Summary
Sıvı numunelerden ekzozomların ve hücre dışı veziküllerin etiketsiz immobilizasyonu ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile görüntülenmesi için adım adım bir prosedür tanımlanmıştır. AFM görüntüleri çözeltideki veziküllerin boyutunu tahmin etmek ve diğer biyofiziksel özellikleri karakterize etmek için kullanılır.
Abstract
Ekzozomlar ve diğer ekstrasellüler (EVs) lipid membran vezikül, membran proteinleri ve diğer moleküller tarafından yüzey dekorasyonu ve rna içeren bir ana hücreden miras farklı luminal içeriği oluşan moleküler kompleksleri, proteinler ve DNA'lar. Vezikülboyutuna ve yüzey süslemelerinden oluşan koronal tabakasının büyüklüğüne bağlı olarak EV'lerin hidrodinamik boyutlarının karakterizasyonu rutin hale gelmiştir. Exozomlar için, EVs en küçük, hidrodinamik ve vezikülboyutları arasındaki göreli fark önemlidir. Vezikül boyutlarının kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme siperasyonu, altın standart bir teknik olan, cihazın maliyeti, numune hazırlama, görüntüleme ve veri analizi ve sık sık görüntülerde gözlenen parçacıkların az sayıda. Yaygın olarak kullanılabilir ve erişilebilir bir alternatif atomik kuvvet mikroskobu (AFM), üç boyutlu geometri, boyut ve ekstrahücre içi veziküllerin diğer biyofiziksel özellikleri hakkında çok yönlü veri üretebilir. Geliştirilen protokol, bu analitik aracı kullanırken kullanıcılara rehberlik eder ve AFM tarafından EVs analizi için iş akışını özetler, bu da sulu veya kurutulmuş formdaki görüntüleme E'leri için numune hazırlamasını içerir, elektrostatik immobilizasyon bir substrat, veri toplama, analizi ve yorumlanması üzerine veziküller. Temsili sonuçlar, modifiye mika yüzeyindeki EV fiksasyonunun öngörülebilir, özelleştirilebilir olduğunu ve kullanıcının çok sayıda vezikül için boyutlandırma sonuçları elde etmesini sağladığını göstermektedir. AFM verilerine dayalı vezikül boyutlandırmasının kriyo-TEM görüntüleme ile uyumlu olduğu bulunmuştur.
Introduction
Ekstrasellüler veziküller (EVs) kan, idrar, tükürük, süt ve amniyotik sıvı da dahil olmak üzere tüm vücut sıvıları mevcuttur. Ekzozomlar, endozomal biyogenez, endozomal yolun belirteçleri ve tüm EV'ler arasında en küçük boyut ile diğer EV'lerden farklılaşan bir bölge sınıfı oluştururlar. Ekzozomların büyüklüğü genellikle çalışmalar arasında önemli bir değişkenlik ile bildirilmiştir. Boyutlandırma sonuçlarının yönteme bağımlı olduğu, ev boyutlarını tahmin etmek için farklı analitik tekniklerle kullanılan fiziksel ilkeler arasındaki farkı yansıttığı bulunmuştur1,2. Örneğin, nanopartikül izleme analizi (NTA) ― en yaygın olarak kullanılan boyut karakterizasyon tekniği ― evs'lerin boyutunu, çözeltideki EV'lerin Brownian hareketliliğine karşı direnci karakterize eden hidrodinamik çapları olarak tahmin eder. Bir vezikül daha büyük bir hidrodinamik çapı sıvı düşük hareketlilik anlamına gelir. Veziküllerin etrafındaki koronal tabaka, membran yüzeyine demirlemiş veya adsorbe edilmiş yüzey proteinlerinden ve diğer moleküllerden oluşan, hareketliliği önemli ölçüde engeller ve EVs'lerin hidrodinamik boyutunu artırır. Göreceli olarak, bu artış özellikle ekzozomlar için büyüktür 3, Şekil 1'degösterildiği gibi .
Kriyojenik iletim elektron mikroskobu (kriyo-TEM) görüntüleme, sulu hallerinde vezikül boyutları ve morfolojisini karakterize etmede belirleyici bir tekniktir. Ancak, enstrümantasyon yüksek maliyet ve doğru sulu EVs görüntü alternatif tekniklerin keşfi motive kullanmak için gerekli özel uzmanlık. Edinilmiş kriyo-TEM görüntülerinde gözlenen veya karakterize edilen nispeten az sayıda EV bu tekniğin bir diğer önemli dezavantajıdır.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yüzeydeki parçacıkların görüntüsünü canlandırmak için substrat boyunca bir sonda tarayarak sulu veya kurutulmuş EVs4,5,6 üç boyutlu topografya görselleştirir. EVs'i AFM ile karakterize etmek için protokolün temel adımları bu çalışmada özetlenmiştir. Sıvı vezikülleri görüntülemeden önce, bir substrat üzerinde ya işlevsel bir yüzeye tethering tarafından immobilize edilmelidir, bir filtre içinde bindirme, ya da elektrostatik çekim7. Pozitif yüklü bir substrat üzerindeki elektrostatik fiksasyon, negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların immobilizasyonu için özellikle uygun bir seçenektir. Ancak, yüzeydeki hücre dışı vezikülleri hareketsiz hale getiren aynı elektrostatik kuvvetler de şekillerini bozar, bu da post-görüntüleme veri analizini gerekli kılar. Bu noktayı, yüzeyde hareketsiz hale getirilen ekzozomların çarpık şekli ne kadar çarpık şekli ne kadar aparat lara dayanarak çözümdeki küresel veziküllerin boyutunu tahmin eden algoritmayı tanımlayarak ayrıntılı olarak ele alıyoruz.
Geliştirilen protokolde, veziküllerin sağlam elektrostatik immobilizasyonu için prosedür sunulur ve sulu veya kurutulmuş durumlarda atomik kuvvet görüntüleme gerçekleştirmek için gerekli adımları takip eder. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonunu etkileyen faktörler tanımlanır. Çözeltide farklı yoğunlukta EV'lere sahip numuneler için elektrostatik immobilizasyonun nasıl gerçekleştirilenekadar gerçekleştirildiği konusunda kılavuz verilir. Yeterince çok sayıda hareketsiz veziküle dayalı farklı biyofiziksel özelliklerin ampirik olasılık dağılımlarının tahmin edilmesine izin veren deneysel koşulların seçimi tartışılmıştır. AFM verilerinin post-görüntüleme analiziörnekleri verilmiştir. Özellikle, immobilize EVs AFM karakterizasyonu dayalı çözüm veziküllerin boyutunu belirlemek için bir algoritma açıklanmıştır. Temsili sonuçlar, AFM tarafından kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile vezikül boyutlandırmasının tutarlılığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. EVs bir biyosıvı dan izolasyon
- Diferansiyel ultrasantrifüj8,yağış veya boyut dışlama kromatografisi9gibi yerleşik yöntemlerden biri ile EVs izole .
