschätzt werden, die von oberflächenimmobilisierten und kugelförmigen Membranhüllen eingeschlossen sind. (C) Die Größenverteilung der Kugelbläschen in der Lösung (rote Kurve) wurde anhand der AFM-Daten von 561 immobilisierten Vesikeln bestimmt. Die Vesikelgrößen in Kryo-TEM-Bildern (blaue Kurve) stimmen mit den AFM-Ergebnissen überein. Diese Abbildung wird von Referenz³ geändert und mit Genehmigung neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 13: Oberflächenkonzentrations- und Größensegregationsartefakte bei passiver Abscheidung von Elektrofahrzeugen aus verdampfender Flüssigkeit. (A) Das Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zeigt, dass die Oberflächenkonzentration von Exosomen, die passiv aus einer Trocknungsflüssigkeit abgelagert werden, räumlich variabel ist, wenn die Oberflächenimmobilisierung aus einem aufhängenden Biofluid nicht durchgeführt wird. (B) Die passive Ablagerung von Elektrofahrzeugen aus einer Trocknungsprobe bewirkt eine Vesikelgrößentrennung. Die erhebliche Größenvariabilität wird durch die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen (pdf) für die Vesikel in verschiedenen Regionen im Bild (A) quantifiziert, die durch weiße diagonale Linien definiert sind. Diese Abbildung wird von Punkt¹ geändert und mit Genehmigung neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 14: Becherförmige Geometrie ausgetrockneter Vesikel, die während der Flüssigkeitsverdunstung passiv auf der Oberfläche abgelagert werden. Die Oberflächenaustrocknung von Vesikeln, die nicht durch elektrostatische Kräfte immobilisiert wurden, führt bekanntermaßen zu einem becherförmigen Erscheinungsbild, das häufig in SEM-Bildern von Elektrofahrzeugen beobachtet wird. Diese Abbildung wird von Punkt¹ geändert und mit Genehmigung neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer biologischen Flüssigkeit, Oberflächenscans und Bildanalysen sind die wesentlichen Schritte des entwickelten Protokolls zur AFM-Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Flüssigkeiten. Die Anzahl der Vesikel, die AFM-Bildwaagen mit der abgebildeten Oberfläche und der auf dem Substrat immobilisierten Oberflächenkonzentration der Vesikel zugänglich sind. Angesichts eines negativen Zeta-Potenzials von Elektrofahrzeugen und Exosomen¹⁸befürworten wir die elektrostatische Fixierung von Elektrofahrzeugen aus flüssigen Proben auf das AFM-Substrat. Die Immobilisierung ist wirksam, wenn die Oberfläche positiv geladen ist. Vor der Immobilisierung von Elektrofahrzeugen muss die positive Oberflächenladung möglicherweise dem Substrat vermittelt werden, wie im Fall von Glimmer , einem geschichteten Silikatmineral mit der allgemeinen Formel KAl₂(AlSi₃O₁₀)(OH)₂. Die Oberfläche des frisch gespalteten Glimmers ist nahezu flach, was ideal für die Abbildung von Nanopartikeln durch den AFM ist, aber seine Oberflächenladung ist negativ und muss daher modifiziert werden. Das Protokoll beschreibt das Verfahren, um dem AFM-Substrat eine positive Oberflächenänderung zu vermitteln. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen eine deutliche Verbesserung der EV-Fixierung von einem Biofluid zum modifizierten Glimmersubstrat.
 
Bei der Abbildung hydratisierter Vesikel ist es wichtig, die Probenverdunstung zu minimieren, die die Oberflächenabscheidungsartefakte und konvektive Ströme verursacht und die Flüssigkeitskonzentration der Vesikel mit der Zeit erhöht, was zu einer höheren Oberflächenkonzentration von immobilisierte Elektrofahrzeuge als erwartet, insbesondere bei längeren Inkubationen. Sondenhalter, die explizit für flüssigkeitsproben entwickelt wurden, eliminieren oder verlangsamen die Verdunstung und sollten verwendet werden, um hydratisierte Elektrofahrzeuge abzubilden. Unspezifische Bindungen an die Scansonde werden in Gegenwart von ionischen Arten reduziert. Daher ist es bei der Abbildung von hydratisierten Elektrofahrzeugen vorzuziehen, das Substrat mit einem gepufferten Medium wie PBS als DI-Wasser abzudecken.

