Summary
液体試料からのエキソソームおよび細胞外小胞の標識フリー固定化および原子間力顕微鏡(AFM)によるイメージングに関するステップバイステップの手順について説明する。AFM画像は、溶液中の小胞のサイズを推定し、他の生物物理学的特性を特徴付けるために使用されます。
Abstract
エキソソームおよび他の細胞外小胞(EV)は、脂質膜小胞、膜タンパク質および他の分子による表面装飾、およびRNAを含む親細胞から受け継がれた多様な発光含有量からなる分子複合体であり、タンパク質、および DN。小胞の大きさや表面装飾によって形成される冠状層に依存するEVの流体力学的サイズの特性化は、日常化している。EVの最小であるエキソソームの場合、流体力学と小胞のサイズの相対的な差は重要です。低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングによる小胞サイズの特性解析は、金の標準的な技術であり、機器のコスト、サンプル調製、イメージングおよびおよびデータ分析、および画像で観察される粒子の数が少ない。広く利用可能でアクセス可能な代替手段は、原子力顕微鏡(AFM)であり、3次元幾何学、サイズ、および細胞外小胞の他の生物物理学的特性に関する多目的なデータを生成することができる。開発されたプロトコルは、この分析ツールを利用するユーザーを導き、水和または乾燥した形でEVをイメージングするためのサンプル準備を含むAFMによるEVの分析のためのワークフローを概説し、静電固定基板上の小胞、データ取得、分析、および解釈。代表的な結果は、変更されたマイカ表面上のEVの固定が予測可能でカスタマイズ可能であり、ユーザーが多数の小胞のサイジング結果を得ることを可能にすることを示しています。AFMデータに基づく小胞サイジングは、クライオ-TEMイメージングと一致することがわかった。
Introduction
細胞外小胞(EV)は、血液、尿、唾液、牛乳、羊水を含むすべての体液に存在する。エキソソームは、エンドソーム生体形成、エンドソーム経路のマーカー、およびすべてのEVの中で最小サイズによって他のEVと区別されるEVの地区クラスを形成します。エキソソームの大きさは、多くの場合、研究間の実質的な変動で報告されます。サイジング結果は、EVサイズ1、2を推定する異なる分析技術によって採用される物理原理の違いを反映して、方法依存性であることが判明した。例えば、最も広く使用されているサイズ特性解析技術であるナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、EVのサイズを流体力学的直径として推定し、溶液中のEVのブラウンモビリティに対する耐性を特徴付けます。小胞のより大きい流体力学の直径は液体の低い移動性を意味する。小胞の周りの冠状層は、表面タンパク質および膜表面に固定または吸着された他の分子からなる、実質的に移動性を阻害し、EVの流体力学的サイズを増加させる。相対的に見て、この増加は、図1に示すように、エキソソーム3に対して特に大きい。
低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングは、小胞の大きさと形態を水和状態で特徴付ける決定的な技術です。しかし、計測器のコストが高く、それを正しく使用するために必要な専門知識は、水和されたEVを画像化できる代替技術の探求を動機づけます。取得したクライオ-TEM画像で観測または特徴付けられた比較的少数のEVは、この技術のもう一つの顕著な欠点です。
原子力顕微鏡(AFM)は、水和または乾燥したEV4、5、6の3次元地形を可視化し、基板全体のプローブをスキャンして表面上の粒子の画像をラスター化する。本研究では、AFMによってEVを特徴付けるプロトコルの本質的なステップについて概説する。小胞を液体中で撮像する前に、機能性表面へのテザリング、フィルタ内の捕捉、または静電引き付け7によって基板上に固定化されなければならない。正に帯電した基板上の静電固定は、負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの固定化のための特に便利なオプションである。しかし、表面上の細胞外小胞を固定するのと同じ静電力もその形状を歪め、ポストイメージングデータ解析が不可欠です。この点を詳しく説明するには、表面に固定化されたエキソソームの歪んだ形状に関するAFMデータに基づいて、溶液中の球状小胞の大きさを推定するアルゴリズムを説明する。
開発されたプロトコルでは、小胞の堅牢な静電固定化の手順が提示され、水和または乾燥状態で原子力イメージングを実行するために必要な手順が続きます。固定化された小胞の表面濃度に影響を与える因子が同定される。このガイダンスは、溶液中のEV濃度が異なるサンプルに対して静電固定を実行する方法について説明します。十分に多数の固定化小胞に基づく異なる生物物理特性の経験的確率分布の推定を可能にする実験条件の選択が議論される。AFMデータのポストイメージング分析の例が示される。具体的には、固定化されたEVのAFM特性に基づいて溶液中の小胞の大きさを決定するためのアルゴリズムが記載されている。代表的な結果は、凍結TEMイメージングの結果とAFMによる小胞サイジングの一貫性を示す。
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Protocol