- Beklenen yüzey ve luminal biyobelirteçlerin varlığını ve preparatın çapraz kontaminasyonunu gösteren biyobelirteçlerin eksikliğini doğrulayın. Elektron mikroskobu ile izole edilmiş parçacıkların lipid çift katmanlı morfolojisini doğrulayın.
NOT: Ekzozomları izole ederken, nanopartikül izleme analizi (NTA) veya dinamik ışık saçılımı ile ölçülen hidrodinamik boyut dağılımı beklenen aralıkta olmalıdır. EV ve ekzozom yalıtımı ayrıntıları bu protokolün kapsamı dışındadır. Seçilen yöntem deneysel sorulara ve çalışmanın amacına bağlıdır10. Aşağıdaki adımlar, ticari olarak mevcut bir yağış kiti(Tablo Malzemeler)kullanarak MCF-7 meme kanseri hücrelerinin büyüme ortamı ndan yağış ile ekzozomları zenginleştirmek için prosedürün somut bir örnek sağlar. - Hücre kültürü genişlemeden önce, sıvı azot MCF-7 meme kanseri hücreleri saklayın. Hücreleri alt kültüre eritin.
- Aseptik uygulamaları takiben, 150 mm plakaüzerinde hücre kaplaması yapın. Eagle'ın minimum esansiyel orta, 0.01 mg/mL insan rekombinant insülinve %10 ekzozomsuz fetal sığır serumundan oluşan büyüme ortamını kullanın.
- Kültürü %95 hava ve %5 CO2 ile derecelendirin ve 37 °C'dekuluçkaya yatırın.
- Hücreler yerleştikten sonra (kaplamadan yaklaşık 24 saat sonra), ortamı değiştirin. Plakayı 1:10 oranında bölün ve her biri 20 mL ortam içeren on plakayı kültüre alın.
- Bu plakaların 9'undan (180 mL) ~70−%80'inde hücreler büyüme aşamasındayken biraraya gelen hasat ve havuz ortamı.
- Ortamı 60 mL ve 120 mL'ye bölün, 30 mL/tüpe bölünve 3000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
- Her tüpten süpernatant'ı yeni bir steril 50 mL tüpe aktarın ve ekzozom izolasyonunu gerçekleştirin.
- Yayınlanan protokollere göre ekzozomları yağışla izole edin (örneğin, referans11)veya ticari bir izolasyon kiti(Malzeme Tablosu)kullanılıyorsaüreticinintalimatlarına uyun. İkinci durumda ilk adım olarak, 15 dk için 3.000 x g santrifüj hücre orta.
- Çökeltme çözeltisini (1:5 hacim oranı) supernatant'a ekleyin, karıştırın ve bir gecede soğutun.
- Oda sıcaklığında 30 dk için 1.500 x g santrifüj. Santrifüjden sonra supernatant atın.
- Kalan ekzozom peletini 1.500 x g'da5 dk daha döndürün. Pelet rahatsız etmeden, aspirasyon ile kalan yağış çözeltisi çıkarın.
- Peleti 100−500 μL'lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) tamponuna yeniden askıya alın ve aşağı akım analizi için gerektiği gibi birden fazla aliquot'a bölün.
- AFM görüntüleme için izole ekzozomların yüzeye hemen immobilizasyonuna geçin. Gerekirse, dondurma-çözülme döngüsü sırasında numunenin zarar görmesini önlemek için önlemler alırken daha sonra kullanım için -80 °C'de aliquots dondurun.
2. Hücre dışı veziküllerin yüzey fiksasyonu
- AFM/taramalı tünel mikroskobu (STM) manyetik paslanmaz çelik numune diskine mika diski sıkıca takmak için güçlü çift taraflı bant, epoksi veya alternatif bir yapıştırıcı kullanın.
- Mika diskini keskin bir jilet veya yardımcı bıçak kullanarak veya üst yüzeye yapışkan bant takarak ve daha sonra bir malzeme tabakasını çıkarmak için kırparak ayırın.
NOT: Her iki yöntem de daha önce ortama maruz kalmış ince bir mika tabakasını çıkararak bakire bir yüzey ortaya çıkarmalıdır. İşlemden sonra mikanın AFM/STM metal numune diskine bağlanması sağlam kalmalıdır. - Oda sıcaklığında, mikanın üst yüzeyini 10 00 000 l 100 mM NiCl2 çözeltisi ile tedavi edin, bu da yüzey yükünü negatiften pozitife değiştirin.
- Tüy bırakmayan silme veya lekeleme kağıdı ile Blot NiCl2 çözeltisi. Mika yüzeyini deiyonize (DI) suyla 3 kat yıkayın ve kuru bir azot akışı ile kurulayın.
NOT: Modifiye edilmiş yüzeyi AFM ile tarayabilmek ve kirletici maddelerden arındırılmış olduğunu doğrulamak iyi bir uygulamadır. - AFM numune diskini bağlı yüzeymodifiye mikaile bir petri kabına yerleştirin.
- Çözeltinin mL başına 4,0 x 109 ile 4,0 x10 10 10 partikülarasında bir konsantrasyon elde etmek için 1x PBS ile 1.14 adımdan ekzozom numunesini seyreltin. NTA kullanarak seyreltilmiş parçacık konsantrasyonu doğrulayın.
- Seyreltilmiş ekzozom çözeltisinin 100 μL'sini pipetten boşaltarak mika yüzeyinde sessile bir damla oluşturun.
- Petri kabının kapağını yerleştirin ve numune buharlaşmasını azaltmak için bir parafin filmi ile kapatın. Numuneyi 4 °C'de 12−18 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: Hareketsiz ekzozomların yüzey yoğunluğu, kuluçka süresi ve sıvıdaki EV konsantrasyonu ile artacaktır. Numunede daha düşük konsantrasyonlarda ekzozomlar varsa daha uzun kuluçka süresi gerekebilir. - Kuluçkadan sonra, yüzeyi bozmadan numunenin %80−90'ını aspire edin. Bu noktada, ekzozomlar mika substrat üzerinde elektrostatik olarak hareketsiz hale gelecektir.