Bedeutung der Oberflächenimmobilisierung
Die konsistente und vorhersagbare Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf dem modifizierten Substrat beseitigt die primäre Variabilitätsquelle in den AFM-Ergebnissen. Alle nachgelagerten Schritte, vom Scannen bis zur Datenanalyse, lassen sich durch die Auswahl von Instrumentierung, Sonden, Scanparametern sowie der Datenanalysesequenz und -algorithmen leichter steuern. Der Benutzer sollte sich der vorgelagerten Variabilität in biologischen Proben und EV-Isolationsprotokollen bewusst sein, die wichtige Fragen sind, die über den Rahmen dieser Arbeit hinausgehen.

Wir empfehlen die Durchführung einer Oberflächenimmobilisierung von Ev auf der Oberfläche des modifizierten Glimmers aus flüssigen Proben, auch wenn das Ziel darin besteht, ausgetrocknete Vesikel in der Luft zu charakterisieren — der Bedarf ist weniger offensichtlich, da sich Vesikel unweigerlich auf jedem Substrat ablagern, da die Flüssigkeit verdunstet. Tatsächlich wurden die AFM-Ergebnisse für ausgetrocknete EV, die ohne Änderung der Oberflächenladungen von Glimmer erzielt wurden, was ein Voraussetzung für die elektrostatische Immobilisierung von Elektrofahrzeugen aus einer Flüssigkeit ist, in den letzten^{19,20,21 berichtet.} . Wenn Elektrofahrzeuge jedoch nicht aus der flüssigen Probe an der Oberfläche befestigt sind, erzeugt ihre passive Abscheidung durch Verdunstung Artefakte, die kollektiv als Kaffeeringeffekt²²bezeichnet werden. Zwei solcher Artefakte, die als Trocknungsflüssigkeit auftreten, sind im SEM-Bild (Abbildung 13A) von Serumexosomen dargestellt, die durch Verdunstung auf einer negativ geladenen Glasoberfläche abgelagert werden. Erhebliche Schwankungen in der Oberflächenkonzentration von gefällten Vesikeln sind sofort erkennbar. Das zweite Artefakt, quantifiziert in Abbildung 13B, ist die erhebliche Variabilität der Vesikelgrößen in verschiedenen Bereichen innerhalb des Umfangs der getrockneten Probe. Angesichts dieser Artefakte kann die AFM-Charakterisierung passiv abgelagerter Vesikel aus einer Trocknungsflüssigkeit zu verzerrten oder inkonsistenten Ergebnissen führen, es sei denn, die gesamte Oberfläche, die ursprünglich von einer jetzt getrockneten Flüssigprobe belegt wurde, wird gescannt.

Zwei zusätzliche Probleme sollten bei der Abbildung der ausgetrockneten Proben berücksichtigt werden, die ohne feste Immobilisierung von Vesikelauf auf dem Substrat gewonnen wurden. Erinnern Sie sich daran, dass unser Protokoll benutzeriert, die Oberfläche gründlich mit DI-Wasser zu waschen, nachdem die Vesikel aus einer flüssigen Probe immobilisiert wurden. Dieser Schritt soll verhindern, dass ionische und andere nicht-vesikuläre Gelöste bei der Verdunstung komplexer Biofluide mit erheblicher Osmolarität Oberflächenablagerungen bilden. Wenn Elektrofahrzeuge nicht fixiert sind, löst eine gründliche Wäsche eine große Anzahl von Vesikeln von der Oberfläche, wodurch die Ergebnisse möglicherweise verzerrt werden und zu wenige Partikel zur Analyse übrig bleiben. Eine weitere häufige Schwierigkeit, die durch die Immobilisierung von Elektrofahrzeugen auf der modifizierten Glimmeroberfläche vor der AFM-Bildgebung reduziert wird, ist die Haftung von Partikeln mit der Sonde²³ und die irreführenden Artefakte, die durch dieses Phänomen verursacht werden.
 
Kontrolle der Oberflächendichte von immobilisierten Elektrofahrzeugen
Die beiden leicht zu steuerbaren Faktoren, die im Protokoll identifiziert werden können, ermöglichen es dem Benutzer, die Oberflächenkonzentration der immobilisierten Elektrofahrzeuge auf dem modifizierten Glimmersubstrat anzupassen: die Konzentration der Vesikel in der flüssigen Probe und die Zeit, zu der die Probe auf das Substrat. Eine hohe Dichte von immobilisierten Vesikeln, die mit längeren Inkubationszeiten und einer höheren Konzentration von Elektrofahrzeugen in der Flüssigkeit erreicht werden, erhöht die Anzahl der während des Scannens analysierten Vesikel und die statistische Leistungsfähigkeit der Schlussfolgerungen, die durch die Analyse des AFM daten. Gleichzeitig erschwert eine zu dichte Oberflächenkonzentration, wie im abbildungsgemäß in Abbildung 10C gezeigt, wo Partikel die gesamte Oberfläche dicht bedecken und keine dazwischenliegenden Bereiche des Substrats haben, die Bildanalyse und die Interpretation der Ergebnisse. und kann zu Scan-Artefakten führen, die durch die Interaktion zwischen dicht räumigen Teilchen verursacht werden.