1. 生体流体からのEVの分離
- 差動超遠心分離8、降水量、またはサイズ排除クロマトグラフィー9などの確立された方法のいずれかによってEVを分離する。
- 期待される表面および発光バイオマーカーの存在および製剤のクロスコンタミネーションを示すバイオマーカーの欠如を確認する。電子顕微鏡で単離粒子の脂質二層形態を確認する。
注:エキソソームを分離する場合、ナノ粒子追跡解析(NTA)または動的光散乱によって測定される流体力学的なサイズ分布は、期待される範囲内にあるべきである。EVとエキソソームの分離の詳細は、このプロトコルの範囲を超えています。選択された方法は、実験的な質問と研究10の目標に依存します。次のステップは、市販の沈殿キット(材料の表)を用いてMCF-7乳癌細胞の増殖培地からの沈殿によってエキソソームを濃縮する手順の具体的な図を示す。 - 細胞培養拡大の前に、MCF-7乳癌細胞を液体窒素中に貯蔵する。細胞をサブ培養に解凍する。
- 無菌の慣行に従って、150のmm版の細胞めっきを行う。イーグルの最小必須培地、0.01 mg/mLヒト組換えインスリン、および10%のエキソソームフリーの胎児ウシ血清で構成される成長培地を使用する。
- 培養を95%の空気と5%のCO2で通気し、37°Cでインキュベートします。
- 細胞が落ち着いた後(めっき後約24時間)、培体を変更する。1:10比でプレートを分割し、培養10枚、それぞれ20mLの培地を含む。
- 細胞がまだ増殖期にある場合、これらのプレートの9(180 mL)から〜70−80%の合流で培養およびプール媒体を収穫する。
- メディアを 60 mL と 120 mL に分割し、さらに 30 mL/チューブに分割し、遠心分離機を 3,000 x gで 15 分間使用します。
- 各管から新しい無菌50 mLチューブに上清を移し、エキソソーム分離を行います。
- 公開されたプロトコルに従って沈殿によってエキソソームを分離するか(例えば、参照11を参照)、または市販の絶縁キット(材料の表)を使用する場合は、製造元の指示に従ってください。後者の場合の最初のステップとして、遠心分離機細胞培地を3,000 x gで15分間引き出し、細胞や細胞の破片を廃棄する。
- 沈殿液(1:5容積比)を上清に加え、混合し、一晩冷蔵する。
- 室温で30分間1,500 x gで遠心分離機。遠心分離後に上清を捨てます。
- 残りのエキソソームペレットを1,500 x gでさらに5分間回転させます。ペレットを乱すことなく、吸引によって残りの沈殿液を除去する。
- 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーの100 -500 μLでペレットを再ステーペンし、ダウンストリーム分析に必要に応じて複数のアリコートに分割します。
- 直ちにAFMイメージング用の単離エキソソームの表面固定化に進む。必要に応じて、凍結解凍サイクル中にサンプルの損傷を避けるために予防措置を講じながら、後で使用するために-80°Cでアリコートを凍結してください。
2. 細胞外小胞の表面固定
- 強力な両面テープ、エポキシ、または代替接着剤を使用して、マイカディスクをAFM/走査トンネリング顕微鏡(STM)磁気ステンレススチール製試料ディスクにしっかりと取り付けます。
- 鋭いかみそりやユーティリティナイフを使用して、または上面に粘着テープを取り付け、それを孔質にして材料の層を取り除くことによって、マイカディスクをクリーブします。
注:いずれの方法も、以前に環境にさらされたマイカの薄い層を取り除くことによって、処女表面を明らかにする必要があります。手順の後、AFM/STM金属試料ディスクへのマイカの取り付けは堅固なままでなければなりません。 - 室温で、10mM NiCl2溶液の100 μLでマイカの上面を10sで処理し、表面電荷を負から正に変更します。
- 糸くずのない拭き取りまたはブロッティングペーパーを備えたブロットNiCl2溶液。マイカ表面を脱イオン(DI)水で3倍洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。
注: AFM で修正したサーフェスをスキャンして、汚染物質が含まれであることを確認することをお知めします。 - AFM試料ディスクに、付属の表面改変マイカをペトリ皿に入れます。
- 1x PBSでステップ1.14からエキソソームサンプルを希釈し、溶液のmL当たり4.0 x 10x 10 10の粒子の間の濃度を得る。NTAを用いて希釈粒子濃度を検証する。
- ピペットから希釈されたエキソソーム溶液の100 μLを空にしてマイカの表面にセッシルドロップを形成する。
- ペトリ皿に蓋をしてパラフィンフィルムで密封し、サンプルの蒸発を減らします。4°Cで12-18hのサンプルをインキュベートします。
注:固定化されたエキソソームの表面密度は、インキュベーション時間と液体中のEVの濃度に伴って増加します。エキソソームが低濃度でサンプル中に存在する場合は、より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。 - インキュベーション後、表面を乱すことなく試料の80−90%を吸引する。この時点で、エキソソームはマイカ基板上で静電固定化される。