- Sulu EV'leri görüntülemeden önce yüzeyi 1x PBS ile durula. 3x'i tekrarlayın. Durulama işlemi boyunca numunenin sulu tutulmasına özen tin.
- Mika yüzeyini 1x PBS ile yıkadıktan sonra numuneyi kapsayacak şekilde %80−sıvının %90'ını ve pipet ~40 μL taze 1x PBS'yi çıkarın.
- Kurutulmuş EVs görüntülerken, DI su ile substrat durulayın. 3x'i tekrarlayın.
NOT: DI suyu ile durulama tuz kristalleri oluşumunu ve yüzeyde solutes birikimini önleyecektir substrat kurur gibi. - Kurutulmuş EVs görüntüleme önce, yüzeye dokunmadan mümkün olduğunca çok sıvı aspire ve kuru azot akışı ile geri kalanı kuru.
3. AFM görüntüleme
- Kurutulmuş EVs görüntü için, dokunarak ve temassız görüntüleme modlarında havada tarama için tasarlanmış bir cantilever seçin ve sonda tutucu üzerine monte.
NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken Malzeme Tablosu'nda listelenen bir örnek kantilinin özellikleri (123 μm uzunluk, 40 μm genişlik, 7 nm uç yarıçapı ve 37 N/m yay sabiti) kılavuz olarak kullanılabilir.- AFM sahnesine 2.13. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, numuneyi sahnede hareketsiz hale getirecektir. Hazırlık ve sahne termal olarak dengelemek için zaman bekleyin.
- Mika'nın yüzeyinin yeterince geniş bir alanını tmak için dokunma modunu kullanın. Örneğin, 5 x 5 μm'lik bir alan seçin, 512 satırda ~1 Hz'lik bir taramaya alın. Topografya ve numunenin yüzey özellikleri hakkında tamamlayıcı bilgiler sağladıkları için hem yükseklik hem de faz görüntüleri edinin.
NOT: Görüntülenmiş alan ve görüntüyü oluşturmak için seçilen satır sayısı ile tarama süresi artacaktır ancak saniyede taranmış satır sayısı olarak tanımlanan tarama hızı azalır. Hızlı tetkik hızları görüntü kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, rastering hızı yargı edinim süresi ve görüntü kalitesi arasındaki dengeyi dengelemelidir.
- Sulu vezikülleri görüntülemek için yumuşak, sulu numuneleri taramak için uygun bir kantil i seçin ve kantili sıvılarda tarama için tasarlanmış bir sonda tutucuya monte edin.
NOT: Mevcut AFM enstrümantasyonuile uyumlu bir prob seçerken, Malzeme Tablosu'nda listelenen probun özellikleri (175 μm nominal uzunlukta üçgen kantil, 22 μm genişlik, 20 nm uç yarıçapı, 0,07 N/m yay sabiti ve 4 ila 8 kHz aralığında sürücü frekansı ile görüntüleme için optimize) bir kılavuz olarak kullanılabilir.- Tarama sırasında sıvıya hava kabarcıkları girme olasılığını azaltmak için kantilin ucunu 1x PBS ile ısla.
- AFM sahnesine 2.11.adımdan gelen hazırlığı yerleştirin. Manyetik paslanmaz çelik numune diski, yüzeyinde immobilize eVs içeren ekli mika hareketsiz hale getirecektir.
- Hazırlık ve AFM aşamasının termal olarak dengelemesine zaman verin.
- Dokunma modunda sulu mika yüzeyini görüntüleyin. Hem yükseklik hem de faz görüntülerini edinin.
NOT: Görüntüleme kalitesi enstrümantasyon, seçili prob ve tetkik parametrelerinden etkilenir. Tarama koşulları optimize edilirken, aşağıdaki seçenekler başlangıç noktası olarak kullanılabilir: 5 x 5 μm alan ~0.8-1.0 Hz tarama hızı ve 4 ila 8 kHz arasında sürücü frekansı ile 512 satırda taranmış.
4. Görüntü analizi
NOT: Elde edilen yükseklik görüntülerine aşağıdaki veri işleme ve analiz adımları uygulanır. Benzer bir yordam faz verilerini çözümlemek için uyarlanabilir. Aşağıdaki açıklama Gwyddion12,gnu Genel Kamu Lisansı altında kullanılabilir ücretsiz ve açık kaynak yazılım için özeldir. Benzer özellikler alternatif yazılım araçlarında mevcuttur.
- Veri İşlemi, SPM modları, İpucu gidin ve Model İpucu (Şekil 2)seçin. Örneği tarayıp Tamam'ıtıklatın.
- Yüzey rekonstrüksiyonu gerçekleştirerek uç erozyonu yapılarını düzeltin. Görüntüyü açın. Menüden Veri İşlemi, SPM modları, İpucu,ardından Yüzey Yeniden Yapılandırmasını seçin ve Tamam 'ı(Şekil 3)tıklatın.
- Görüntüleme düzlemini, alt tabakadaki eğimi taraya verisinden çıkararak laboratuvar XY düzlemine uyacak şekilde hizala. Bu görevi gerçekleştirmek için Veri İşlemi, Düzey'i seçin ve Düzlem Düzeyi 'ni seçin (Şekil 4).
- Veri İşlemi, Verileri Düzelt'i seçerek görüntünün satırlarını hizalayın ve ardından Satırları Hizala'yıseçin. Çeşitli hizalama seçenekleri mevcuttur (Şekil 5). Örneğin, Ortanca, her tbmm satırının ortalama yüksekliğini bulan ve verilerden çıkaran bir algoritmadır.
- Veri İşlemi,Verileri Düzelt ve yara izi olarak bilinen yaygın tarama hatalarını ortadan kaldıran Scars (Şekil 6)seçeneğini belirleyin.
- Mika yüzeyini sıfır yükseklikte hizala, Z = 0, Veri İşlemi'nden erişilebilen Seviye açılır menüsünde Düztaban Tabanı'nı seçerek(Şekil 7).
- Tanecikler açılır menüsünde Eşik tarafından İşaretle kullanarak taranmış yüzeydeki EV'leritanımlayın (Şekil 8A). Bu algoritma, yüzeyimsiz ekzozomları, sıfır yüzey yüzeyi yüzeyinden kullanıcı tarafından seçilen eşiğin üzerindeki yüksekliğe göre çıkıntılı parçacıklar olarak tanımlar. 1 ile 3 nm arasındaki aralıkta, arka plan parazitinin çoğunu ortadan kaldıracak bir eşik seçin. Daha küçük eşikler daha temiz arka plan ile kullanılır.