Einfluss des elektrostatischen Siebs und der hydrodynamischen Beweglichkeit von Elektrofahrzeugen
Die transparente Kontrolle der Oberflächenkonzentration von immobilisierten Elektrofahrzeugen in Abhängigkeit von Faktoren, die sie beeinflussen, ermöglicht es dem Benutzer, experimentelle Bedingungen an die spezifischen Anforderungen einer Studie anzupassen. Bei der Anpassung ist es wichtig zu erkennen, dass die elektrostatische Oberflächenimmobilisierung ein transportbegrenzter Prozess ist, der durch die Ionenstärke des Biofluids beeinflusst wird.

Die Konzentration von ionischen und positiv geladenen Arten wirkt sich umgekehrt auf die Debye-Länge aus, über die die Oberflächen- und Vesikelladungen abgeschirmt werden. Jenseits dieser Länge sind die elektrostatischen Kräfte vernachlässigbar. Die Grenzschicht der elektrostatischen Anziehung des Substrats wird in ionisch-reichem PBS viel kleiner sein als in DI-Wasser. Dieser Unterschied impliziert, dass nach einer kurzen Inkubation, die der Zeit entspricht, die erforderlich ist, um die Flüssigkeitsschicht zu erschöpfen, in der die elektrostatischen Attraktionen gefühlt werden, eine Oberflächendichte von EVs, die von der Suspension in DI-Wasser immobilisiert sind, höher sein wird als von PBS. unter der Annahme, dass die Konzentration der Elektrofahrzeuge in beiden Flüssigkeiten gleich ist. Anders ausgedrückt, müssen mehr Vesikel immobilisiert werden, um eine dickere Anziehungsschicht in DI-Wasser zu erschöpfen als in PBS unter ansonsten identischen Bedingungen.

Nachdem die Vesikel von der Grenzschicht erschöpft sind, wird die Immobilisierung zu einem völlig transportbegrenzten Prozess. Bei dieser Regelung hängt die Abscheidungsrate nicht vom Suspending Medium (z. B. DI-Wasser oder PBS) ab, solange die Viskosität gleich ist und der Transport völlig diffusiv ist. Der Transport von Vesikeln in die Anziehungspunktschicht ist jedoch möglicherweise nicht ganz diffusiv. Wenn z. B. die Probe in einem sessilen Tropfen auf dem AFM-Substrat während der Inkubation teilweise verdunstet, wird die Flüssigkeit im Inneren des Tropfens dem Verdunstungsfluss ausgesetzt, und der Transport der Vesikel zum Substrat hat beides, diffusive und konvektive Beiträge. Wenn die Verdunstung nicht ausreichend kontrolliert wird, wird der Beitrag eines konvektiven Transports beträchtlich sein, und die Immobilisierungsrate wird höher sein als erwartet. Die Wirkung des konvektiven Transports ändert sich mit der Dicke der Anziehungsschicht, die selbst vom Ionengehalt der Flüssigkeit abhängt. Darüber hinaus wird die Verdunstung die Vesikelimmobilisierung auf dem Substrat verbessern, indem EVs in der Lösung konzentriert werden. Bei höheren EV-Konzentrationen wird der Konzentrationsgradient zwischen der Anziehungsschicht und der angrenzenden Flüssigkeit zunehmen, wodurch eine größere thermodynamische Antriebskraft zur Migration von Vesikeln zum Substrat entsteht.