- 水和したEVをイメージングする前に、1x PBSで表面をすすいで下さい。3倍を繰り返します。試すプロセス全体を通してサンプルを水和するように注意してください。
- マイカ表面を1x PBSで洗浄した後、液体の80%~90%を除去し、新鮮な1x PBSのピペット〜40 μLを取り除き、サンプルをカバーします。
- 乾燥したEVをイメージングする場合は、基板をDI水ですすいでください。3倍を繰り返します。
注:DI水でリンスすると、塩結晶の形成や、基板が乾燥するにつれて表面に溶剤が堆積するのを防ぐことができます。 - 乾燥したEVをイメージングする前に、表面に触れることなくできるだけ多くの液体を吸引し、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させます。
3. AFMイメージング
- 乾燥したEVをイメージするには、タッピングおよび非接触イメージングモードで空気中でスキャンするように設計された片持ち直しを選択し、プローブホルダーに取り付けます。
注:材料の表に記載されている例の片持ち味の特性(長さ123μm、幅40μm、先端半径7nm、および37 N/mばね定数)は、利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する際にガイドとして使用することができます。- ステップ 2.13 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは段階のサンプルを固定する。準備と段階が熱的に平衡化するための時間を確保します。
- タップモードを使用して、マイカの表面の十分に大きな領域をスキャンします。たとえば、5 x 5 μm の面積を選択し、512 行で 512 行のスキャンレートでラスター化し、高さと位相の両方の画像を取得して、サンプルの地形と表面特性に関する補完的な情報を提供します。
注: イメージ領域とイメージを形成するために選択した行数に伴ってスキャン時間が増加しますが、スキャンレートが 1 秒あたりにスキャンされた行数として定義されると減少します。高速スキャン速度は、画質に影響を与える可能性があります。したがって、ラスター化の速度は、取得時間と画質のトレードオフのバランスをとる必要があります。
- 水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルのスキャンに適した片持ち直しを選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち式を取り付けます。
注:利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する場合、材料の表に記載されているプローブの仕様(公称長さ175μm、幅22μm、先端半径20nm、0.07 N/mばね定数、および4~8kHzの範囲の駆動周波数でのイメージング用に最適化された)をガイドとして使用できます。- 1x PBSで片持ちの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。
- ステップ 2.11 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは、その表面に固定化されたEVを含む付属のマイカを固定します。
- 調製とAFMステージが熱的に平衡化する時間を確保します。
- タッピングモードで水和マイカサーフェスをイメージします。高さと位相の両方の画像を取得します。
注:イメージング品質は、計測、選択されたプローブ、およびスキャンパラメータの影響を受けます。スキャン条件を最適化する場合、開始点として使用できます: 5 x 5 μm 領域を 512 行でスキャンし、~0.8~ 1.0 Hz のスキャン レートと 4 ~ 8 kHz のドライブ周波数を選択します。
4. 画像解析
注: 取得した高さ画像には、次のデータ処理および解析手順が適用されます。同様の手順は、位相データを分析するために適応されてもよい。以下の説明は、GNU一般公衆ライセンスの下で利用可能な無料でオープンソースのソフトウェアであるGwyddion12に固有です。同様の機能は、代替ソフトウェア ツールで使用できます。
- データプロセス、SPMモード、ヒントに移動し、モデルヒントを選択します(図2)。サンプルのスキャンに使用する先端のジオメトリと寸法を選択し、[OK]をクリックします。
- 表面の再構成を実行して、先端の浸食アーティファクトを修正します。画像を開きます。メニューから、[データプロセス]、[SPMモード]、[ヒント]を選択し、[サーフェスの再構成]を選択し、[OK] をクリックします (図3)。
- スキャン データから基板の傾きを取り除いて、実験室の XY 平面に一致するようにイメージング プレーンを配置します。このタスクを実行するには、[データ プロセス] 、[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択します (図 4)。
- [データ プロセス]を選択してイメージの行を位置合わせし、[データを修正]を選択し、[行の位置を整列]を選択します。いくつかの配置オプションを使用できます (図 5)。たとえば、中央値は、各スキャン ラインの平均高さを検出し、データから減算するアルゴリズムです。