NOT: Şekil 8A'daki eşik 1.767 nm'dir. Bu eşik ile MCF-7 ekzozom tanımlamasonucu Şekil 8B'degösterilmiştir. Gwyddion otomatik eşik (Otsu yöntemi), kenar algılama ve havza algoritması da dahil olmak üzere görüntüdeki vezikülleri otomatik olarak tanımlamak için algoritma olarak eşik çeşitli alternatifler sunuyor.
NOT: Parçacık aglomeraları, AFM görüntüde mevcutsa, maskelenebilir ve analizdışı edilebilir. - Tanecikler menüsünden erişilebilen kullanılabilir Dağılımalgoritmalarını kullanarak tanımlanan EVs'lerin geometrik ve boyutsal karakterizasyonunu gerçekleştirin.
NOT: Gwyddion, scalar değerli, areal, volumetrik ve immobilize edilmiş EVs'nin diğer özelliklerinin sulu veya susuz bir durumda dağılımını değerlendirmek için araçlar sağlar. Skaler değerler özelliğinin bir örneği Şekil 9'da gösterilmiştir ve bu da tanımlanan her ekzomun ayak izi içindeki maksimum yüksekliklerin dağılımını verir. - Diğer hesaplama araçları ve özel bilgisayar programları tarafından özel analiz için Gwyddion'dan AFM verilerini dışa aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EVs yüzey fiksasyonu görüntüleme dizisinde kritik bir adımdır. Negatif zeta potansiyeline sahip olduğu bilinen ekzozomların elektrostatik yüzey immobilizasyonu mikanın substratı pozitif yüzey yüküne sahip olacak şekilde değiştirildikten sonra sağlam bir şekilde ortaya çıkar. NiCl2 ile pozitif yüzey değişiklikleri sağlamak için tedavi olmadan, substrat üzerinde EVs immobilizasyon etkisiz olduğu bulunmuştur. Şekil 10A'dakiyükseklik görüntüsü, PBS'nin mL başına 2,59 x 1010 vezikül içeren MCF-7 ekzozom numunesi alındıktan sonra havada elde edilen yeni yarıklı mikanın değiştirilmemiş yüzeyinde 12 saat kuluçkaya yatırıldı, DI su ile temizlendikten sonra yüzey. Şekil 10A'da görülen veziküller, büyük olasılıkla, yüzeye sabitlenmemiş vezikülleri yeniden askıya alan ve sonra buharlaşırken substrat üzerinde dejenere olan DI suyunun eksik aspirasyonunun sonucuolarak ortaya çıkar.
Nikel klorür ile yüzey yükü değiştirerek sonra, bu yüzey tedaviden sonra kirletici ler serbest kalır onaylamak için tavsiye edilir. Şekil 10B'deki yükseklik görüntüsü (havada elde edilen) NiCl2 ile arıtıldıktan ve daha sonra üç kez DI suyuyla yıkandıktan sonra temiz bir yüzey örneği verir. Katyon türevi yüzeyinin pürüzlülüğü 0,3 nm'nin altındaydı, bu da bir önceki raporolan 13ile tutarlıdır.
YÜZEY yükü modifikasyonunun MCF-7 ekzozomlarının fiksasyonunun etkinliği üzerindeki dramatik olumlu etkisi Şekil 10C,Dile gösterilmiştir. Bu iki panel, daha önce Şekil 10A'dagörüntülenmiş olan numuneden sonra havada elde edilen yükseklik taramalarının, nikel klorür ile işlenmiş yüzeyde sırasıyla 24 saat ve 12 saat kuluçkaya yatırıldığını göstermektedir.
Belirli bir numunenin işlenmiş yüzeyde kuluçkaya yatırılışı, hareketsiz eV'lerin yüzey konsantrasyonunu (alan başına veziküller) belirler. Şekil 10C'deki yükseklik görüntüsü, tanımlanan MCF-7 ekzozom numunesi 24 saat süreyle inkübe edildikten sonra elde edilen immobilize veziküllerin aşırı yoğun yüzey kapsama durumunu göstermektedir. Bir dizi algoritma, görüntü düzeltme ve veri çözümlemesi gerçekleştirmek için taneler arasında yeterli boş alt tabakaya sahip olmaya dayanır. Örneğin, substratı sıfır düzleme seviyeleme ve kaydırma, satır düzeltme ve tanelerin hacminin tahmini, doğru hesaplamalar gerçekleştirmek için araya giren düz yüzeye ihtiyaç duyar. Hareketsiz veziküllerin konsantrasyonu Şekil 10C'dekikadar yüksek olduğunda, bu algoritmalar güvenilir bir şekilde çalışmaz. Şekil 10D'deaynı MCF-7 örneğinden hareketsiz hale getirilmiş veziküllerin yeterli yüzey konsantrasyonunun bir örneği, daha kısa (12 saat) kuluçkadan sonra elde edilen yükseklik görüntüsünde gösterilmiştir.
Edinilen ham AFM verilerinin işlenmesinin ardından sık karşılaşılan tarama hatalarını düzeltmek için gereklidir. Aşağıdaki açıklama Gwyddion'a özgüdür. Benzer işlevler diğer AFM/SPM veri analiz araçlarında da kullanılabilir.
Gwyddion içinde, Düzlem Seviyesi işlevi substrat bir eğim düzeltmek için kullanılır. Bu tür arka plan düzeltme, önce görüntüdeki tüm veri noktalarını kullanarak substrat düzlemini bularak ve daha sonra ham verilerden çıkarılarak gerçekleştirilir. Tarama satırları boyunca düzeltme Hiza satırları işlevi tarafından gerçekleştirilir. Örneğin, uygulanan algoritmalardan biri, her bir tbmçal çizgisinin ortanca yüksekliğini hesaplayarak ve ardından sonucu karşılık gelen görüntü veri satırından çıkararak hizalamayı gerçekleştirir. Geri bildirim döngüsündeki yerel hataların katkısı, hizalanan verilerdeki boşlukları dolduran ve bitişik tarak satırlarındaki verileri karşılaştırarak izleri ortadan kaldıran Scars'ı Kaldır işlevi uygulanarak kaldırılabilir. Substratın Z = 0 yüksekliğine kayması, taneleri ve diğer özellikleri maskeledikten sonra yüzeyin bir yüzü ve polinom tesviyesinin bir kombinasyonu ile gerçekleştirilebilir. Gwyddion'un Flatten Base aracı bu görevi bağımsız olarak veya kullanıcı tarafından belirtilen bir maskeyle gerçekleştirir. Açıklanan arka plan ve çizgi düzeltmelerinden sonra, elektrostatik fiksasyonlu veziküller Mark Grains işlevini çalıştırarak substrat üzerinde tanımlanabilir.