Immobilisierte Vesikel können eine flüssige Probe mit einer Verzerrung darstellen. Für den Fall, wenn die Immobilisierungsrate durch Diffusion begrenzt ist, sind Vesikel mit kleineren hydrodynamischen Größen, die durch die Kombination der Vesikelgröße und der Dicke der umgebenden koronalen Schicht bestimmt werden (Abbildung 1), eher in die Wegen ihrer höheren Mobilität. Folglich werden die hydrodynamisch kleinen Elektrofahrzeuge nach der anfänglichen Erschöpfungsphase auf dem Substrat im Vergleich zu ihrem Beitrag zur EV-Population in der flüssigen Probe überrepräsentiert sein. Beachten Sie, dass eine kleinere hydrodynamische Größe aufgrund der Heterogenität der Dicke der koronalen Schicht³nicht automatisch auf Elektrofahrzeuge mit kleineren Vesikelgrößen zeigt. Die voreingenommene Darstellung wird durch lange Inkubationen vermieden, die durch ihre Immobilisierung auf dem Substrat die gesamte Population von Elektrofahrzeugen in der Flüssigkeit erschöpfen. Wenn ein Benutzer darauf abzielt, alle Elektrofahrzeuge aus dem Biofluid zu immobilisieren, um eine übermäßig dichte Abdeckung der Oberfläche mit den immobilisierten Vesikeln zu vermeiden, kann es notwendig sein, die EV-Konzentration in der Flüssigkeit unter dem im Protokoll vorgeschlagenen Bereich zu reduzieren.

Verformung von Elektrofahrzeugen auf dem Substrat
Extrazelluläre Vesikel in ihrem nativen hydratisierten Zustand und nach der Austrocknung können durch den AFM charakterisiert werden, wie im Protokoll beschrieben. Die elektrostatischen Kräfte^24, die EVs auf der Glimmeroberfläche immobilisieren, verzerren auch ihre Form von der Kugelgeometrie, in der sie in der Lösung vorhanden sind. Die Auswirkungen der Austrocknung auf die Größe und Morphologie von immobilisierten Elektrofahrzeugen können analysiert werden, indem die gleiche Oberfläche vor und nach dem Trocknen der Probe erneut gescannt wird.

Es ist lehrreich, die Auswirkungen der Probenvorbereitung auf die Form der ausgetrockneten Elektrofahrzeuge zu untersuchen. Die elektrostatisch immobilisierten Elektrofahrzeuge behalten die hochgradig oblate Geometrie nach dem Trocknen bei, werden aber durch die Austrocknung weiter abgeflacht. Die Höhe über der Oberfläche der ausgetrockneten Vesikel wird kleiner als in Abbildung 12A, während ihre Grundfläche zunimmt (Daten nicht dargestellt). Andererseits, wenn Vesikel passiv während der Flüssigkeitsverdunstung und ohne vorherige Immobilisierung auf der Oberfläche abgelagert werden, neigen sie dazu, eine Cup-Form-Geometrie bei der Austrocknung zu erreichen, wie in den SEM-Bildern und in jüngerer Zeit in AFM beobachtet wurde. Scans. Diese gekuppelte Form wird nun als Probenvorbereitungsartefakt²⁵ erkannt, das durch Ungleichmäßigkeit der Kapillarkräfte während der Oberflächenaustrocknung verursacht wird, wie in Abbildung 14¹mechanistisch erläutert.
 
Bildanalyse und Interpretation von AFM-Daten
Die Reaktionen auf elektrostatische und kapillare Kräfte, die die Form von Elektrofahrzeugen verzerren, liefern wertvolle Informationen über die strukturellen und kompositorischen Eigenschaften von Elektrofahrzeugen. Beispielsweise wurde kürzlich ein multidimensionaler Satz biophysikalischer Merkmale, wie die verformte Größe und Form, die aus den AFM-Daten extrahiert wurden, verwendet, um die Durchführbarkeit zu demonstrieren, zwischen Exosomen zu unterscheiden, die von verschiedenen Wirtszellen sezerniert werden⁵. Die Verzerrungen können auch berücksichtigt und kompensiert werden. Zum Beispiel haben wir gezeigt, wie man die AFM-Daten verwendet, um die Kugelgröße von Vesikeln in der Lösung zu charakterisieren, indemwir die Durchmesser von Kugeln schätzen, die das gleiche Volumen wie immobilisierte Exososme 3 einkapseln.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM/STM Controller	Bruker	Multimode Nanoscope V	This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air.
AFM/STM metal specimen discs (10 mm)	TedPella	16207	Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm)	TedPella	50	Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air	Bruker	TESP-V2	High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid	Bruker	MLCT	Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape	Spectrum	360-77705	Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC	System Biosciences	EXOTC50A-1	ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media.
Glass probe AFM holder for imaging in liquid	Bruker	MTFML-V2	This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion	Czech Metrology Institute.	Version 2.52	Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper	GE Healthcare Whatman	Grade GB003 Blotting Paper	Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.
Lint-free cleanroom wipes	Texwipe	AlphaWipe TX1004	Use these polyester wipes for surface cleaning.
Nickel(II) chloride (NiCl2)	Sigma-Aldrich	339350	Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	10010023	PBS, pH 7.4