- [データ プロセス]に移動し、[データを修正]に移動し、[傷跡の削除] (図 6)を選択します。
- データプロセスからアクセス可能なレベルドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択して、マイカサーフェスをゼロの高さZ = 0に位置合わせします(図7)。
- グレインドロップダウンメニュー(図8A)で[しきい値でマーク]を使用して、スキャンしたサーフェス上のEVを識別します。このアルゴリズムは、表面固定エキソソームを、ユーザが選択した閾値を超える高さによってゼロサーフェス基板から突き出た粒子として識別します。1 ~ 3 nm の範囲のしきい値を選択すると、バックグラウンド干渉のほとんどが除去されます。より小さいしきい値は、よりクリーンな背景で使用されます。
注: 図8Aのしきい値は 1.767 nm です。この閾値化を伴うMCF-7エキソソーム同定の結果を図8Bに示す。Gwyddionは、自動しきい値(大津の方法)、エッジ検出、流域アルゴリズムなど、画像内の小胞を自動的に識別するアルゴリズムとして、しきい値に代わるいくつかの選択肢を提供します。
注:粒子凝集体は、AFM画像に存在する場合、マスクされ、解析から除外され得る。 - グレインズメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、識別されたEVの幾何学的および寸法的な特性解析を実行します。
注:Gwyddionは、水和または乾燥状態で固定化されたEVのスカラー値、アール、体積、およびその他の特性の分布を評価するためのツールを提供します。スカラー値プロパティの例を図 9に示し、識別された各エキソソームのフットプリント内の最大高さの分布を示します。 - 他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。
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Representative Results
EVの表面固定は、イメージングシーケンスの重要なステップです。負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの静電表面固定化は、マイカの基板が正の表面電荷を有するように修飾された後に強く起こるであろう。NiCl2による処理を行わずに表面変化を良好に付与すると、基板上のEVの固定化は効果がないことが判明した。図10Aの高さ画像は、PBSのmL当たり2.59x1010小胞を含むMCF-7エキソソームサンプルの後に空気中で取得し、新たに切り分けたマイカの未改変表面上で12時間インキュベートし、上に残存する非常に少ない小胞を示すDI水で洗浄した後の表面。図10Aに見える小胞は、最も可能性の高い、DI水の不完全な吸引の結果であり、表面に固定されていない小胞を再懸濁し、蒸発するにつれて基板上に沈化させた。
塩化ニッケルで表面電荷を修正した後、処理後に表面に汚染物質が含まれであることを確認することをお勧めします。図10Bの高さ画像(空気中で得られた)は、NiCl2で処理した後、DI水で3回洗浄した後、きれいな表面の例を示す。陽イオン導出面の粗さは0.3nm以下で、前回の報告13と一致している。
MCF-7エキソソームの固定の効率に対する表面電荷改変の劇的な肯定的な影響は図10C、Dによって示される。これらの2つのパネルは、以前に図10Aで画像化された試料の後に空気中で得られた高さスキャンを示し、それぞれ塩化ニッケルで処理された表面に24時間および12時間インキュベートした。
所定のサンプルが処理された表面でインキュベートされる時間は、固定化されたEVの表面濃度(領域あたりの小胞)を決定する。図10Cの高さ画像は、記載されたMCF-7エキソソーム試料を24時間インキュベートした後に得られた固定化小胞による過密な表面カバレッジの場合を示す。多くのアルゴリズムは、画像補正とデータ解析を実行するために、粒間に十分な空き基板を持つことに依存しています。たとえば、基板をゼロ平面に平準化およびシフトし、線の補正、および粒の体積の推定を行うには、正確な計算を実行するために介在する平坦なサーフェスが必要です。固定化された小胞の濃度が図10Cと同じくらい高い場合、これらのアルゴリズムは確実に機能しません。同じMCF-7試料から固定化された小胞の適切な表面濃度の一例は、より短い(12時間)インキュベーション後に得られた図10Dの高さ画像に示されている。
一般的なスキャン エラーを修正するには、取得した生 AFM データの後処理が必要です。以下の説明は、Gwyddion に固有です。同様の機能は、他の AFM/SPM データ分析ツールでも使用できます。