Şekil 11A ve Şekil 11B, mika yüzeyinde hareketsiz hale getirilen ve dokunma modu kullanılarak PBS'de elde edilen sulu MCF-7 ekzozomlarının yükseklik ve faz görüntülerini göstermektedir. Mark Grains fonksiyonunun Eşik algoritması kullanılarak taranmış alanda toplam 561 sulu vezikül tespit edildi ve eşik değeri ~%20 olarak belirlendi. Probun yanıtının sürücü frekansındaki faz gecikmesi yumuşak numunelerde lokalize sertlik değişimlerine karşı hassastır. Şekil 11A,B'degörülen yükseklik ve faz görüntüleri arasındaki tutarlılık, bu nedenle, resimde görülen tanelerin gerçekten de substrat üzerinde hareketsiz hale getirilen yumuşak veziküller olduğunun önemli bir teyididir.
Şekil 11C, Şekil 11A'dabeyaz çizgi üzerinde bulunan ekzozomlar aracılığıyla yükseklik görüntüsünün kesitini gösterir. Bir biyoakışkan ekzozomlar küresel geometri1olsa da,14,15,16, substrat üzerindeki şekilleri ciddi pozitif yüklü elektrostatik çekim tarafından bozulur Yüzey. Elektrostatik hareketsiz veziküllerin oblate gözleme benzeri geometrisi Şekil 11A'dakutulanmış bir ekzozomun yakın çekim yükseklik görüntüsü (ve kesiti) ile Şekil 11D'de daha da gösterilmiştir. Karşılık gelen faz görüntüsü Şekil 11E'degösterilmiştir. AFM tarar'nda tanımlanan 561 sulu veziküllerin tümü için yüzeyüzerindeki tepe yüksekliklerinin ampirik olasılık yoğunluğu fonksiyonu (pdf) Şekil 12A'dagösterilmiştir. Bu dağılım için ortalama değeri 7.9 nm, yaklaşık iki kez bir fosfolipid bilayer kalınlığı eşittir17 deforming kuvvetleri yokluğunda.
Hareketsiz bir ekzozomtarafından işgal edilen substrat üzerindeki alan, çapı vezikülün "kütle merkezinden" mika yüzeyindeki sınırına eşit olan bir daire olarak yaklaşıldı. Bu projeksiyon çaplarının dağılımı Şekil 12A'da gösterilmiştir ve ortalama 69.6 nm'ye eşittir. Elde edilen yükseklik ve çap dağılımları, elektrostatik yüzey immobilizasyonunun hareketsiz ekzozomların çarpık şekli üzerindeki önemli etkisini daha da ölçer.
Protokol prosedürlerinin sağlamlığı ve tekrarlanabilirliği, aynı MCF-7 örneğinin numune hazırlanmasından görüntülemeye kadar üç kez yeniden analiz edilerek doğrulandı ve her biri istatistiksel olarak Şekil 12'degösterilensonuçlara benzer sonuçlar üretmektedir.
Elektrostatik kuvvetlerin neden olduğu immobilize veziküllerin deformasyonu, görüntülenen EVs'lerin özelliklerine dair bir fikir sağlamak için telafi edilebilir veya yorumlanabilir. Örneğin, AFM verileri çözeltideki veziküllerin küresel boyutunu tahmin etmek için kullanılabilir. Başlangıç noktası olarak, immobilize veziküllerin membran zarfları tarafından kapsüllenen hacmi hesaplayabiliriz. Hacim, tanımlanan veziküllerin yüzey seviyesi ile altlarındaki substrat yüksekliği arasındaki farkın bütünleştirilmesiyle bulunur. Veziküllerin altındaki substrat seviyesine doğrudan erişilebilir değildir ancak vezikülleri çevreleyen boş substrat için laplace veya alternatif veri noktaları nın interpolasyonu ile tahmin edilebilir. Gwyddion içinde, bu tür hacim hesaplaması Çeşitli Tane Özelliklerinin Dağılımı fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Gwyddion'dan dışa aktarılan sonuç, hacim eşdeğeri kürelerin çaplarına eşlenebilir.
Açıklanan algoritmanın 561 analiz edilmiş sulu MCF-7 veziküller için AFM verilerine uygulanması, Şekil 12B'degösterilen hacim eşdeğeri kürelerin çaplarının dağılımını ortaya çıkarmaktadır. Bu dağılım, mika yüzeyindeelektrostatik fiksasyondan önce doğuştan gelen küresel büler formdaki membran veziküllerinin büyüklüğünü tahmin eder. AFM verilerinin analizinden elde edilen vezikül boyutlandırması, aynı numunenin kriyo-TEM görüntüleme sonuçları ile karşılaştırıldı ve yakın anlaşma3 (Şekil 12B)bulundu. NTA tarafından ölçülen hidrodinamik çapların elde edilen vezikül boyutlarıile karşılaştırılması(Şekil 1) ekzozomların hareketliliğinin AFM ve kriyo-TEM'den belirlenen veziküllerin boyutundan beklenenden çok daha küçük olduğunu göstermektedir. Ölçüm. Hidrodinamik ve vezikül boyutları arasındaki fark ekzozomal vezikülleri çevreleyen koronal tabakanın kalınlığını karakterize eder.
Şekil 1: EVs hidrodinamik ve geometrik çaplarının karşılaştırılması. Ekzozomal vezikülgeometrik boyutu önemli ölçüde bir sıvı içinde difüzyon belirlenen hidrodinamik boyutundan daha küçüktür. Fark, membran konjuge ve adsorbe moleküllerin oluşturduğu ve EVs'lerin hareketliliğini engelleyen koronal tabakadır. Bu şekil referans3'ten değiştirilir ve izinle yeniden yazdırılır.