Gwyddion では、平面レベル関数を使用して基板の傾きを補正します。このような背景補正は、まず画像内のすべてのデータポイントを使用して基板の平面を見つけ、生データから差し引くことによって行われます。スキャンラインに沿った補正は、[行の位置合わせ]機能によって行されます。たとえば、実装されたアルゴリズムの 1 つは、各スキャン ラインの中央値の高さを計算し、対応する画像データ行から結果を減算することによって、位置合わせを実行します。フィードバック ループ内のローカル障害の寄与は、位置合わせされたデータのギャップを埋め、隣接するスキャンライン内のデータを比較することによって傷跡を除去する[傷跡を削除]機能を適用することで除去できます。基板を標高 Z = 0 にシフトすると、粒子やその他のフィーチャをマスキングした後のサーフェスのファセットと多項式レベル設定の組み合わせによって実現できます。Gwyddion のフラットベースツールは、このタスクを自律的に実行するか、ユーザー指定のマスクで実行します。記載された背景および線補正の後、マーク・グレインズ機能を実行することにより、静電的に固定された小胞を基板上で識別することができる。
図11Aおよび図11Bは、水和されたMCF-7エキソソームがマイカ表面に固定化され、タッピングモードを用いてPBSで取得された高さと位相画像を示す。マーク・グレインズ関数のしきい値を20%に設定したマーク・グレインズ機能のしきい値アルゴリズムを使用して、スキャンされた領域で合計561個の水和小胞が同定されました。ドライブ周波数でのプローブの応答の位相ラグは、ソフトサンプルの局所的な剛性変動に敏感です。図11A、Bに見られる高さと位相画像の間の一貫性は、したがって、画像化された穀物が実際に、基板上に固定化された柔らかい小胞であることを重要な確認である。
図11Cは、図11Aの白線上にあるエキソソームを介した高さ画像の断面を示す。生体流体中のエキソソームは球状幾何学1、14、15、16を有するが、基板上の形状は、正に帯電した静電性の引力によって著しく歪んでいる。表面。静電固定小胞のオブレートパンケーキ様幾何学は、図11Aに箱詰めされたエキソメのクローズアップ高さ画像(およびその断面)によって図11Dでさらに例示される。対応する位相画像を図 11Eに示します。AFMスキャンで同定された全561水和小胞の表面上のピーク高さの経験的確率密度関数(pdf)を図12Aに示す。この分布の平均値は7.9nmであり、変形力がない場合のリン脂質二重層17の厚さの約2倍である。
固定化されたエキソソームによって占められた基板上の領域は、小胞の「質量の中心」からマイカの表面上の境界までの平均距離に等しい直径を持つ円として近似した。これらの突起直径の分布は図12Aに示され、平均は69.6 nmに等しい。得られた高さと直径分布は、固定化されたエキソソームの歪んだ形状に対する静電表面固定化の有意な影響をさらに定量化する。
プロトコル手順の堅牢性および再現性は、サンプル調製からイメージングまで、同じMCF-7サンプルを3回再分析することによって確認され、各繰り返し結果は図12に示したものと統計的に類似した結果を生み出した。
静電気力によって引き起こされる固定化小胞の変形は、画像化されたEVの特性に関する洞察を提供するために補償または解釈されてもよい。例えば、AFMデータは、溶液中の小胞の球状サイズを推定するために使用されてもよい。出発点として、固定化小胞の膜エンベロープによって封入された体積を計算することができます。体積は、同定された小胞の表面レベルとそれらの下の基板標高の差を統合することによって見出される。小胞の下の基板レベルは直接アクセスできないが、小胞を取り囲む未占有基板のデータポイントのラプレースまたは代替補間によって推定することができる。Gwyddionでは、このような体積計算は、様々な穀物特性関数の分布を使用して行われます。Gwyddion からエクスポートされた結果は、体積に相当する球の直径にマップできます。
561分析された水和MCF-7小胞に対するAFMデータへの記述アルゴリズムの適用は、図12Bに示す体積等価球の直径の分布を生み出した。この分布は、マイカ表面に静電固定する前に生体流体中の生来の球状の膜小胞の大きさを推定する。AFMデータの分析から得られた小胞サイジングを、同じ試料のクライオ-TEMイメージングの結果と比較し、近接性3(図12B)であることが判明した。NTAで測定された流体力学の直径と得られた小胞サイズ(図1)の比較は、エキソソームの移動性がAFMおよびクライオTEMから決定された小胞の大きさから予想されるよりもはるかに小さいことを示している。測定。流体力学と小胞のサイズの違いは、外染小胞を取り巻くコロナ層の厚さを特徴付けます。
図1:EVの流体力学と幾何学的直径の比較外ソム小胞の幾何学的サイズは、液体中の拡散から決定される流体力学的サイズよりも実質的に小さい。違いは、EVの移動を妨げる膜共役分子と吸着分子によって形成されるコロナ層です。この図は参照3から変更され、許可を受けて転載されます。