Şekil 2: AFM sondasının özellikleri. AFM sondasının geometrisi ve boyutları Model İpucu işlevi kullanılarak belirtilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İpucu-örnek kıvrımlarından kaynaklanan görüntüleme artifakının düzeltilmesi. Yüzey Rekonstrüksiyonugerçekleştirerek, elde edilen AFM verileri uç yapıları için düzeltilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Substrattaki bir eğim için düzeltme. Düzlem Düzeyi substrat düzlemini belirler ve AFM verilerinden çıkarır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tbmkör satırlarında yanlış hizalamaların düzeltilmesi. Tarama verilerini hizalamak için geleneksel bir algoritma, her tbmm satırı boyunca ortalama bir yükseklik bulmak ve sonucu görüntüdeki ilgili veri noktaları satırından çıkarmaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hizalanmış verilerdeki boşluklar için düzeltme. Yara izi olarak bilinen yaygın tarama hataları, Scars'ı Kaldır işlevini uygulayarak AFM verilerinden kaldırılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Bir substratın sıfır yükseklikte hizalanması. Level menüsündeki Taban Düzle seçeneği, kullanıcının substrat yüzeyini sıfır yüksekliğe karşılık gelen taban seviyesine yerleştirmesini sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Taranmış yüzeyde immobilize veziküllerin tanımlanması. (A) Yüzeyimimsiz ekzozomlar, Eşik tarafından İşaretle'de belirtilen kullanıcı tarafından seçilmiş yükseklik eşiği yle substrat Üzerinde çıkıntılı taneler olarak tanımlanır. (B) Tanımlamanın sonucu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: AFM verilerinin analizi. Tanımlanan ekzozomların işgal ettiği alan içindeki substrat üzerindeki maksimum yüksekliklerin dağılımı Grain Distributions aracı tarafından derlenmiş olarak gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Immobilize veziküllerin yüzey yoğunluğunun yüzey modifikasyonu ve EV konsantrasyonunun etkisi. (A) McF-7 ekzozom numunesi ile 12 saat kuluçka dan sonra taze yarık mika substrat AFM yüksekliği görüntü DI su ile temizlik ve kurutma takip. EVs'nin sıvıdan substrata immobilizasyonu mika yüzeyine pozitif bir yük bilmeden verimsizdir. Taramada görülen birkaç partikül, substrat kurutulmadan önce MCF-7 örneğinin eksik çıkarılmasısonucu ortaya çıkar. (B) Nikel klorür ile tedavi den sonra mika yüzeyinin havadaki yüksekliği, kontaminasyoniçermeyen substratı gösterir. Paneller(C) ve (D)yüzey yükünün değiştirilmesinden sonra elde edilen AFM yükseklik taramalarını ve aynı MCF-7 numunesi ile inkübasyon(A)ile sırasıyla 24 saat ve 12 saat boyunca gösterir. Hareketsiz veziküllerin yüzey konsantrasyonu 24 saat kuluçkadan sonra aşırı yoğundur. 12 saat kuluçka yüzeyde hareketsiz daha az ekzozomve doğru analiz edilmesi daha kolay olan tsam verilerine yol açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Modifiye mika yüzeyinde elektrostatik olarak hareketsiz hale getirilen sulu MCF-7 ekzozomlarının AFM görüntüleri. (A) Yükseklik görüntüsü. (B) İlgili AFM faz görüntüsü, yükseklik görüntüsündeki taneciklerin membran vezikülleri için beklendiği gibi yumuşak nano tanecikler olduğunu doğrular. (C) Panelde gösterilen çizgi(A)ile kesilen üç vezikülün yükseklik verileri, ekzozomların modifiye mikanın pozitif yüklü yüzeyine elektrostatik çekiminden kaynaklanan düzleştirilmiş bir şekli göstermektedir. (D) Şekil bozulması genişlemiş bir görünümde panel(A)ve kesiti kutulu immobilize vezikül belirgindir. Aynı vezikülfaz görüntüsü(E)gösterilir. Bu şekil referans3'ten değiştirilir ve izinle yeniden yazdırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: Yüzeyde hareketsiz hale getirilen sulu veziküllerin boyutsal karakterizasyonu ve çözeltideki küresel büyüklüklerinin tahmini. (A) Yüzey üzerindeki tepe yüksekliklerinin dağılımı (kırmızı eğri) ortalama 7,9 nm'ye eşittir. Hareketsiz ekzozomların işgal ettiği alan 69,6 nm ortalama çapa (mavi eğri) sahiptir. (B) Hareketsiz ekzozomlardan biri için AFM yükseklik görüntüsü, elektrostatik kuvvetlerin neden olduğu son derece oblate şeklini göstermektedir. Çözeltideki ekzozomal veziküllerin küresel boyutu, yüzeyimmobilize ve küresel membran zarfları ile kaplanmış hacimlerin eşleştirilmesi yle tahmin edilebilir. (C) Çözeltideki globüler veziküllerin boyut dağılımı (kırmızı eğri) 561 immobilize veziküllerin AFM verilerinden saptandı. Kriyo-TEM görüntülerindeki vezikül boyutları (mavi eğri) AFM sonuçlarıyla uyumludur. Bu şekil referans3'ten değiştirilir ve izinle yeniden yazdırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 13: EVs'nin buharlaşan sıvıdan pasif olarak birikintisi sırasında yüzey konsantrasyonu ve boyut ayrımı eserleri. (A) Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüsü, kurutma sıvısından pasif olarak biriken ekzozomların yüzey konsantrasyonunun, askıya alınan biyosıvıdan yüzey immobilizasyonu yapılmadığında mekansal olarak değişken olduğunu göstermektedir. (B) Kurutma örneğinden EVs pasif birikimi vezikülboyutu ayrımına neden olur. Önemli boyut değişkenliği, görüntüdekifarklıbölgelerdeki veziküller için (pdf) beyaz çapraz çizgilerle tanımlanan olasılık yoğunluğu fonksiyonları (pdf) ile ölçülür. Bu şekil başvuru1'den değiştirilir ve izinle yeniden yazdırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 14: Sıvı buharlaşma sırasında pasif olarak yüzeye biriken kurutulmuş veziküllerin fincan şeklindeki geometrisi. Elektrostatik kuvvetler tarafından hareketsiz hale getirilemeyen veziküllerin yüzey deziküllerinin, evs'in SEM görüntülerinde sıklıkla fincan şeklinde bir görünüme yol açtığı bilinmektedir. Bu şekil başvuru1'den değiştirilir ve izinle yeniden yazdırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EVs'nin biyolojik bir sıvıdan immobilizasyonu, yüzey taraması ve görüntü analizi, sıvı daki EV'lerin AFM karakterizasyonu için geliştirilen protokolün temel adımlarıdır. Görüntülenmiş yüzey alanı ve substrat üzerinde immobilize veziküllerin yüzey konsantrasyonu ile AFM görüntüleme ölçekler için uygun veziküllerin sayısı. EVs ve ekzozomlar18negatif zeta potansiyeli göz önüne alındığında, biz AFM substrat sıvı numunelerden EVs elektrostatik fiksasyon savunucusu. Immobilizasyon, yüzey pozitif yüklü olduğunda etkilidir. EV immobilizasyonundan önce, pozitif yüzey yükünün substrata aktarılması gerekebilir, mika durumunda olduğu gibi ― Genel formülü KAl2olan katmanlı bir silikat minerali (AlSi3O10)(OH)2. Taze olarak yarılmış mika'nın yüzeyi mükemmel düze yakındır, bu da AFM tarafından nano partikülleri görüntülemeiçin idealdir, ancak yüzey yükü negatiftir ve bu nedenle modifiye edilmelidir. Protokol, AFM alt katmanına pozitif bir yüzey değişikliği verme yordamını açıklar. Temsili sonuçlar, bir biyoakışkandan modifiye mika substratına EV fiksasyonunda belirgin bir iyileşme olduğunu göstermektedir.