図2:AFMプローブの特性。AFMプローブのジオメトリと寸法は、モデルチップ機能を使用して指定できます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:先端サンプル畳み込みによるイメージングアーティファクトの補正サーフェス再構築を実行することで、取得した AFM データをチップアーティファクトに対して修正できます。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:基板の傾きを補正する。平面レベルは、基板の平面を決定し、AFM データから差し引きます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: スキャン行のずれの修正。スキャン データを整列させる従来のアルゴリズムは、各スキャン ラインに沿って平均高さを検索し、画像内の対応するデータ ポイント行から結果を減算することです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 整列データのギャップの補正。傷跡と呼ばれる一般的なスキャン エラーは、傷跡の削除機能を適用することで、AFM データから削除できます。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: 標高 0 の基板の位置合わせ。[レベル] メニューの [ベース] オプションを使用すると、基板サーフェスをゼロの高さに対応するベース レベルに配置できます。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:スキャンした表面上の固定化小胞の同定。(A)表面固定エキソソームは、[しきい値によってマーク]で指定されたユーザーが選択した高さしきい値によって基板の上に突き出た穀物として識別されます。(B)識別の結果。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: AFM データの分析。同定されたエキソソームが占める領域内の基板上の最大高さの分布は、穀物分布ツールによってコンパイルされたものとして示される。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:固定化小胞の表面密度の表面改変およびEV濃度の影響。(A)MCF-7エキソソームサンプルで12時間後に切断したマイカ基板のAFM高さ画像をDI水で洗浄し、乾燥させた後に使用する。液体から基板へのEVの固定化は、マイカの表面に正の電荷を与えることなく非効率的です。スキャンで見られる粒子はほとんどなく、基板が乾燥する前にMCF-7サンプルを不完全に除去した結果である可能性が高い。(B)塩化ニッケルによる処理後の空気中のマイカ表面の高さスキャンは、汚染のない基板を示す。パネル(C)および(D)は、表面電荷の変更後に得られたAFM高さスキャンと、パネル(A)と同じMCF-7サンプルを用いて24時間および12時間のAFM高さを示す。固定化小胞の表面濃度は、24時間インキュベーション後に過度に緻密である。12時間のインキュベーションは表面に固定されるエキソソームの数を減らし、正確に分析しやすいスキャンデータにつながる。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図11:水和されたMCF-7エキソソームのAFM画像は、改変マイカ表面に静電固定化した。(A)高さ画像。(B)対応するAFM位相画像は、膜小胞に対して期待されるはずの高さ画像中の粒が柔らかいナノ粒子であることを確認する。(C)パネル(A)に示す線で交差した3つの小胞の高さデータは、修正マイカの正電荷を帯びた表面にエキソソームの静電引きによって引き起こされる平坦化された形状を示す。(D)形状の歪みは、パネル(A)とその断面に箱詰めされた固定化された小胞を拡大したビューで明らかである。同じ小胞の位相画像を(E)に示す。この図は参照3から変更され、許可を受けて転載されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図12:表面に固定化された水和小胞の寸法特性および溶液中の球状サイズの推定。(A)表面上のピーク高さ(赤い曲線)の分布は、平均値が7.9nmに等しい。固定化されたエキソソームによって占められた区域の平均直径は69.6 nm(青いカーブ)を有する。(B)固定化されたエキソソームの1つに対するAFM高さ画像は、静電力によって引き起こされるその高度に鈍い形状を示す。溶液中の外染小胞の球状サイズは、表面固定および球状の膜エンベロープで囲まれた体積を一致させることによって推定することができる。(C)溶液中の球状小胞の大きさ分布(赤色曲線)は、561固定化小胞のAFMデータから決定した。クライオ-TEM画像(青い曲線)の小胞サイズは、AFM結果と一致しています。この図は参照3から変更され、許可を受けて転載されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図13:EVの蒸発液からの受動堆積時の表面濃度およびサイズ分離アーティファクト。(A)走査型電子顕微鏡(SEM)画像は、中断された生体流体からの表面固定化が行われなかった場合に乾燥液から受動的に堆積したエキソソームの表面濃度が空間的に変動することを示す。(B)乾燥サンプルからのEVの受動堆積は、小胞サイズの分離を引き起こす。実質的なサイズの変動性は、白い対角線で定義された画像(A)内の異なる領域の小胞の確率密度関数(pdf)によって定量されます。この図は参照1から変更され、許可を受けて再印刷されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図14:乾燥小胞のカップ状の形状は、液体蒸発中に表面に受動的に堆積した。静電気力によって固定化されなかった小胞の表面乾燥は、EVのSEM画像でしばしば観察されるカップ状の外観をもたらすことが知られている。この図は参照1から変更され、許可を受けて再印刷されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生体液からのEVの固定化、表面スキャン、画像解析は、液体中のEVのAFM特性解析のために開発されたプロトコルの重要なステップです。AFMイメージングに適した小胞の数は、画像化された表面積および基板上に固定化された小胞の表面濃度と共にスケールする。EVやエキソソーム18の負のゼータ電位を考えると、液体サンプルからAFM基板へのEVの静電固定を提唱する。固定化は、表面が正に充電されたときに有効です。EV固定化の前に、正の表面電荷は、マイカの場合のように基板に付与する必要があり、マイカの場合と同様に、一般的な式KAl 2(AlSi3O10)(OH)2を含む層状ケイ酸塩鉱物である。新たにcleavecmicaの表面は完全に平坦に近く、AFMによるナノ粒子のイメージングに最適ですが、表面電荷は負であり、したがって、修正する必要があります。このプロトコルは、AFM基板に正の表面変化を与える手順について説明する。代表的な結果は、生体流体から修飾マイカ基板へのEV固定の顕著な改善を示した。
水和小胞をイメージングする場合、表面堆積アーティファクトおよび対流流を引き起こすサンプル蒸発を最小限に抑え、時間とともに小胞の液体濃度を増加させ、より高い表面濃度につながる重要である。特に長時間のインキュベーションの間に、予想以上に固定化されたEV。液体サンプル用に明示的に設計されたプローブホルダーは、蒸発を排除または遅くし、水和されたEVの画像化に使用する必要があります。走査プローブへの非特異的結合は、イオン種の存在下で減少する。従って、水和EVを撮像する場合には、DI水の代わりにPBSなどの緩衝媒体で基板を覆うことを好ましい。
表面固定化の重要性
改変基板上のEVの一貫した予測可能な固定化は、AFM結果の変動の主な原因を除去します。スキャンからデータ分析まで、ダウンストリームのすべてのステップは、インストルメンテーション、プローブ、スキャンパラメータ、およびデータ分析シーケンスとアルゴリズムの選択によってより簡単に制御されます。ユーザーは、生物学的サンプルおよびEV分離プロトコルにおける上流の変動性を認識する必要があります。
空気中の乾燥した小胞を特徴付けることを目的としている場合でも、液体サンプルから改変されたマイカの表面にEVの表面固定を行うことをお勧めします - 小胞は避けられないほどの基板に堆積するので、必要性は明らかではありません。液体が蒸発する。実際、液体からのEVの静電固定化の前提となるマイカの表面電荷を変更せずに得られた乾燥EVのAFM結果は、過去19、20、21で報告されています。.しかし、EVが液体試料から表面に固定されていない場合、蒸発による受動的な堆積は、コーヒーリング効果22と総称されるアーティファクトを生成する。乾燥液が後退するように生じる2つのそのようなアーティファクトは、負に帯電したガラス表面上の蒸発によって堆積した血清エキソソームのSEM画像(図13A)に示されている。沈殿した小胞の表面濃度の有意な変動はすぐに明らかである。図13Bで定量された第2のアーティファクトは、乾燥試料の周囲の異なる領域における小胞サイズのかなりの変動である。これらのアーティファクトを考えると、乾燥液から受動的に沈着した小胞のAFM特性を示すと、現在乾燥した液体サンプルによって最初に占有されていた表面積全体がスキャンされない限り、偏ったまたは矛盾した結果が生じる可能性があります。
基板上の小胞をしっかりと固定せずに得られた乾燥サンプルをイメージングする際には、2つの追加の問題を考慮する必要があります。私たちのプロトコルは、小胞が液体サンプルから固定された後、DI水で表面を完全に洗浄するようにユーザーに指示することを思い出してください。このステップは、かなりの浸透性を持つ複雑な生体流体の蒸発中にイオンおよび他の非小胞性溶質が表面沈着物を形成するのを防ぐことを意図している。EVが固定されていない場合、徹底的な洗浄は、表面から多数の小胞を取り外し、結果に偏りを与え、解析のためにあまりにも少ない粒子を残す可能性があります。もう一つの一般的な困難は、AFMイメージングの前に改変されたマイカ表面にEVを固定することによって低減され、プローブ23への粒子の接着およびこの現象によって引き起こされる誤解を招くアーティファクトである。
固定化EVの表面密度の制御
プロトコルで識別された2つの容易に制御可能な要因は、ユーザーが改変マイカ基板上の固定化されたEVの表面濃度をカスタマイズすることを可能にする:液体サンプル中の小胞の濃度およびサンプルが上でインキュベートされる時間基板。液体中の高いインキュベーション時間と高濃度のEVで達成される固定化小胞の高密度は、スキャン中に分析された小胞の数を増加させ、AFMの分析によって到着した結論の統計的な力を増加させるデータ。同時に、粒子が基板の介在領域なしで表面全体をしっかりと覆う図10Cに示すように、過度に高密度な表面濃度は、画像解析と結果の解釈を複雑にする密接に間隔をあけたパーティクル間の相互作用によって引き起こされるアーティファクトのスキャンにつながる可能性があります。
EVの静電スクリーニングと流体力学移動の影響