Sulu vezikülleri görüntülerken, yüzey birikimine ve konvektif akımlara neden olan numune buharlaşmasını en aza indirmek ve veziküllerin sıvı konsantrasyonunu zamanla arttırarak daha yüksek yüzey konsantrasyonuna yol özellikle uzun süreli kuluçka dönemlerinde, beklenenden daha fazla hareketsiz evs. Sıvı numuneler için açıkça tasarlanmış sonda tutucular buharlaşmayı ortadan kaldırır veya yavaşlar ve sulu EV'lerin görüntülenmesinde kullanılmalıdır. Tarama sondasına nonspesifik bağlanmalar iyonik türlerin varlığında azalır. Bu nedenle, nemlendirici EVs görüntüleme, di su yerine PBS gibi tamponlu bir ortam ile substrat kapsayacak şekilde tercih edilir.
Yüzey immobilizasyonunun önemi
Modifiye alt tabakadaki EV'lerin tutarlı ve öngörülebilir immobilizasyonu, AFM sonuçlarında birincil değişkenlik kaynağını ortadan kaldırır. Taramadan veri analizine kadar tüm alt akış adımları, enstrümantasyon, sondalar, tarama parametreleri ve veri analizi sırası ve algoritmalarının seçimi yle daha kolay kontrol edilir. Kullanıcı, biyolojik numuneler ve EV izolasyon protokollerinde, bu çalışmanın kapsamı dışında önemli konular olan yukarı değişkenlik farkında olmalıdır.
Biz amaç havadaki kurutulmuş vezikülleri karakterize etmek olsa bile sıvı numunelerden değiştirilmiş mika yüzeyinde EV yüzey immobilizasyon gerçekleştirmenizi öneririz - veziküller kaçınılmaz olarak herhangi bir substrat üzerinde birikecek bu yana ihtiyaç daha az belirgindir sıvı buharlaşır. Aslında, bir sıvı DAN EVs elektrostatik immobilizasyon için ön koşul bir adımdır mika yüzey yükleri değiştirmeden elde edilen kurutulmuş EV için AFM sonuçları, son19,20,21 bildirilmiştir . EVs sıvı örnekten yüzeye sabit değil, ancak, buharlaşma ile pasif birikimi topluca bir kahve halkası etkisi22olarak bilinen eserler üretecektir. Bir kurutma sıvı recedes olarak meydana gelen bu tür iki eserler, negatif yüklü cam yüzeyinde buharlaşma ile biriken serum ekzozomların SEM görüntü(Şekil 13A)gösterilmiştir. Çökelmiş veziküllerin yüzey konsantrasyonunda önemli farklılıklar hemen görülmektedir. Şekil 13B'deölçülen ikinci eser, kurutulmuş numunenin çevresi içinde farklı alanlarda vezikül boyutlarında önemli bir değişkenliktir. Bu yapılar göz önüne alındığında, kuruyan bir sıvıdan pasif olarak biriken veziküllerin AFM karakterizasyonu, şu anda kurutulmuş bir sıvı numunesi tarafından işgal edilen tüm yüzey alanı taranmadığı sürece önyargılı veya tutarsız sonuçlar alabilirsiniz.
Substratüzerinde veziküllerin sıkı bir şekilde immobilizasyonu olmadan elde edilen kurutulmuş numunelerin görüntülenmesinde iki ek husus göz önünde bulundurulmalıdır. Protokolümüzün kullanıcılara veziküller sıvı numuneden hareketsiz hale geldikten sonra yüzeyi DI suyuyla iyice yıkamalarını emrettiğini hatırlayın. Bu adım, önemli ozolaritite ile kompleks biyosıvıların buharlaşması sırasında iyonik ve diğer vesiküler olmayan solutelerin yüzey tortuları oluşturmasını önlemeyi amaçlamaktadır. EVs sabit değilse, kapsamlı yıkama yüzeyden veziküller çok sayıda ayırmak, potansiyel sonuçları önyargı ve analiz için çok az parçacık bırakarak. AFM görüntülemeden önce modifiye mika yüzeyinde ki EV'leri hareketsiz hale getirerek azaltılatan bir diğer yaygın zorluk da, parçacıkların sonda23'e yapışması ve bu fenomenin neden olduğu yanıltıcı eserlerdir.
Hareketsiz EV'lerin yüzey yoğunluğunun kontrolü
Protokolde tanımlanan iki kolay kontrol edilebilir faktör, kullanıcının modifiye mika substratı üzerindeki immobilize EVs'lerin yüzey konsantrasyonuna özellemesine olanak sağlar: sıvı numunedeki veziküllerin konsantrasyonu ve numunenin kuluçkaya yatırılmak üzere substrat. Hareketsiz veziküllerin yüksek yoğunluklu, daha uzun kuluçka süreleri ve sıvı da EVs daha yüksek konsantrasyon ile elde, tarama sırasında analiz veziküllerin sayısını artırır ve sonuçları AFM analizi ile geldi istatistiksel gücü Veri. Aynı zamanda, şekil 10C'de gösterildiği gibi, parçacıkların substratın müdahale alanları olmadan tüm yüzeyi sıkıca kapladığı aşırı yoğun bir yüzey konsantrasyonu, görüntü analizini ve sonuçların yorumlanmasını karmaşık hale getirerek ve yakın aralıklı parçacıklar arasındaki etkileşimin neden olduğu eserler tarama yol açabilir.
EVs elektrostatik tarama ve hidrodinamik hareketlilik etkisi
Hareketsiz EVs'in yüzey konsantrasyonu üzerindeki saydam kontrol, kullanıcının bir çalışmanın özel gereksinimlerini karşılamak için deneysel koşulları özelleştirmesine olanak tanıyan faktörlerin bir fonksiyonu olarak kullanılır. Özelleştirme yaparken, elektrostatik yüzey immobilizasyonubiyosıvıiyonik gücü nden etkilenen bir taşıma sınırlı süreç olduğunu kabul etmek önemlidir.