固定化されたEVの表面濃度を、影響を与える要因の関数として透過的に制御することで、ユーザーは研究の特定のニーズを満たすために実験条件をカスタマイズすることができます。カスタマイズを行う際には、静電表面固定化が生体流体のイオン強度に影響される輸送制限されたプロセスであることを認識することが重要です。
イオン性および正に帯電した種の濃度は、表面および小胞電荷がスクリーニングされるデバイの長さに逆に影響を与える。この長さを超えて、静電力は無視できる。基板の静電引合所の境界層は、DI水中よりもイオン性が豊富なPBSではるかに小さくなります。この違いは、静電アトラクションが感じられる液体の層を枯渇させるために必要な時間に対応する短いインキュベーションの後、DI水中の懸濁液から固定されたEVの表面密度がPBSよりも高くなることを意味します。EVの濃度が両方の液体で同じであると仮定すると、サスペンション。別の言い方をするが、それ以外の場合は同一の条件下でPBSよりもDI水中の厚い引アトラクション層を枯渇させるために、より多くの小胞を固定化する必要があります。
小胞が境界層から枯渇した後、固定化は完全に輸送制限されたプロセスになります。この体制では、粘度が同じで輸送が完全に拡散している限り、堆積率は中断媒体(例えば、DI水またはPBS)に依存しない。しかし、引力境界層への小胞の輸送は完全に拡散しない場合がある。例えば、AFM基板上のセシクルドロップ中のサンプルがインキュベーション中に部分的に蒸発した場合、ドロップ内部の流体は蒸発駆動の流れに供され、基板に向かう小胞の輸送は、両方とも、拡散的で対流的な貢献。蒸発が適切に制御されていない場合、対流輸送の寄与は相当なものとなり、固定化率は予想以上に高くなります。対流輸送の影響は、それ自体が液体のイオン含有量に依存する引合層の厚さに応って変化します。さらに、蒸発は、溶液中にEVを集中させることにより、基板上の小胞固定化を強化する。EV濃度が高いほど、引力層と隣接する液体との間の濃度勾配が増加し、基板に向かって小胞の移動に大きな熱力学的駆動力を生み出す。
固定化小胞は、バイアスを持つ液体試料を表してもよい。拡散によって固定化速度が制限される場合、小胞サイズが小さい小胞は、それを取り巻くコロナ層の大きさと厚さの組み合わせによって決定される(図1)。その高い移動性のために魅力の層。その結果、初期の枯渇期間の後、流体力学的に小さいEVは、液体サンプル中のEV集団への寄与と比較して基板上で過剰に表現されます。小さい流体力学サイズは、コロナ層3の厚さの不均一性のために小胞サイズが小さいEVを自動的に指ささないことに注意してください。偏った表現は、基板上の固定化によって液体中のEVの全人口を枯渇させる長いインキュベーションで回避されます。ユーザが生体流体から全てのEVを固定化することを目指す場合、固定化された小胞を用いて表面の過度に密なカバレッジを回避するために、プロトコルで示唆される範囲以下の液体中のEV濃度を低下させる必要があるかもしれない。
基板上のEVの変形
彼らのネイティブ水和状態および乾燥後の細胞外小胞は、プロトコルに記載されているように、AFMによって特徴付けることができる。マイカ表面にEVを固定する静電力24も、溶液中に存在する球状幾何学から形状を歪める。固定化されたEVの大きさや形態に対する乾燥の影響は、サンプルを乾燥させる前後に同じ表面積を再スキャンすることによって分析することができる。
乾燥したEVの形状に対するサンプル調製の影響を調べることは有益である。静電固定化されたEVは、乾燥後に高度にオブレートされた形状を維持しますが、乾燥によってさらに平坦化されます。乾燥した小胞の表面上の高さは図12Aよりも小さくなり、そのフットプリント面積は増加します(データは示されていません)。一方、小胞が液体蒸発中に受動的に堆積し、表面に事前に固定化しないと、SEM画像や最近ではAFMで長い間観察されてきたように、乾燥時にカップ状の形状の幾何学を達成する傾向があります。スキャン。このカップ状の形状は、表面乾燥時の毛細血管力の不均一性によって引き起こされるサンプル調製物25として認識され、図141で機械的に説明されている。
AFMデータの画像解析と解釈
EVの形状を歪める静電力や毛細血管力に対する応答は、EVの構造的・構成的特性に関する貴重な情報を提供します。例えば、AFMデータから抽出された変形サイズおよび形状などの生物物理学的特性の多次元セットは、最近、異なる宿主細胞によって分泌されるエキソソームを区別する実現可能性を実証するために用いられた5。歪みを考慮して補正することもできます。例えば、AFMデータを使用して、固定化されたエキソスメス3と同じ体積をカプセル化する球体の直径を推定することにより、溶液中の小胞の球状サイズを特徴付ける方法を示した。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、国立科学財団(賞番号IGERT-0903715)、ユタ大学(化学工学種子助成学科および大学院研究フェローシップ賞)、スコルコヴォ科学研究所からの財政的支援を認めています。と技術(スコルテックフェローシップ)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
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