Iyonik ve pozitif yüklü türlerin konsantrasyonu, yüzey ve vezikül yüklerinin tarandığı Debye uzunluğunu ters yönde etkiler. Bu uzunluğun ötesinde, elektrostatik kuvvetler ihmal edilebilir. Substrat'ın elektrostatik çekim sınır tabakası di su daha iyonik zengin PBS çok daha küçük olacaktır. Bu fark, elektrostatik konumlar hissedilir sıvı tabakası tüketmek için gerekli zamana karşılık gelen kısa bir kuluçka sonra, DI su süspansiyon immobilize EVs bir yüzey yoğunluğu PBS daha yüksek olacağını ima her iki sıvıda da EVs konsantrasyonunun aynı olduğunu varsayarsak süspansiyon. Farklı koymak, daha fazla veziküller aksi takdirde aynı koşullar altında PBS daha DI suda daha kalın bir çekim tabakası tüketmek için immobilize edilmelidir.
Veziküller sınır tabakasından tükendikten sonra, immobilizasyon tamamen taşıma sınırlı bir süreç haline gelir. Bu rejimde, viskozite aynı olduğu ve taşıma tamamen dağınık olduğu sürece, biriktirme oranı askıya alma ortamına (örneğin, DI su veya PBS) bağlı olmayacaktır. Ancak, veziküllerin çekim sınır tabakasına taşınması tamamen dağınık olmayabilir. Örneğin, AFM substratı üzerindeki bir sessile damladaki numune kuluçka sırasında kısmen buharlaşırsa, damlanın içindeki sıvı buharlaşmaya dayalı akışa maruz kalır ve veziküllerin substrata doğru taşınması her ikisinde de, diffusive ve konvektif katkıları. Buharlaşma yeterince kontrol edilmezse, konvektif bir taşımanın katkısı önemli olacaktır ve immobilizasyon oranı beklenenden daha yüksek olacaktır. Konvektif taşımanın etkisi, sıvının iyonik içeriğine bağlı olan çekim tabakasının kalınlığı ile değişecektir. Ayrıca, buharlaşma çözelti içinde EVs konsantre tarafından substrat üzerinde vezikül immobilizasyon artıracaktır. Daha yüksek EV konsantrasyonlarında, çekim katmanı ve bitişik sıvı arasındaki konsantrasyon gradyanı artacak veziküllerin substrata doğru geçişine daha büyük bir termodinamik itici güç oluşturacaktır.
Immobilize veziküller bir önyargı ile sıvı bir örnek temsil edebilir. Immobilizasyon oranının difüzyon la sınırlı olduğu hallerde, vezikül boyutu ve onu çevreleyen koronal tabakanın kalınlığının birleşimi ile belirlenendaha küçük hidrodinamik boyutlarda ki veziküller yüksek hareketlilik nedeniyle cazibe katmanı. Sonuç olarak, ilk tükenme döneminden sonra, hidrodinamik olarak küçük EV'ler sıvı numunedeki EV popülasyonuna katkılarıyla karşılaştırıldığında alt tabakada aşırı temsil edilecektir. Daha küçük bir hidrodinamik boyutu otomatik olarak koronaltabaka3 kalınlığında heterojenlik nedeniyle küçük vezikül boyutları ile EVs işaret etmez unutmayın. Önyargılı temsil, substrat üzerindeki immobilizasyonu ile sıvıdaki TÜM EVs popülasyonunu tüketen uzun kuluçkalarla önlenir. Bir kullanıcı biyosıvı dan tüm EVs immobilize etmeyi amaçladığında, immobilize veziküller ile yüzeyin aşırı yoğun kapsama önlemek için, protokolde önerilen aralığın altında sıvı EV konsantrasyonu azaltmak için gerekli olabilir.
Substrat üzerinde EVs deformasyonu
Onların yerli sulu durumda ve desiccation sonra ekstrasellüler veziküller AFM ile karakterize edilebilir, protokolde açıklandığı gibi. Mika yüzeyindeki EVs'leri hareketsiz hale getiren elektrostatik kuvvetler24, çözeltide var oldukları küresel geometriden de şekillerini bozarlar. İmmobilize eV'lerin boyutu ve morfolojisi üzerindeki desiccation etkisi önce ve sonra örnek kuruizin aynı yüzey alanı yeniden taranarak analiz edilebilir.
Örnek hazırlamanın kurutulmuş EVs'lerin şekli üzerindeki etkisini incelemek öğreticidir. Elektrostatik olarak hareketsiz hale getirilen EV'ler kuruduktan sonra son derece oblate geometriyi korurlar ancak kurutulma ile daha da düzleştirilirler. Kurutulmuş veziküllerin yüzeyüzerindeki yükseklik Şekil 12A'dakindendaha küçük olur , ayak izi alanı artarken (veriler gösterilmez). Öte yandan, veziküller sıvı buharlaşma sırasında pasif olarak biriktive yüzeyde önceden hareketsiz hale getirildiğinde, uzun sem görüntülerinde ve daha yakın zamanda AFM'de gözlendiği gibi, kurutma üzerine bir fincan şeklinde geometri elde etme eğilimindedirler. Tarar. Bu kaplanmış şekil şimdi bir örnek hazırlama artifakı olarak kabul edilmektedir25 yüzey desiccation sırasında kılcal kuvvetlerde non-tekdüzelik neden, mekanistik Şekil 141açıklandığı gibi .
AFM verilerinin görüntü analizi ve yorumlanması
EVs şeklini bozacak şekilde hareket eden elektrostatik ve kılcal kuvvetlere verilen tepkiler, EV'lerin yapısal ve bileşimsel özellikleri hakkında değerli bilgiler sağlar. Örneğin, AFM verilerinden çıkarılan deforme edilmiş boyut ve şekil gibi çok boyutlu bir biyofiziksel özellik kümesi, son zamanlarda farklı konak hücreleri tarafından salgılanan ekzozomları ayırt etmek için fizibilite göstermek için kullanılmıştır5. Distorsiyonlar da dikkate alınabilir ve telafi edilebilir. Örneğin, immobilize exososmes3ile aynı hacmi kapsülleyen kürelerin çaplarını tahmin ederek çözeltideki veziküllerin küresel boyutunu karakterize etmek için AFM verilerinin nasıl kullanılacağını gösterdik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Ulusal Bilim Vakfı (ödül numarası IGERT-0903715), Utah Üniversitesi (Kimya Mühendisliği Tohum Hibe ve Lisansüstü Araştırma Bursu Ödülü Bölümü) ve Skolkovo Bilim Enstitüsü mali destek kabul ve Teknoloji (Skoltech Bursu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
